Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma İn Vitro

Bu deneyin genel amacı, in vitro trombosit transfüzyonunu taklit etmek ve hidrodinamik akış ve gerçek zamanlı mikroskopi ile kollajen üzerinde hemostaz kullanarak test etmektir. Trombositopenili hastalar depolanmış trombosit konsantreleri ile tedavi edilir. Yöntemimiz, tromboz ve hemostaz alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmayı ve bu tür depolanmış trombosit konsantrelerinin kalitesi ve işlevine özel bir vurgu yapmayı amaçlamaktadır.

Bu tekniğin katma değeri, kan akışını taklit etmesi ve böylece katılan hücreler ve biyomoleküller üzerindeki reoloji etkilerini hesaba katmasıdır. Mevcut yöntem, trombositin kollajene bağlanmasını değerlendirir. Bununla birlikte, aterosklerotik plak, endotel hücreleri veya Von Willebrand faktörü ve fibrinojen gibi spesifik matris proteinleri dahil olmak üzere diğer yapışkan dokulara da uygulanabilir.

Biyoçipi hazırlamakla başlayın. Üreticinin izotonik glikoz çözeltisinde bir ila 20 arasında bir kollajen stoğunu girdaplayın ve mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Ardından, yeni bir tek kullanımlık biyoçipin şeritlerine 0,8 mikrolitre pipetleyin.

Çipin bir ucundaki tüm şeritleri doldurun ve bunu çıkış ucu olarak işaretleyin. Ardından, her şeridin 5/6'sının solüsyonla doldurulduğundan ve hava kabarcığı olmadığından emin olmak için çipi inceleyin. Ardından, çipi dört santigrat derecede dört saat veya gece boyunca nemlendirilmiş ve kapalı bir kapta inkübe edin.

Daha sonra, şeritlerin diğer ucuna blokaj tamponu pipetleyerek kodlanmış kanalları bloke edin. Daha sonra her şerit için 12 santimetre uzunluğunda boru kesin ve biyoçipe takılabilir hale getirmek için her bir boru uzunluğuna bir pim takın. Tüp uzunluklarını bir şırınga ve bir konektörden damıtılmış su ile durulayın.

Daha sonra, onları bloke edici tampon ile doyurun ve en az bir saat boyunca nemlendirilmiş bir kaba kapatın. Ardından, pompayı ve manifoldu hazırlayın. İlk olarak, hava kabarcıklarını gidermek için pompayı ve manifoldu damıtılmış suyla durulayın.

Ardından, biyoçipi otomatik mikroskop aşamasına takın. Uzunlukların bir ucunu HBS ile doldurulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun, ardından diğer ucunu biyoçip girişlerine takın. Manifold pimlerini biyoçipin çıkışlarına yerleştirin.

Ardından, pompayı kullanarak sistemi HBS ile durulayın. Kalan herhangi bir bloke edici tampon veya zayıf yapışmış kollajen böylece uzaklaştırılacaktır. Bu, akış odası hazırlıklarını tamamlar.

Sağlıklı gönüllülerden alınan son kan koleksiyonlarını konik bir santrifüj tüpünde toplayarak başlayın. Numuneyi 250'de yaklaşık 15 dakika döndürün Gs.Do freni kullanmayın, çünkü gevşek bir şekilde paketlenmiş alt fazı bozacaktır. Trombositten zengin plazmayı ve buffy kaplamayı çıkarın ve atın.

Sulandırılmış kanı yapmak için mümkün olduğunca az trombosit içeren paketlenmiş kırmızı kan hücrelerini saklayın. Şimdi, dört mililitre AB tipi plazmayı 37 santigrat derecede beş dakika 20 saniye boyunca çözmeye başlayın. Bu arada, otomatik bir hematoloji analizörü kullanarak hazırlanan paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin hematokritini belirleyin.

Daha sonra, tam kanın sulandırılması için kullanılmak üzere hazırlanan bir kan bankası trombosit konsantresinin trombosit konsantrasyonunu belirleyin. % 40 hematokrit ve mikrolitre başına 250.000 trombosit ile bir mililitre sulandırılmış kan için gerekli hacimleri hesaplayın. Şimdi, kırpılmış bir pipet ucu kullanarak, gerekli hacimdeki kırmızı kan hücrelerini, plazmayı ve trombosit konsantresini istenen konsantrasyona ve bir mililitrelik son hacme aktarın.

Sulandırılmış kanı hafif inversiyonlarla karıştırın ve tam kan sayımı yapın. Daha sonra, Calcein içeren hazırlanmış bir mikrosantrifüj tüpü alın ve buna bir mililitre sulandırılmış kan ekleyin. Nazik inversiyonlar kullanarak kanı boya ile karıştırın.

Ardından, sulandırılmış kanı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Yazılımda, perfüzyon şeridinde ilgilendiğiniz bölgeyi seçin. 100x büyütmede şeritlerin altına yapıştırılan kollajen liflerine odaklanın.

İdeal olarak, faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrastı kullanın. Seçilen Z konumlarını dijital olarak sabitlemek için seçili döşeme bölgeleri için geçerli Z'yi ayarla seçeneğini belirleyin. Perfüzyondan önceki optik odak ameloblast kollajen üzerinde olmalıdır, ancak bu zor olabilir.

Bir alternatif, mikroskop odağını ilk yapışan trombositlere ayarlamaktır. Şimdi, numuneleri nazikçe karıştırın ve biyoçipin yanına yerleştirin. Ardından, gözlemlenen şeride bağlı boruyu sulandırılmış kanın içine koyun.

Ardından, pompayı kontrol eden yazılımı kullanarak, kan örneğini şeride taşımak için santimetre kare başına 50 dyne basınç uygulayın ve deneyi başlatın. Deney sırasında, görüntüleri beş dakika boyunca her 15 saniyede bir kaydedin. Görüntü analiz yazılımını kullanarak trombüs büyüme kinetiğini belirleyin.

Bu durumda Zen 2012 kullanılır. Trombositlerin yüzey kaplamasını belirlemek için eklenti görüntü analizini açarak başlayın. Yapışan trombositlerden gelecek pozitif bir sinyalle ilişkili piksel yoğunluğunu tanımlamak için etkileşimli analiz sekmesinde floresan eşiğini ayarlayın.

Ardından, her zaman noktası için pozitif sinyallerin yüzey alanlarının bir listesini içeren bir elektronik tabloyu otomatik olarak oluşturmak için tablolar oluşturmayı kullanın. Bu elektronik tabloları XML biçiminde kaydedin ve daha fazla hesaplama için bir elektronik tablo programında açın. Her zaman noktasında, seçilen nesnelerin toplam yüzey alanlarını hesaplayın ve bu değeri kaplanan yüzey yüzdesi olarak ifade edin.

Ardından, verileri perfüzyon süresinin bir fonksiyonu olarak çizin ve eğimi doğrusal regresyon ile hesaplayın. Bu, söz konusu deneysel durumun trombüs büyüme kinetiğini modeller. Üç özdeş sulandırılmış tam kan örneği, kollajen kaplı yüzeyler üzerinde aynı anda perfüze edildi.

Bu, %8.7'lik bir varyasyon katsayısı ile sonuçlandı ve test karşılaştırması için kabul edilebilir test içi ve laboratuvar içi varyasyon olduğunu düşündürdü. Transfüzyon, eksik bileşenle kanın yeniden yapılandırılmasıyla simüle edildi. Azalan trombosit konsantrasyonları ile çeşitli sulandırmalar yapıldı.

Beklendiği gibi, daha düşük trombosit sayıları, perfüzyon süresinin bir fonksiyonu olarak daha az yapışma ile sonuçlandı. Daha sonra, kan alımından sonra ve perfüzyon sırasında azalan sıcaklıkların etkisi araştırıldı. Kan oda sıcaklığına soğutulduğunda trombüslerin daha yavaş oluştuğu bulundu.

Çalışma boyunca 37 santigrat derecede tutulan bir örnekle karşılaştırıldığında. Dolaşım sırasında, trombositler yüksek duvar stresi koşullarında damar yaralanma bölgelerine bağlanır. Beklendiği gibi, mikroakışkan akış odalarındaki saf hızın değiştirilmesi, toplam trombosit yapışmasını değiştirdi.

Bu koşullar aynı zamanda trombüs büyüme kinetiğini de değiştirir. Bu videoyu izledikten sonra, depolanan trombosit konsantrelerinin kalitesini ve işlevini test etmek için sulandırılmış kan kullanarak mikroakışkan akış odası deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır. Bu teknik yaklaşık yedi saat içinde yapılabilir.

Mikroakışkan akış odası deneyleri, trombosit transfüzyonu alanındaki araştırmacıların bağış, hazırlama ve depolama değişkenlerinin etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. İlgili bir örnek, patojen inaktivasyonudur. Biz sadece bir deney konusunun örneğini verdik.

Bununla birlikte, kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler, saf stres ve yüzey kaplamaları, farklı araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir. Bu prosedüre benzer şekilde, ek soruları yanıtlamak için mikroakışkan akış odalarındaki diğer ölçümler de yapılabilir. Örneğin, depolanan trombositlerin akışta pıhtılaşma performansı.