Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma İn Vitro
March 19th, 2016
Trombosit transfüzyonu ve hemostazı, kan bankacılığı trombositlerinin işlevini araştırmak için kan sulandırma ve mikroakışkan akış odaları kullanılarak modellendi. Veriler, trombosit depolama lezyonunun in vitro olarak hemostaz üzerindeki sonuçlarını göstermektedir.
Bu deneyin genel amacı, in vitro trombosit transfüzyonunu taklit etmek ve hidrodinamik akış ve gerçek zamanlı mikroskopi ile kollajen üzerinde hemostaz kullanarak test etmektir. Trombositopenili hastalar depolanmış trombosit konsantreleri ile tedavi edilir. Yöntemimiz, tromboz ve hemostaz alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmayı ve bu tür depolanmış trombosit konsantrelerinin kalitesi ve işlevine özel bir vurgu yapmayı amaçlamaktadır.
Bu tekniğin katma değeri, kan akışını taklit etmesi ve böylece katılan hücreler ve biyomoleküller üzerindeki reoloji etkilerini hesaba katmasıdır. Mevcut yöntem, trombositin kollajene bağlanmasını değerlendirir. Bununla birlikte, aterosklerotik plak, endotel hücreleri veya Von Willebrand faktörü ve fibrinojen gibi spesifik matris proteinleri dahil olmak üzere diğer yapışkan dokulara da uygulanabilir.
Biyoçipi hazırlamakla başlayın. Üreticinin izotonik glikoz çözeltisinde bir ila 20 arasında bir kollajen stoğunu girdaplayın ve mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Ardından, yeni bir tek kullanımlık biyoçipin şeritlerine 0,8 mikrolitre pipetleyin.
Çipin bir ucundaki tüm şeritleri doldurun ve bunu çıkış ucu olarak işaretleyin. Ardından, her şeridin 5/6'sının solüsyonla doldurulduğundan ve hava kabarcığı olmadığından emin olmak için çipi inceleyin. Ardından, çipi dört santigrat derecede dört saat veya gece boyunca nemlendirilmiş ve kapalı bir kapta inkübe edin.
Daha sonra, şeritlerin diğer ucuna blokaj tamponu pipetleyerek kodlanmış kanalları bloke edin. Daha sonra her şerit için 12 santimetre uzunluğunda boru kesin ve biyoçipe takılabilir hale getirmek için her bir boru uzunluğuna bir pim takın. Tüp uzunluklarını bir şırınga ve bir konektörden damıtılmış su ile durulayın.
Daha sonra, onları bloke edici tampon ile doyurun ve en az bir saat boyunca nemlendirilmiş bir kaba kapatın. Ardından, pompayı ve manifoldu hazırlayın. İlk olarak, hava kabarcıklarını gidermek için pompayı ve manifoldu damıtılmış suyla durulayın.
Ardından, biyoçipi otomatik mikroskop aşamasına takın. Uzunlukların bir ucunu HBS ile doldurulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun, ardından diğer ucunu biyoçip girişlerine takın. Manifold pimlerini biyoçipin çıkışlarına yerleştirin.
Ardından, pompayı kullanarak sistemi HBS ile durulayın. Kalan herhangi bir bloke edici tampon veya zayıf yapışmış kollajen böylece uzaklaştırılacaktır. Bu, akış odası hazırlıklarını tamamlar.
Sağlıklı gönüllülerden alınan son kan koleksiyonlarını konik bir santrifüj tüpünde toplayarak başlayın. Numuneyi 250'de yaklaşık 15 dakika döndürün Gs.Do freni kullanmayın, çünkü gevşek bir şekilde paketlenmiş alt fazı bozacaktır. Trombositten zengin plazmayı ve buffy kaplamayı çıkarın ve atın.
Sulandırılmış kanı yapmak için mümkün olduğunca az trombosit içeren paketlenmiş kırmızı kan hücrelerini saklayın. Şimdi, dört mililitre AB tipi plazmayı 37 santigrat derecede beş dakika 20 saniye boyunca çözmeye başlayın. Bu arada, otomatik bir hematoloji analizörü kullanarak hazırlanan paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin hematokritini belirleyin.
Daha sonra, tam kanın sulandırılması için kullanılmak üzere hazırlanan bir kan bankası trombosit konsantresinin trombosit konsantrasyonunu belirleyin. % 40 hematokrit ve mikrolitre başına 250.000 trombosit ile bir mililitre sulandırılmış kan için gerekli hacimleri hesaplayın. Şimdi, kırpılmış bir pipet ucu kullanarak, gerekli hacimdeki kırmızı kan hücrelerini, plazmayı ve trombosit konsantresini istenen konsantrasyona ve bir mililitrelik son hacme aktarın.
Sulandırılmış kanı hafif inversiyonlarla karıştırın ve tam kan sayımı yapın. Daha sonra, Calcein içeren hazırlanmış bir mikrosantrifüj tüpü alın ve buna bir mililitre sulandırılmış kan ekleyin. Nazik inversiyonlar kullanarak kanı boya ile karıştırın.
Ardından, sulandırılmış kanı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Yazılımda, perfüzyon şeridinde ilgilendiğiniz bölgeyi seçin. 100x büyütmede şeritlerin altına yapıştırılan kollajen liflerine odaklanın.
İdeal olarak, faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrastı kullanın. Seçilen Z konumlarını dijital olarak sabitlemek için seçili döşeme bölgeleri için geçerli Z'yi ayarla seçeneğini belirleyin. Perfüzyondan önceki optik odak ameloblast kollajen üzerinde olmalıdır, ancak bu zor olabilir.
Bir alternatif, mikroskop odağını ilk yapışan trombositlere ayarlamaktır. Şimdi, numuneleri nazikçe karıştırın ve biyoçipin yanına yerleştirin. Ardından, gözlemlenen şeride bağlı boruyu sulandırılmış kanın içine koyun.
Ardından, pompayı kontrol eden yazılımı kullanarak, kan örneğini şeride taşımak için santimetre kare başına 50 dyne basınç uygulayın ve deneyi başlatın. Deney sırasında, görüntüleri beş dakika boyunca her 15 saniyede bir kaydedin. Görüntü analiz yazılımını kullanarak trombüs büyüme kinetiğini belirleyin.
Bu durumda Zen 2012 kullanılır. Trombositlerin yüzey kaplamasını belirlemek için eklenti görüntü analizini açarak başlayın. Yapışan trombositlerden gelecek pozitif bir sinyalle ilişkili piksel yoğunluğunu tanımlamak için etkileşimli analiz sekmesinde floresan eşiğini ayarlayın.
Ardından, her zaman noktası için pozitif sinyallerin yüzey alanlarının bir listesini içeren bir elektronik tabloyu otomatik olarak oluşturmak için tablolar oluşturmayı kullanın. Bu elektronik tabloları XML biçiminde kaydedin ve daha fazla hesaplama için bir elektronik tablo programında açın. Her zaman noktasında, seçilen nesnelerin toplam yüzey alanlarını hesaplayın ve bu değeri kaplanan yüzey yüzdesi olarak ifade edin.
Ardından, verileri perfüzyon süresinin bir fonksiyonu olarak çizin ve eğimi doğrusal regresyon ile hesaplayın. Bu, söz konusu deneysel durumun trombüs büyüme kinetiğini modeller. Üç özdeş sulandırılmış tam kan örneği, kollajen kaplı yüzeyler üzerinde aynı anda perfüze edildi.
Bu, %8.7'lik bir varyasyon katsayısı ile sonuçlandı ve test karşılaştırması için kabul edilebilir test içi ve laboratuvar içi varyasyon olduğunu düşündürdü. Transfüzyon, eksik bileşenle kanın yeniden yapılandırılmasıyla simüle edildi. Azalan trombosit konsantrasyonları ile çeşitli sulandırmalar yapıldı.
Beklendiği gibi, daha düşük trombosit sayıları, perfüzyon süresinin bir fonksiyonu olarak daha az yapışma ile sonuçlandı. Daha sonra, kan alımından sonra ve perfüzyon sırasında azalan sıcaklıkların etkisi araştırıldı. Kan oda sıcaklığına soğutulduğunda trombüslerin daha yavaş oluştuğu bulundu.
Çalışma boyunca 37 santigrat derecede tutulan bir örnekle karşılaştırıldığında. Dolaşım sırasında, trombositler yüksek duvar stresi koşullarında damar yaralanma bölgelerine bağlanır. Beklendiği gibi, mikroakışkan akış odalarındaki saf hızın değiştirilmesi, toplam trombosit yapışmasını değiştirdi.
Bu koşullar aynı zamanda trombüs büyüme kinetiğini de değiştirir. Bu videoyu izledikten sonra, depolanan trombosit konsantrelerinin kalitesini ve işlevini test etmek için sulandırılmış kan kullanarak mikroakışkan akış odası deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır. Bu teknik yaklaşık yedi saat içinde yapılabilir.
Mikroakışkan akış odası deneyleri, trombosit transfüzyonu alanındaki araştırmacıların bağış, hazırlama ve depolama değişkenlerinin etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. İlgili bir örnek, patojen inaktivasyonudur. Biz sadece bir deney konusunun örneğini verdik.
Bununla birlikte, kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler, saf stres ve yüzey kaplamaları, farklı araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir. Bu prosedüre benzer şekilde, ek soruları yanıtlamak için mikroakışkan akış odalarındaki diğer ölçümler de yapılabilir. Örneğin, depolanan trombositlerin akışta pıhtılaşma performansı.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, trombosit transfüzyonu ve hemostazı kan restorasyonu ve mikroakışkan akış odaları kullanarak araştırmaktadır. Kan restorasyonu ve mikroakışkan akış odaları kullanarak in vitro hemostaz fonksiyonu üzerindeki trombosit depolama lezyonlarının etkisini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hematoloji
- Tromboz
- Hemostaz
Arka Plan
- Trombositopeni hastaları depolanmış trombosit konsantreleri alır.
- Trombosit depolama lezyonları hemostaz fonksiyonunu etkileyebilir.
- Trombosit fonksiyonunu anlamak, transfüzyon sonuçlarını iyileştirmek için kritiktir.
- Mevcut yöntemler, trombositlerin kollajen ve diğer yapışkan dokular ile etkileşimlerini değerlendirir.
Çalışmanın Amacı
- In vitro trombosit transfüzyonunu taklit etmek.
- Hidrodinamik akış altında kollajen üzerinde hemostaz fonksiyonunu değerlendirmek.
- Depolanmış trombosit konsantrelerinin kalitesini ve fonksiyonelliğini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kan restorasyon teknikleri.
- Gerçek zamanlı mikroskop için mikroakışkan akış odaları.
- Trombosit bağlanmasının kollajene değerlendirilmesi.
- Aterosklerotik plak gibi diğer yapışkan dokulara uygulama.
Ana Sonuçlar
- Depolama lezyonlarının trombosit fonksiyonu üzerindeki etkilerini gösterdi.
- Depolanmış trombositlerin hemostaz kabiliyetleri hakkında bilgiler sağladı.
- Trombosit etkileşimlerini değerlendirmede hidrodinamik akışın alaka düzeyini gösterdi.
- Çeşitli yapışkan dokulara potansiyel uygulamaları vurguladı.
Sonuçlar
- Çalışma, trombosit transfüzyonu etkinliğini değerlendirmek için yeni bir yöntem sunmaktadır.
- Bulgular, trombosit depolama ve transfüzyonuna ilişkin klinik uygulamaları bilgilendirebilir.
- Gelecek araştırmaları tromboz ve hemostaz üzerindeki etkilerini genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to evaluate platelet transfusion efficacy under physiologically relevant flow conditions, addressing a critical gap in preclinical assessment of blood product quality. By simulating hemostasis in microfluidic chambers using reconstituted blood, the method provides quantitative, real-time readouts of platelet function that support go/no-go decisions in transfusion medicine development. The approach de-risks translational advancement by linking storage variables to functional outcomes, thereby improving predictive confidence in platelet product performance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding platelet function and storage lesion impact on hemostasis.
- Operational Value: Enables functional target validation of platelet concentrates under controlled shear stress and temperature conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating platelet concentration, storage duration, and temperature cycling with thrombus growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of platelet-modulating compounds or storage interventions.
- Reproducibility: Delivers quantitative surface coverage measurements with low intra-assay variation (8.7% CV), enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports multiplexed testing of three identical reconstituted blood samples simultaneously over collagen-coated surfaces.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thrombocytopenia treatment scenarios using reconstituted blood to mimic clinical platelet transfusion.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by measuring hemostatic function on collagen under hydrodynamic flow.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement decisions by quantifying the impact of blood donation, transport, component separation, storage, and pathogen inactivation on platelet function.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment, enabling continuous evaluation of platelet product quality across the processing chain.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of platelet storage lesions and pathway clarification of hemostasis under flow.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating platelet adhesion and thrombus growth kinetics.
- Analytics: Generates quantitative thrombus growth kinetics via image analysis and linear regression, enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by simulating transfusion and measuring functional outcomes in disease-relevant shear conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for assessing platelet product quality across multiple storage variables and processing steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in platelet function by reducing mechanistic ambiguity in storage lesion effects.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled perfusion, blocking, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking storage duration, temperature, and shear rate to functional platelet outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of platelet processing optimizations based on empirical hemostasis data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, blood reconstitution, and real-time microscopy.
- Dependent on automated microscope stage, pump-manifold system, and biocompatible biochips.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit, platelet concentration, and perfusion pressure settings.
- Involves adaptation considerations for varying shear rates, temperature profiles, and surface coatings (e.g., collagen, VWF, fibrinogen).
- Practical limitations include the need for air bubble-free channel filling and precise Z-focus maintenance during perfusion.
