Mikroorganizmaların düşük konsantrasyonlarda dijital holografik mikroskobu (DHM) kullanarak miktarının
1 Kasım 2017
Dijital holografik mikroskobu (DHM) görüntüleme örnekleri 50-100 X daha aydınlık alan mikroskobu karşılaştırılabilir çözünürlükte odaklanarak daha kalın gerçekleştirilen son işlem sağlar hacimsel bir tekniktir. Burada DHM tanımlamak için sayma, kullanılır ve mikroorganizmalar, çok izleme yoğunluğu düşük ve optik yoğunluk ölçümleri, plaka sayısı ve doğrudan sayısı ile karşılaştırıldığında.
Bu deneyin genel amacı, dijital holografik mikroskopi kullanarak mikroorganizmaların çok düşük seviyelerde tespit edilmesini göstermektir. Bu teknik, geleneksel ışık mikroskobundan daha hassastır ve bakteri davranışları hakkında gerçek zamanlı bilgi sağlar. Bu yöntem, buzlu aylarda güneş sistemimizde su veya yaşamda patojenik organizmaların araştırılması gibi biyolojik ve kozmolojik alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, DHM'nin hacimsel bir teknik olmasıdır, bu da fiziksel olarak yeniden odaklanmaya gerek kalmadan numunemiz üzerinde anında üç boyutlu bilgileri yakalayabileceğimiz anlamına gelir. Bu tekniğin etkileri, düşük bakteri konsantrasyonlarını tespit etme yeteneği nedeniyle kan dolaşımı veya beyin omurilik sıvısı enfeksiyonlarının teşhisine kadar uzanır. Bu prosedüre başlamak için, deney gününde, 0.6 ila 0.7 aralığında olması beklenen bakteri ana kültürünün spektrofotometrik bir okumasını yapın.
Daha sonra ana kültürün bir örneğini alın ve hem canlı hem de ölü hücreleri saymak için bir Petroff-Hausser sayma odası kullanarak hücreleri doğrudan sayın. Seyreltilmemiş kültürün 10 mikrolitrelik bir örneğini bir mikropipet ile hazneye aktarın. Faz kontrastı kullanarak yüksek kuru objektif mikroskobu altında görüntüleyin.
Daha sonra, bakterileri en az 20 karede sayın ve ortalamasını alın. Konsantrasyonu, seyreltme faktörünün 20 karesinin ortalaması olarak hesaplayın. Sadece canlı hücreleri numaralandırmak için, seçilen bakteri numunelerinin her birinin steril% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile seri seyreltmesini yapın, 20 mikrolitre bakteri çözeltisi başka bir kuyucuğa aktarın ve 180 mikrolitre tuzlu su ile seyreltin.
En düşük konsantrasyon mililitre başına yaklaşık 10 ila üç hücre olana kadar işlemi tekrarlayın. Daha sonra, en az iki seyreltmeden 100 mikrolitre numune alın ve bunları uygun katı ortam plakalarına yerleştirin. Bunları steril bir yayıcı ile yayın ve her seyreltmenin en az üç kopyasını gerçekleştirin.
Bundan sonra, gece boyunca veya koloniler büyüyene kadar uygun bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. Sonra kolonileri sayın. Koloni oluşturan birimleri hesaplayın ve kopyaların ortalamasını alın.
Bu prosedürde, DHM için ana kültürün seri seyreltmelerini ve Lizojeni et suyu ortam plakalarında CFU'nun DHM sonrası sayımını yapın. Bakterileri, hareketliliği teşvik edecek, ancak hücre bölünmesini engelleyecek minimum bir ortamın 25 mililitresine seyreltin, böylece hücre konsantrasyonu deney sırasında önemli ölçüde değişmez. Steril bir şırınga kullanarak DHM videolarını kaydetmek için, ilgilenilen seyreltmenin yaklaşık 10 mililitresini çekin.
Ardından şırıngayı steril bağlantı parçaları ve boru kullanarak DHM numune odasına bağlayın. Bir şırınga pompası kullanarak numuneyi şırıngadan sürekli olarak numune haznesinden geçirin. Numune, numune odasından akarken, uygun bir kare hızında art arda hologramlar alın.
10 mililitrelik numunenin tamamının DHM'den akması için yeterli zaman tanıyın. Deneyler sırasında bakterilerin büyümediğinden veya ölmediğinden emin olmak için, zenginleştirilmiş ortam plakalarını, steril bir yayıcı ile yayarak, DHM görüntü yakalama sonrası harcanan ortamdan 100 mikrolitre ile aşılayın. Daha sonra kolonileri saymadan önce 24 saat boyunca uygun sıcaklıkta inkübe edin.
Tespit limitlerini kantitatif olarak belirlemek için doğru hücre sayımlarına sahip olmak çok önemlidir. Tüm seyreltmelerin kalibre edilmiş mikropipetler kullanılarak büyük bir özenle yapılması ve tüm sayımların Petroff-Hausser odasında optik yoğunluk, kaplama ve doğrudan sayım ile doğrulanması önemlidir. Alınan hologram videolarındaki bakteri varlığı verilerini analiz etmek için, önce görüntüleri 32 bit biçime dönüştürerek orta çıkarılmış filtreleme gerçekleştirin.
Ardından medyan piksel değerini hesaplayın. Son olarak, hologramdaki sabit artefaktları ortadan kaldırmak için bu medyan değeri her bir pikselden çıkarın. Bundan sonra, görünür alan halkalarının ve odak içi hücrelerin sayısını manuel olarak sayın.
Her hologram serisine bir zaman damgası dosyası eşlik eder. Görüntünün yakalandığı sırada pompalanan toplam numune miktarını hesaplamak için zaman damgası dosyasını kullanın. Daha sonra, tespit edilen toplam hücre sayısını görüntülenen toplam numune hacmine bölerek hücre yoğunluğunu hesaplayın.
Doğru istatistikler için ortalama beş ila 10 kare. Bu grafik, 365 mikrometre x 365 mikrometre x bir milimetrelik bir örnek hacmine dayalı olarak görüş alanı başına tahmin edilen hücreleri gösterir. Görüş alanı başına hücre sayısının birin altına düştüğü konsantrasyonlar için, algılamayı sağlamak için birden fazla görüntü gereklidir.
Bu, plaka sayısı ile ölçülen mililitre başına 2.100 hücrede bir Serratia marcescens kültürünün bir DHM hologram dizisidir. Dizi, kabaca her bir ila iki saniyede bir hücre gösterir ve bu da tahmine mükemmel bir uyum sağlar. Ve bu, plaka sayısı ile ölçülen, mililitrede 620 hücreye sahip bir Serratia marcescens kültürünün başka bir DHM hologram dizisidir.
Bu dizi, kabaca her altı ila yedi saniyede bir hücre gösterir. Hücreleri görüntülemek için dijital holografik mikroskopi kullanırken, tüm çözeltilerin hazırlanmasında filtre sterilizasyon tekniklerini kullanmayı unutmayın. Bu, cihaza partikül madde girmesini önleyecektir.
Bu prosedürü denerken, sağlıklı hücre kültürleri hazırlamayı ve elinizde ekstra büyüme ortamı, plakalar ve motilite ortamı bulundurmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, canlı ve ölü hücrelerin yüzdesi gibi ek soruları yanıtlamak için floresan boyama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların kültürlenmiş hücrelerde ve çevresel örneklerde üç boyutlu hareketliliği keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, holografik mikroskopi kullanarak bakterilerin nasıl numaralandırılacağını ve diğer sayma tekniklerini kullanarak sonuçları nasıl doğrulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bakteri kültürleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Canlı organizmaları yetiştirirken ve işlerken her zaman uygun biyogüvenlik önlemleri alınmalıdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, düşük yoğunluklarda mikroorganizmaları tespit etmek için dijital holografik mikroskopiyi (DHM) kullanımını ele almaktadır. DHM, geleneksel mikroskopiden daha hassas ve gerçek zamanlı analiz sunan bir hacimsel görüntüleme tekniği sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
- Patogen Algılama
Arka Plan
- Dijital holografik mikroskop, parlak alan mikroskopundan daha kalın numunelerin görüntülemesine izin verir.
- Teknik, numunelerin işlenmesi sonrası odaklanmayı artırarak kullanışlılığını sağlar.
- DHM anında üç boyutlu bilgi sağlayabilir.
- Bu yöntem özellikle düşük bakteri konsantrasyonlarının tespitinde yararlıdır.
Çalışmanın Amacı
- DHM'nin düşük seviyelerde mikroorganizmaları tespit etmedeki etkinliğini göstermek.
- Biyolojik ve kozmoloji araştırmalarındaki uygulamalarını keşfetmek.
- Klinik ortamlarda enfeksiyonları teşhis etme potansiyelini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Gerçek zamanlı görüntüleme için dijital holografik mikroskop kullanımı.
- Optik yoğunluk ölçümleri ve plaka sayımı gibi geleneksel yöntemlerle karşılaştırma.
- Bakteryel kültürlerin spektrofotometrik ön ölçümleri.
- Çeşitli numunelerde mikroorganizmaların takip edilmesi ve sayımı.
Ana Sonuçlar
- DHM, çok düşük yoğunluklarda mikroorganizmaları başarıyla tanımladı ve takip etti.
- Sonuçlar, geleneksel mikroskop tekniklerine kıyasla daha yüksek hassasiyet gösterdi.
- Teknik, bakteri davranışları hakkında değerli bilgiler sağladı.
- Su ve klinik örneklerde patojenik mikropların tespitinde potansiyel uygulamalar vurgulandı.
Sonuçlar
- Dijital holografik mikroskop, mikrobiyoloji araştırmaları için umut verici bir araçtır.
- Teknik, patogen algılama yeteneklerini önemli ölçüde artırabilir.
- Gelecek uygulamaları, klinik teşhis dahil olmak üzere çeşitli alanlara genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Digital holographic microscopy (DHM) enables real-time, label-free detection of microorganisms at low concentrations, addressing a critical bottleneck in pharmaceutical quality control and environmental monitoring. By providing volumetric imaging without staining or incubation delays, DHM supports rapid go/no-go decisions in bioprocessing and reduces reliance on culture-based methods. This capability enhances predictive confidence in contamination risk assessment across liquid formulations, water systems, and in-process samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables label-free observation of microbial motility and morphology to support functional characterization in early target de-risking.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent tags or fixation, preserving native cellular behavior during hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time cell density measurements from hologram analysis to enable robust assay standardization.
- Operational Value: Supports continuous monitoring of microbial growth or inhibition in motility media without sampling artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of low-abundance contaminants in biologics or cell therapy intermediates where traditional methods lack sensitivity.
- Operational Value: Enables process-adjacent monitoring using sterile fluid paths, reducing off-line testing and accelerating release timelines.
Pipeline & Workflow Integration
DHM fits within the discovery-to-preclinical continuum by offering a real-time, non-destructive readout for microbial detection that complements endpoint plating and genomic methods. It supports early-stage bioprocess monitoring where rapid feedback is essential for maintaining sterile conditions.
- Discovery Biology: Enables 3D tracking of microbial behavior in response to compounds or environmental stressors without perturbing native physiology.
- Screening: Delivers label-free, quantitative output suitable for high-content screening of antimicrobial compounds or process conditions.
- Analytics: Generates cell density metrics via hologram frame analysis and volumetric sampling, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Supports continuity from bench to process by detecting low-level microbial presence in clinically relevant matrices like buffer or media.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-capable technique adaptable across multiple microbial strains and sample types with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases detection confidence for low-concentration microorganisms, reducing false negatives in release testing.
- Operational Value: Cuts time-to-result from days (plating) to minutes, enabling real-time process intervention.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage development by improving early contamination surveillance.
- Portfolio Impact: Supports risk-based sampling strategies and informed go/no-go decisions in technology transfer and scale-up.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holography principles, image processing, and microbial enumeration techniques.
- Needs stable illumination source, camera, and sample chamber with sterile fluid handling compatibility.
- Demands standardized protocols for hologram acquisition, background subtraction, and cell counting across operators.
- Must account for particle interference and motility effects when adapting to complex formulations or environmental samples.
- Limited by field of view and concentration range, necessitating sufficient sampling volume for rare event detection at very low densities.
