Mikroorganizmaların düşük konsantrasyonlarda dijital holografik mikroskobu (DHM) kullanarak miktarının

Bu deneyin genel amacı, dijital holografik mikroskopi kullanarak mikroorganizmaların çok düşük seviyelerde tespit edilmesini göstermektir. Bu teknik, geleneksel ışık mikroskobundan daha hassastır ve bakteri davranışları hakkında gerçek zamanlı bilgi sağlar. Bu yöntem, buzlu aylarda güneş sistemimizde su veya yaşamda patojenik organizmaların araştırılması gibi biyolojik ve kozmolojik alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, DHM'nin hacimsel bir teknik olmasıdır, bu da fiziksel olarak yeniden odaklanmaya gerek kalmadan numunemiz üzerinde anında üç boyutlu bilgileri yakalayabileceğimiz anlamına gelir. Bu tekniğin etkileri, düşük bakteri konsantrasyonlarını tespit etme yeteneği nedeniyle kan dolaşımı veya beyin omurilik sıvısı enfeksiyonlarının teşhisine kadar uzanır. Bu prosedüre başlamak için, deney gününde, 0.6 ila 0.7 aralığında olması beklenen bakteri ana kültürünün spektrofotometrik bir okumasını yapın.

Daha sonra ana kültürün bir örneğini alın ve hem canlı hem de ölü hücreleri saymak için bir Petroff-Hausser sayma odası kullanarak hücreleri doğrudan sayın. Seyreltilmemiş kültürün 10 mikrolitrelik bir örneğini bir mikropipet ile hazneye aktarın. Faz kontrastı kullanarak yüksek kuru objektif mikroskobu altında görüntüleyin.

Daha sonra, bakterileri en az 20 karede sayın ve ortalamasını alın. Konsantrasyonu, seyreltme faktörünün 20 karesinin ortalaması olarak hesaplayın. Sadece canlı hücreleri numaralandırmak için, seçilen bakteri numunelerinin her birinin steril% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile seri seyreltmesini yapın, 20 mikrolitre bakteri çözeltisi başka bir kuyucuğa aktarın ve 180 mikrolitre tuzlu su ile seyreltin.

En düşük konsantrasyon mililitre başına yaklaşık 10 ila üç hücre olana kadar işlemi tekrarlayın. Daha sonra, en az iki seyreltmeden 100 mikrolitre numune alın ve bunları uygun katı ortam plakalarına yerleştirin. Bunları steril bir yayıcı ile yayın ve her seyreltmenin en az üç kopyasını gerçekleştirin.

Bundan sonra, gece boyunca veya koloniler büyüyene kadar uygun bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. Sonra kolonileri sayın. Koloni oluşturan birimleri hesaplayın ve kopyaların ortalamasını alın.

Bu prosedürde, DHM için ana kültürün seri seyreltmelerini ve Lizojeni et suyu ortam plakalarında CFU'nun DHM sonrası sayımını yapın. Bakterileri, hareketliliği teşvik edecek, ancak hücre bölünmesini engelleyecek minimum bir ortamın 25 mililitresine seyreltin, böylece hücre konsantrasyonu deney sırasında önemli ölçüde değişmez. Steril bir şırınga kullanarak DHM videolarını kaydetmek için, ilgilenilen seyreltmenin yaklaşık 10 mililitresini çekin.

Ardından şırıngayı steril bağlantı parçaları ve boru kullanarak DHM numune odasına bağlayın. Bir şırınga pompası kullanarak numuneyi şırıngadan sürekli olarak numune haznesinden geçirin. Numune, numune odasından akarken, uygun bir kare hızında art arda hologramlar alın.

10 mililitrelik numunenin tamamının DHM'den akması için yeterli zaman tanıyın. Deneyler sırasında bakterilerin büyümediğinden veya ölmediğinden emin olmak için, zenginleştirilmiş ortam plakalarını, steril bir yayıcı ile yayarak, DHM görüntü yakalama sonrası harcanan ortamdan 100 mikrolitre ile aşılayın. Daha sonra kolonileri saymadan önce 24 saat boyunca uygun sıcaklıkta inkübe edin.

Tespit limitlerini kantitatif olarak belirlemek için doğru hücre sayımlarına sahip olmak çok önemlidir. Tüm seyreltmelerin kalibre edilmiş mikropipetler kullanılarak büyük bir özenle yapılması ve tüm sayımların Petroff-Hausser odasında optik yoğunluk, kaplama ve doğrudan sayım ile doğrulanması önemlidir. Alınan hologram videolarındaki bakteri varlığı verilerini analiz etmek için, önce görüntüleri 32 bit biçime dönüştürerek orta çıkarılmış filtreleme gerçekleştirin.

Ardından medyan piksel değerini hesaplayın. Son olarak, hologramdaki sabit artefaktları ortadan kaldırmak için bu medyan değeri her bir pikselden çıkarın. Bundan sonra, görünür alan halkalarının ve odak içi hücrelerin sayısını manuel olarak sayın.

Her hologram serisine bir zaman damgası dosyası eşlik eder. Görüntünün yakalandığı sırada pompalanan toplam numune miktarını hesaplamak için zaman damgası dosyasını kullanın. Daha sonra, tespit edilen toplam hücre sayısını görüntülenen toplam numune hacmine bölerek hücre yoğunluğunu hesaplayın.

Doğru istatistikler için ortalama beş ila 10 kare. Bu grafik, 365 mikrometre x 365 mikrometre x bir milimetrelik bir örnek hacmine dayalı olarak görüş alanı başına tahmin edilen hücreleri gösterir. Görüş alanı başına hücre sayısının birin altına düştüğü konsantrasyonlar için, algılamayı sağlamak için birden fazla görüntü gereklidir.

Bu, plaka sayısı ile ölçülen mililitre başına 2.100 hücrede bir Serratia marcescens kültürünün bir DHM hologram dizisidir. Dizi, kabaca her bir ila iki saniyede bir hücre gösterir ve bu da tahmine mükemmel bir uyum sağlar. Ve bu, plaka sayısı ile ölçülen, mililitrede 620 hücreye sahip bir Serratia marcescens kültürünün başka bir DHM hologram dizisidir.

Bu dizi, kabaca her altı ila yedi saniyede bir hücre gösterir. Hücreleri görüntülemek için dijital holografik mikroskopi kullanırken, tüm çözeltilerin hazırlanmasında filtre sterilizasyon tekniklerini kullanmayı unutmayın. Bu, cihaza partikül madde girmesini önleyecektir.

Bu prosedürü denerken, sağlıklı hücre kültürleri hazırlamayı ve elinizde ekstra büyüme ortamı, plakalar ve motilite ortamı bulundurmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, canlı ve ölü hücrelerin yüzdesi gibi ek soruları yanıtlamak için floresan boyama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların kültürlenmiş hücrelerde ve çevresel örneklerde üç boyutlu hareketliliği keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, holografik mikroskopi kullanarak bakterilerin nasıl numaralandırılacağını ve diğer sayma tekniklerini kullanarak sonuçları nasıl doğrulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bakteri kültürleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Canlı organizmaları yetiştirirken ve işlerken her zaman uygun biyogüvenlik önlemleri alınmalıdır.