Name: Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Öğrenin hücresel kütle, hacim ve yoğunluk ölçümü için standart optik mikroskop kullanarak canlı hücre analizi yapmayı. Bu yöntem boyama ve sabitleme gerektirmez.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (OJTM için KGP, OJTM ve R01HL101972 için U54CA143906) ve Oregon Tıbbi Araştırma Vakfı Erken Klinik Araştırmacı Ödülü (KGP) hibe tarafından desteklenmiştir. OJTM bir Amerikan Kalp Derneği Kuruldu Araştırmacı (13EIA12630000) &#39;dir. Biz bu çalışmada kullanılan hücre örnekleri hazırlamak için Şövalye Kanser Enstitüsü&#39;nden Dr Eric Anderson teşekkür ederim.

1.. Mikroskop Özellikleri Doğru şekilde görüntüleme yürütmek için mikroskop aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır: <ol><li> Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve aydınlık (BF) kontrast hem de sahip. </li><li> Bilgisayar kontrollü z-eksen hareketi var. </li><li> Yoğunlaştırıcı mercek sayısal açıklık değişeceği için ayarlanabilir diyafram durak var. Derecelendirilmiş bir kural veya elektronik okuma bir diyafram sayısal diyafram değerini bilmek gereklidir. Sayısal açıklık NIQPM için 0.1 HTDIC için 0.9 (veya daha yüksek) kadar aralık olmalıdır. </li><li> Mikroskop parlak bir alan görüntüleme için kullanılmak üzere bir dar bant renk filtresi olmalıdır. Bu filtre, kırılma artış, NIQP kütle yoğunluğuna faz dönüştürmek için kullanılan bir dalga boyuna bağımlı facture gidermek için gereklidir. </li></ol> 2. Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Z-yığın Edinme <ol><li> Slidebook yazılım a açınnd resim koleksiyonu için yeni bir slayt oluşturmak. </li><li> Sonra, Odak penceresi açmak. Filtre Seti bölümünde, DIC seçin. Kapsam sekmesinde, Kondenser bölümünde, uzak doğru pozisyonda (tüm yol açmak) için Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın. Bu yüksek sayısal açıklık aydınlatma sağlar ve numunenin optik bölümlendirilmeleri artırır. </li><li> Bir DIC objektif kullanılarak numune odaklanın. Örnek kolayca görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Kamera doymuş varlık değildir sağlamak için, Odak Penceresinde Kamera sekmesini seçin ve piksel yoğunluğunun histogram kameranın dinamik aralığında olduğunu kontrol edin. </li><li> Görüntü Yakalama penceresini açın. Yakalama Türü bölümünde, 3D kutusunu işaretleyin. 3D Capture bölümünde, merkez etrafında Aralığı seçmek ve mevcut yere geri dönün </strong&gt; kutuları ve Z-yönü aralığı, uçak sayısını ve adım boyutunu belirtin. Z-doğrultusu aralığı, tüm numune içermelidir. </li><li> Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, DIC kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı ve görüntüleme başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin. </li></ol> 3. Parlak Field (BF) Z-yığın Edinme <ol><li> Mikroskop numunenin DIC Z-yığını toplama bittikten sonra, Odak penceresi açmak ve Filtre Seti bölümünde Aç seçeneğini seçin. Düşük NA aydınlatma sağlamak için (tüm yol kapalı) uzak sol konumuna Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın. </li><li> Yeşil mikroskop ışık yolu filtresini değiştirin. Örnek görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Seçerek kamera doygunluk var olun <stRong&gt; Kamera Odak Penceresinde sekmesini ve piksel yoğunluğunun histogram belirtilen aralıkta olduğunu kontrol. </li><li> Görüntü Yakalama penceresini açın. DIC Z-yığın iktisabından 3D Çekim ayarları görüntülenir. </li><li> Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, AÇIK kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı, ve Z-yığın görüntü toplama başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin. </li></ol> 4. Z-yığın Görüntüler İhracat <ol><li> Z-yığın yakalama açın. % 100 görünümünü değiştirin. 0 arasında görüntülenecek piksel değerlerinin histogram ve kameranın maksimum piksel değeri (4.095 12 bit kameralar, 16 bit için 65.535.) Ayarlayın. </li><li> Görünüm&gt; Dışa Aktar&gt; TIFF Seri seçin. Bu TIFF görüntüleri bir dizi olarak Z-yığını ihraç edecek(Her Z düzlemi için bir tane). Sonunda (yani &quot;DIC Stack 1_&quot;) da bir çizgi bir adla ayrı bir klasörde TIFF dizi kaydedebilirsiniz. Her DIC veya BF Z-yığını ile bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5. Hacim Ölçümleri <ol><li> &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot; başlıklı HTDIC MATLAB programını açın. </li><li> HTDIC programın Bölüm 0 altında, bağımlılıkları dizin değişkeni güncelleştirmek. Kopyala ve &quot;dependencies_directory =&quot; Aşağıdaki tek tırnak arasındaki explorer hilbert_transform_dic.m ve sobel_edge_detect.m dosyaları (PC) içeren dizini yapıştırın. JoVE_HTDIC_v1.m program ExecuteSection 0. </li><li> Bölüm 1, &quot;images_directory&quot; güncelleyin. Yine, kopyalama ve tek tırnak arasında. Tif biçiminde yoluyla odak görüntüleri içeren dizini yapıştırın. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN. </li><li> Hizalama ve Hilbert için görüntülerin dönme çalıştırın kod Bölüm 2. dönüşümü. &quot;HTDIC parametreleri tanımlayın&quot; başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Beş numbers kullanıcı gereklidir: numune DIC görüntü odakta odak düzlemi sayısı, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), DIC görüntünün dönüş açısı Hilbert dönüşümü gerçekleştirmek için gerekli tipik değerler 45 ve -135 bulunmaktadır. Son olarak, ilgi boyutta bölge girmek, bu parametre, daha sonra görünür bir kutunun bir yan uzunluğunu tanımlayan - tipik değer 400&#39;dür. Ok tıklayın. </li><li> Odak düzlemi sayısına göre belirlenen DIC odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği üzerinde kutusunu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Kutu arzu edilen bölgeye, kutunun içinde çift tıklayarak üzerinde konumlandırılmış edildikten sonra. </li><li> Başka bir rakam şimdi görünecektir: Bu rakam bir önceki adımda seçilen ilgi bölgenin bir kırpılmış ve döndürülmüş görüntüsünü içerir. Görüntünün kontrast şekilde olmalıdırparlak özellikleri sağ tarafta görünür iken o karanlık özellikleri solda görünür. Ilgi bölgesi üzerinde mavi kutuyu sürükleyin, gerektiğinde yeniden şekillendirmek. </li><li> Bölüm 3 z-yığın küp için bir maske oluşturur. Dikdörtgen bir maske hücrenin etrafına bir dikdörtgen ve elle ilgi hücre anahat ücretsiz bir el aracı oluşturmak için: Mevcut İki maske türü vardır. </li><li> Dikdörtgen bir maske, dosyamıza hattı 167 ve açıklama satırı 170 (bu çizginin başında bir &quot;%&quot; koyarak bir satırı yorum) oluşturmak için. Programın Bölüm 3. yürütün. Görüntüdeki tıklayın ve dikdörtgen maske tanımlayarak başlamak için fareyi sürükleyin. Bunu kabul etmek kutuya çift tıklayın. </li><li> Elle çizilmiş bir maske, Yorum satırı 167 ve yorumsuz hattı 170 oluşturmak ve Bölüm 3. yürütün. Tıklayın ve fare ile istenen maske çizin. Bunu kabul etmek maskesi üzerine çift tıklayın. </li><li> Hilbert inşa 4to çalıştırın Bölüm DIC Görüntü yığını ve ilgi alanının tekabül DIC görüntü yığınını dönüştürdü.Bölüm 3 inşa maske DIC yığını ve &quot;Maskon&quot; satırında 179 1&#39;e set edilir düzenli DIC yığını dönüştürmek Hilbert uygulanacaktır. 0 &quot;Maskon&quot; ayarı maske uygulamadan görüntü yığınlarının inşa edecek. </li><li> Ilgi bölgenin xz kesit görüntülerin görüntü segmentasyon optimize Bölüm 5 çalıştırın. Program tarafından üretilen rakam 500, kontrast, üç farklı görüntüleme görünür. Hücrenin sınırları bulmak için algoritmanın başarısı, kullanılan maske ve program doğrultusunda 229 at &quot;eşik&quot; değerinin bir kombinasyonu ile bağımlıdır. 0.5 bir değerle başlar. Eşik değerini ayarlamak ve doğru özetleyen sütunlardan birinde elde edilinceye kadar programın bu bölümü yeniden çalıştırın. </li><li> Anahat 1. sütunda iyi olsaydı, DIC görüntü segmentasyon kullanarak ses seviyesini belirlemek için Bölüm 6 kullanın. Sütun 2 optimum sonuçlar verdiyse, Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri hücre hacmini belirlemek için Bölüm 7 çalıştırın. Eğer sütun 3 gave optimal sonuçları, koşmak Bölüm 8 Fourier-filtreden Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri kullanarak hacmini belirlemek. </li><li> Küp mikron (fl) rapor numunenin ölçülen hacim, hacim ölçümü seçildiği bağlı olarak program tarafından üretilen Şekil 600, 700, veya 800 başlığında sunulmuştur. </li></ol> 6. Kütle Ölçümleri <ol><li> &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot; başlıklı NIQPM MATLAB programını açın. </li><li> NIQPM programın Bölüm 0 altında, programı çalıştırmak için gerekli üç dizin konumunu güncelleştirmek. Bunlar &quot;dependencies_directory,&quot; &quot;brightfield_directory,&quot; ve vardır &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Sonraki Bölüm 1. çalıştırın. Bu kod bölüm görüntüler tüm setinin tam alanında parlak bir alan görüntü küp oluşturur. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN. </li><li> Sonraki Bölüm 2. çalıştırın. &quot;NIQPM parametreleri tanımlayın&quot; başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Dört numaraları kullanıcı gereklidir: odak düzlemi numarası nerede ve parlak alan görüntüörnek odakta olduğu, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), ve faiz boyutu bölgesi, bu parametre bir tarafı uzunluğunu belirler sonradan görünecektir kutusu - tipik bir değer 200&#39;dür. Ok tıklayın. </li><li> Odak düzlemi sayısına göre belirlenen aydınlık alan odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir. <ol><li> Görüntü odakta değilse, mavi kutu ve tekrar çalıştırın Bölüm 2 çift tıklayın, iletişim kutusunda odak düzlemi sayısını ayarlamak için emin olun. </li><li> Görüntü odakta ise, resmin etrafında mavi kutuyu sürükleyin ve kutunun düğümlerin seçimi ve gerektiğinde bunları sürükleyerek yeniden boyutlandırmak. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği etrafında kutu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Bunu kabul etmek kutunun içini çift tıklatın. </li></ol></li><li> Sonraki çalıştırmak parlak alan görüntülerin bir yığın oluşturmak için Bölüm 3 içinde bölgeye kırpılmışterest. </li><li> Faz haritası, sözde DIC görüntü ve parlak bir alan görüntüler ve gerçek DIC görüntüye karşılaştırmalar oluşturmak için, Bölüm 4 çalıştırın. </li><li> Sözde ile DIC ve kütle yoğunluğu haritası, toplam kütle ve hücre yoğunluğu histogram mümkün olduğunca benzer doğru DIC görsel bölüm 5a veya 5b çalıştırarak belirlenebilir. Hattında 300 at optimize &quot;eşik&quot; - - Bölüm 5a alanının otomatik yatılı tespitini gerçekleştiren tipik değerleri 0,1-1 arasında değişmektedir. Eşik değerini optimize etmek gerektiği gibi, bu bölümü yeniden çalıştırın. Kullanıcı ilgi hücresini özetliyor sonra bölüm 5b vb kitle belirlenmesi, yürütmektedir. </li></ol>

<ol><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Technische+Physik%22%5BJournal%5D)">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li>
<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+contrast%2C+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Physica%22%5BJournal%5D)">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li>
<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li>
<li>Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li>
<li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinterf%C3%A9rom%C3%A8tre+diff%C3%A9rentiel+%C3%A0+ondes+polaris%C3%A9es%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Radium%22%5BJournal%5D)">Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li>
<li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Zeiss+Inform%22%5BJournal%5D)">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li>
<li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-enhanced+contrast%2C+differential+interference+contrast+%28VEC-DIC%29+microscopy%3A+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+processing+greatly+enhances+contrast%2C+quality%2C+and+speed+in+polarization-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li>
<li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+shape+change+and+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+microscopy+and+mass+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li>
<li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractometry+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li>
<li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li>
<li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li>
<li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide%E2%80%90field+differential+interference+contrast+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li>
<li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+%28TI-DIC%29+microscopy+for+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering-phase+theorem%3A+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li>
<li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Carr%C3%A9+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li>
<li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li>
<li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li>
<li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((non-iterative+phase+retrieval+by+Green%E2%80%99s+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">non-iterative phase retrieval by Green’s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li>
<li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+quantification+of+cellular+mass%2C+volume%2C+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li>
<li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single+cell+refractive+index%2C+dry+mass%2C+volume%2C+and+density+using+a+transillumination+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li>
<li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li>
<li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cell+membrane+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li>
<li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li>
<li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22SLIM%29.+Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li>
<li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li>
<li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li>
<li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li>
<li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar sunulan çalışmalarında hiçbir maddi çıkarları var.

Genel olarak, NIQPM ,25-44,7 değişen optik yol uzunlukları üzerinde doğrulanmış bir kırınım-sınırlı bir tekniktir. Doğrulama n gerçekleştirilmiştir = Fluoromount G içinde süspansiyon haline 0.11-9.8 um çap arasında değişen 1,596 polistiren küreler (veriler gösterilmemiştir). Hücreler yaklaşık 0-7 aralığında optik yol uzunluklarına sahip. Bir numunenin yoğunluk dağılımını ölçerken bir yoğunluk haritası, arka plandaki istenmeyen katkıları sahip iken sözde DIC görüntü daha ince görünüyor bulabi...

Optik mikroskop kullanımı artık hücresel organizmaların araştırılmasında her yerde. Nedeniyle görünür optik spektrum üzerinde düşük endojen absorbans ve zayıf saçılma özellikleri, hücreler güçlü onları geçme optik dalgaların genlik etkileyebilir ve böylece standart parlak alan mikroskopları ile görüntülenmiş zaman yarı saydam görünmüyor. Hücresel örnekleri, bununla birlikte, doğrusal ışık hareket ettiği alanı belirli bir bölgede yerel bir kütle yoğunluğunun miktarı ile ilgili bir şekilde, kendi içinde seyahat eden optik dalgalar aşağı yavaş yok. Bu heterojen gecikmeyle veya mikroskobik yoluyla bulaşan optik dalgaların &quot;faz&quot; profilinin yararlanması ilk Fritleri Zernike 1 tarafından 1935 yılında tarif edilen ve deneysel Zernikein 1942 2 tarafından gerçekleştirilmiştir. Zernike bu başarı için 1953 yılında Nobel ödülü aldı. Zeiss 1945 3 bu yöntemi ticari. 1955 yılında Smith ve Nomarski diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, bir kontrast mekanizması olarak faz uzaysal gradyanı kullanan bir yöntem kullanımıyla 4 ve 5 teorisi üzerindeki ilk çalışma mevcut olacaktır. DIC Nomarski 6 ile 1965in yakın işbirliği içinde Zeiss tarafından ticari oldu. 1981 yılında, iki laboratuvar DIC mikroskop 7, 8 optik trenin içine video kameralar eklenmesi ile kaydedilmiş ilk canlı hücre DIC görüntüleri gösterdi. Canlı hücre görüntüleme çağı doğdu. O tarihten bu yana, ticari mikroskoplar üzerinde faz kontrast ve DIC hem yürütme büyük ölçüde değişmeden olmuştur. Morfolojisi, hücre altı yapıların takibi, ve membran dinamikleri 9 soruşturmalarının izlenmesi: Bu yöntemler esas nitel amaçlar için hücrelerin görüntülerini üretmek için biyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu teknikler faz ve dı olarak &quot;off-the-raf&quot; konfigürasyonunda nitelC görüntüleri keyfi ışık kaynağı yoğunluğu fonksiyonları, aydınlatma optik ayarları ve CCD kamera kazanç, gama ve pozlama ayarları vardır. Fizikçiler ve optik mühendisleri küçük bir lejyon ticari görüntüleme yöntemleri nicel yapmak için çaba harcadı. İlk çabaları arasında hekim-açık-Biyofizikçi Robert Barer piyasada bulunan bir fazlı mikroskop kullanarak bu hücre türleri ile faz değişimleri tahmin ederek hücrelerin hücre kuru kütlesini belirlemek için faz mikroskobu kullanımı gösterilmiş olan 1952 ve 1953 yılında Nature iki mektup vardı 10, 11. Faz mikroskopi 10,11, DIC mikroskopi 12-17, ve optik yol uzunluğu, faz, kütlesini belirlemek için parlak bir alan 18-22: alan üç temel etiket ücretsiz kontrast mekanizmaları etrafında dayalı takip eden yılda teknikleri çok sayıda geliştirdi yoğunluk, kırılma indeksi ve hücre hacmi. Paragraftallel, özel optik araçlar geniş bir koleksiyon da 1950&#39;lerden beri geliştirilmiştir ve parazit büyüme 23 uygulamalar, kırmızı kan hücrelerinin 25 membran dinamikleri soruşturma hücre döngüsünü 24 belgeleyen değişen optik ölçümler geniş kapsamlı yaptık. Özellikle, son on yıl kırınım faz mikroskobu 26 şeklinde, tomografik faz mikroskopi 27, dijital holografik mikroskopi 28, faz duyarlı optik koherens mikroskopi 29, uzaysal ışık girişim mikroskopisi 30, Hilbert etiket içermeyen nicel mikroskopi bir zenginlik gördü faz mikroskopi 31, ve kantitatif faz mikroskopi 32. Toplu başarılara rağmen, bu araçlar onların karmaşık enstrümantasyon ve hesaplama gereksinimleri, çoğunlukla nedeniyle biyolojik araştırmacıların büyük alana saçılmış olmamıştır. Burada biz dAydınlık saha ve DIC görüntülerinin bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun niceliksel ölçümlerini gerçekleştirmek için bir optik mikroskop kullanımını escribe. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Başarılı yürütülmesi için gerekli olan görüntüleme koşulları en ticari olarak temin edilebilir mikroskoplar normal çalışma kapsamı içindedir. Ayrıca, post-işleme algoritmaları, istikrarlı, hızlı ve sağlam - mümkün hızlı Fourier (FFT) tabanlı algoritmaları dönüşümü kullanılarak MATLAB uygulanmakta olan. NIQPM faz ve cel, eksensel olarak entegre kütle yoğunluğu oluşturmak için bir yöntemdirparlak bir alan görüntülerinden lular örnekleri. Numunenin bu alan üzerinde eksensel olarak entegre kütle yoğunluğunun toplamı numunenin toplam kuru kütle içeriği verir. Bir hücrenin faz profili numunenin odak-boyunca parlak bir alan görüntülerinin yeniden inşa edilebileceği gösterilmiştir edildiği - - NIQPM protokol Paganin ve Nugent 18, 19 döşediği deneysel temellere dayanmakta ve Frank teorik çalışma , Altmeyer ve Wernicke 20 - verimli bir FFT-tabanlı şekilde paraksiyel dalga modellerini çözme. Kuru kütle yoğunluğuna fazın bağlantı Barer 10, 11 ve 33 ile Popescu çalışma üzerine dayanır. Hacimsel bilgiler optik eksen boyunca numunenin optik olarak kısımlara sağlayan yüksek NA aydınlatma koşulları altında odak-boyunca DIC görüntü elde edilebilir. Hilbert DIC görüntü yığınlarının üzerinde işlem dönüşümü büyük ölçüde artırırArka plan olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları. Bu kontrast ve numunenin otomatik analizi için bir hacimsel sobel dayalı kenar algılama yöntemi geliştirmek için her iki Fourier filtreleme sebep olacak, ancak bu çalışma Arinson et al. 34 ile kaynaklanmaktadır. Biz de kırınım sınırından yukarı çapı 36, 20 mikron boyutu arasında değişen polistiren küreler daha önce HTDIC geçerliliği var. NIQPM ve HTDIC hem ticari mikroskopları onların gelişimine nedeniyle teknolojik erişilebilir olmakla birlikte, yöntemler temelde mikroskopları kendilerini donanım konfigürasyonu ile sınırlıdır. Bu tekniklerin temel sınırlamalar iki kat vardır: aksine nedeniyle tüm numune aşamasında çeviri, ticari Kabinlerdekilerden yavaş z-yığını alma zamanı sadece objektif lens içinŞu anda hızlı kabaca 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma sınırlar, ve ikincisi, kırınım etkileri sırasıyla, çapı 10 ve 20 mikron kadar 0.2 arasında değişen büyüklüklerde nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri tipik &quot;off-the-raf&quot; enstrümanlar üzerinde bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, en sabit hücresel örnekleri kolayca bu yöntemler ile incelenmiştir. NIQPM ve HTDIC protokollerin bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de verilmiştir. Şekil 2 biz, parlak alan ve DIC görüntüleri hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma koşulları altında optimal ve optimal yoluyla odak görüntüleme göstermektedir. 3 ve 4 başarılı ve başarısız uygulamaları vurgulayarak NIQPM algoritmasının parametre bağımlılığını göstermektedir Rakamlar. <strong&gt; Şekil 5, HTDIC görüntü işleme algoritması dahil adımları göstermektedir ve hücre hacmini belirlemek için algoritmanın en uygun uygulama göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 mikroskop</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Almanya</td><td>Axio Imager D2</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Yeşil filtre (&lambda; = 540 &plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>Yeşil filtre</td></tr><tr><td>SlideBook 5.5 yazılımı</td><td>Akıllı Görüntüleme Yenilikleri, Denver, Colorado</td><td></td><td>Görüntü satın alma yazılımı</td></tr><tr><td>Polistiren mikroküreler</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>Polistiren küreler</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>Montaj ortamı</td></tr></tbody></table>

nicel optik mikroskopi: hücresel biyofizik ölçümü standart optik mikroskop ile Özellikleri

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Bu, parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun sayısal ölçümler için standart bir optik mikroskop kullanılmasını tarif eder. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. Düşük sayısal açıklık (NA) aydınlatma, zayıf saçılma ve numune tarafından ışığın zayıf emilimi: NIQPM dalga yayılımının basitleştirilmiş bir modeline dayanan, üç temel varsayımlar ile, paraksiyel yaklaşım olarak adlandırılır. Neyse ki, boyanmamış hücre örnekleri bu varsayımları karşılamak ve düşük NA aydınlatma kolayca ticari mikroskopları üzerinde elde edilir. HTDIC yüksek NA aydinlatma altında odak-boyunca DIC görüntüleri hacimsel bilgileri elde etmek için kullanılıration koşulları. Yüksek aydınlatma NA optik eksen boyunca numunenin geliştirilmiş bölümlendirilmeleri sağlar. Hilbert DIC görüntü işleme dönüşümü büyük ölçüde yığınlarının arka olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları artırır. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları &quot;off-the-raf&quot; mikroskop kullanarak teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Ticari kapsamları yavaş z-yığını alma zamanı henüz hızlı 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma lağvetti, ve ikincisi, kırınım etkileri 10&#39;a kadar 0.2 ila nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak: Bu yöntemlerin iki temel sınırlamaları vardır sırasıyla (NIQPM) ve çapı 20 (HTDIC) um. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, çoğu sabit cellular örnekler hali hazırda, bu yöntemler ile incelenmiştir.

Odak-boyunca görüntü alımı sırasında doğru örnek aydınlatma NIQPM nd HTDIC algoritmaları başarılı bir şekilde uygulanması için önemlidir. Şekil 2 biz DIC ve polistiren küre ve insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı SW620 için parlak bir alan kontrast altında hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma göstermektedir. 2A Şekiller, 2C, 2I, ve 2K NIQPM için optimal görüntüleme göstermektedir. 2F, 2H Rakamlar, 2N, ve 2P HTDIC...

Parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntülerinin bir kombinasyonu aracılığıyla hücresel kütle, hacim ve yoğunluğun kantitatif ölçümlerini gerçekleştirmek için standart bir optik mikroskobun kullanımını açıklıyoruz.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Bu prosedürün genel amacı, standart bir optik mikroskop ve görüntü işleme kullanarak, kütle ve hacim dahil olmak üzere hücresel örneklerin temel fiziksel özelliklerini nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle cam lameller üzerinde büyütülen hücresel örneklerin mikroskop lamlarına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, odak boyunca parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri elde edilir.Ardından, her bir Z yığını görüntüsü, fiziksel verileri çıkaran ayrı MATLAB görüntü işleme programlarına girdi olarak verilir. Nihayetinde, hücre örneklerinin temel fiziksel özellikleri; parlak alan kontrastı ve diferansiyel girişim kontrastlı mikroskopi altında, odak boyunca yoğunluk ölçümleri kullanılarak elde edilir. Bu tekniğin floresan mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre örneklerinin fikse edilmesi, permeabilize edilmesi veya boyanması gerekmemesidir.Bu yöntem, hücre döngüsü sırasında veya bir hastalık durumuna katkıda bulunan farklı hücre popülasyonları arasında hücre altı yoğunluğun nasıl organize olduğu gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hem DIC hem de parlak alan özelliklerine sahip bir mikroskobu, metin protokolündeki ek özelliklere göre kullanarak, öncelikle slayt kitabı yazılımını açarak ve görüntü toplama için yeni bir slayt oluşturarak başlayın. Ardından, odaklama penceresini açın ve filtre ayarları bölümünden DIC'yi seçin. Mikroskop sekmesindeki kondenser bölümünde, açıklık kaydırma çubuğunu en sağ konuma getirin. Bu işlem, yüksek sayısal açıklıklı aydınlatma sağlar ve örneğin optik kesitlenmesini geliştirir.Numunenin DIC yığınını yakaladıktan sonra odak penceresini açın ve "open" seçeneğini belirleyin. Filtre seti bölümünde, düşük NA aydınlatma sağlamak için diyafram kaydırıcı çubuğu en sol konumuna getirerek tamamen kapatın. Sinyal yoğunluğunu ayarladıktan sonra görüntü yakalama penceresini açın.DICZ yığın alımından elde edilen 3D yakalama ayarları, görüntü yakalama penceresinin filtre seti bölümünde görüntülenecektir. Açık kutucuğu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü bilgisi bölümünde görüntüye isim verin ve Zack görüntü alımını başlatmak için başlat'ı seçin.Ardından, H-T-D-I-C MATLAB programı olan JoVE HT DCO V one M'de hacim ölçümleri gerçekleştirmek için metin protokolüne göre Z yığınlarını dışa aktarın. Sıfırıncı bölümde, gezginden hilbert. Transform DM ve sobel edge Detect M dosyalarını içeren dizini kopyalayıp yapıştırarak dependencies directory değişkenini güncelleyin. dependencies directory = ifadesinden sonraki tek tırnakların arasına yapıştırın ve joco HT DCO V one M programının sıfırıncı bölümünü çalıştırın.Birinci bölümde, odak boyunca alınan görüntülerin dot TIF formatındaki dizinini kopyalayıp yapıştırarak görüntü dizinini güncelleyin. Görüntüleri hizalamak ve döndürmek için tek tırnaklar arasındaki bu bölümü yalnızca bir kez çalıştırın. Hilbert dönüşümü için kodun ikinci bölümünü çalıştırın; "Define HT DIC parameters" başlıklı bir iletişim kutusu görünecektir.Ardından, örneğin DIC görüntüsünün odakta olduğu odak düzlemi numarasını, lateral çözünürlüğü, aksiyal çözünürlüğü, hilbert dönüşümünü gerçekleştirmek için gereken DIC görüntüsünün rotasyon açısını ve son olarak ilgi alanı boyutunu girin. Sonra Tamam'a tıklayın. Belirtilen odak düzlemi numarasına ait DIC odak düzlemi görüntüsü, üzerinde mavi bir kutuyla birlikte görünecektir.Kutuyu, bir hücre gibi ilgilenilen özelliğin üzerine yerleştirin. Kutu istenen bölgeye yerleştirildiğinde, B'nin içine çift tıklayın. Görüntünün kontrastı, koyu özelliklerin solda, parlak özelliklerin ise sağda görüneceği şekilde olmalıdır. Mavi kutuyu ilgilenilen bölgenin üzerine sürükleyin ve gerektiğinde yeniden şekillendirin.Ardından, üçüncü bölüm altında, dikdörtgen bir maske oluşturmak için 167. satırın başındaki yorum işaretini kaldırın ve 170. satırı yorum satırı haline getirin; görüntünün içine tıklayıp fareyi sürükleyerek dikdörtgen maskeyi tanımlamaya başlayarak programın üçüncü bölümünü çalıştırın. Daha sonra, onaylamak için kutucuğa çift tıklayın. El ile çizilmiş bir maske oluşturmak için, üçüncü bölümü çalıştırmadan önce 167. satırı yorum satırı haline getirin ve 170. satırın başındaki yorum işaretini kaldırın; fare ile tıklayıp istenen maskeyi çizdikten sonra, onaylamak için maskeye çift tıklayın. Dördüncü bölümü çalıştırdıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak Hilbert dönüştürülmüş görüntü yığınlarını oluşturmak için beşinci bölümü çalıştırın.İlgi bölgesinin xz kesit görüntülerinin görüntü segmentasyonunu optimize etmek için, program tarafından üretilen Şekil 500'de üç farklı kontrast tipi görünmektedir. Algoritmanın hücre sınırlarını bulmadaki başarısı, kullanılan maske ve programın 2, 2, 9. satırındaki eşik değerinin kombinasyonuna bağlıdır; 0.5 değeri ile başlayın ve sütunlardan birinde uygun çerçeveleme elde edilene kadar eşik değerini ayarlayıp programın bu bölümünü yeniden çalıştırın.Eğer ana hat belirleme işlemi birinci sütunda en iyi sonucu verdiyse, DIC segmentasyonunda hacmi belirlemek için altıncı bölümü kullanın. Eğer ikinci sütun optimal sonuçlar verdiyse, hilbert'ten hücre hacmini belirlemek için yedinci bölümü çalıştırın; eğer üçüncü sütun optimal sonuçları verdiyse, hacmi belirlemek için sekizinci bölümü çalıştırırken forer filtrelenmiş hilbert dönüşümü DIC görüntülerini kullanın. NIQ PM MATLAB programında kütle ölçümleri almak için sıfırıncı bölüm altında JO VCO NI qpm V1 M başlıklı işlemi gerçekleştirin. Birinci bölümü çalıştırdıktan sonra üç dizin bağımlılığının, BRIGHTFIELD ve DIC dizininin konumunu güncelleyin; "define N-I-Q-P-M parameters" başlıklı diyalog kutusunda ikinci bölümü çalıştırarak örneğin parlak alan görüntüsünün odakta olduğu odak düzlemi numarasını, yanal çözünürlüğü, eksenel çözünürlüğü ve ilgi alanı boyutunu girin.Ardından Tamam'a tıklayın. Belirtilen odak düzlemi numarasına ait brightfield odak düzleminin görüntüsü mavi bir kutuyla birlikte görünecektir. Gerekirse ikinci bölümü tekrar çalıştırarak odağı ayarladıktan sonra, kutuyu görüntü üzerinde sürükleyin, kutunun düğümlerini seçip yeniden boyutlandırmak için sürükleyin ve ardından onaylamak için kutunun içine çift tıklayın.Üçüncü bölüm çalıştırılarak bir parlak alan görüntü yığını oluşturulduktan sonra, faz haritasını, pseudo DIC görüntülerini ve bunları parlak alan görüntüleri ile gerçek DIC görüntüsüyle karşılaştırmaları üretmek için dördüncü bölümü çalıştırın; pseudo DIC ve gerçek DIC görüntüleri birbirine mümkün olduğunca benzediğinde, kullanıcının hücrenin etrafını çizerek kütle yoğunluk haritasını, toplam kütleyi ve hücre yoğunluğu histogramını doğru şekilde oluşturmasını sağlayan beş A veya beş B bölümünü çalıştırın. Odak boyunca görüntü alımı sırasında örnek aydınlatması, N-I-Q-P-M ve H-T-D-I-C algoritmasının başarılı bir şekilde uygulanması için kritiktir. Bu şekil, bir polistiren küre ve insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı SW six 20 için hem DIC hem de parlak alan kontrastı altında düşük ve yüksek NA aydınlatmasını göstermektedir.Bu paneller N-I-Q-P-M için optimal görüntülemeyi, bunlar ise HT DIC için optimal görüntülemeyi göstermektedir. Bu görüntüler, hem başarılı hem de başarısız uygulamaları vurgulayarak NIQ PM algoritmasının parametre bağımlılığını kanıtlamaktadır. Burada, 4.8 µm çapındaki bir polistiren kürenin faz profilini inceliyoruz.Beklenen profil teorik olarak bilinmektedir ve bu nedenle NIQ PM rekonstrüksiyonu ile doğrudan karşılaştırılabilir. Bu paneller, küre difraksiyon etkileri için elde edilebilecek en iyi rekonstrüksiyonu sunmaktadır; kürenin hem sınırlarında hem de içinde meydana gelen etkiler, küre üzerindeki tüm noktalarda stabil rekonstrüksiyonu engeller. Kürenin merkez bölgesi, Panel L'de görüldüğü üzere %1 ile %5 arası bir yüzde hata ile N-I-Q-P-M ile yakalanabilir; burada faz özellikleri bilinmeyen hücresel örnekler yer almaktadır.A priori, pseudo DIC görüntüsü ile gerçek bir DIC görüntüsünü karşılaştırmaya yönelik bir prosedürle birlikte NIQ PMM kullanılarak yeniden oluşturulabilir. N-I-Q-P-M'nin bir serbest parametresi vardır: hesaplamanın merkezlendiği sağ alan görüntü yığınıyla ilgili düzlemdir.Bu merkezi odak düzlemi, pseudo DIC ve gerçek DIC görüntüleri mümkün olduğunca benzer görünene kadar ayarlanmalıdır. Burada, 0.9 illumination NA ile alınmış hücreye ait odak dışı bir pseudo DIC görüntüsü, optimal bir pseudo DIC görüntüsü ve karşılık gelen DIC görüntüsü sunulmuştur. İlginçtir ki, bu panellerde gösterildiği üzere, en iyi faz haritası ve buna karşılık gelen pseudo DIC görüntüsü, mutlaka odaklanmış bir bright field görüntüsüne karşılık gelmeyebilir.Son olarak, burada NA eşittir 0.9 aydınlatma altında odaklama görüntüleri aracılığıyla DIC'den H-T-D-I-C görüntü işleme algoritımının adımları gösterilmiştir; DIC görüntülerinin taban kabartısını gidermek için Hilbert dönüşümü gerçekleştirilir. Bu işlem, yüksek geçiren filtreleme ile giderilebilen optik eksen boyunca bir miktar bulanıklığa neden olur. Bu son görüntüler, toplam hücresel hacmi belirlemek için örneğin her bir kesit düzlemindeki alanı saptamak amacıyla kolayca segmente edilir.Bu prosedürü uygularken, işlem sonrası aydınlık alan veya diferansiyel kontrast görüntüleme için doğru aydınlatmanın hatırlanması önemlidir. Numunenin yoğunluk haritaları ile kuvvet haritalarının kolokalizasyonunu kullanarak ek soruları yanıtlamak için floresan mikroskopi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz Gabor gibi tek bir canlı hücre içinde hücre içi dinamiklerini ölçmek için filtreleme dayalı bir karanlık alan mikroskobu yöntemi göstermektedir. Teknik mitokondriyal parçalanma gibi organellerin yapısında değişiklikler, duyarlı.

İki Boyutlu Gabor Filtreler dayanarak Optik Scatter Mikroskopi

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Objektif-ücretsiz video mikroskobu hücre kültürleri doğrudan kuluçka makinesi içinde izlemek sağlar. Burada biz almak ve kültürlü HeLa hücreleri 2,7 gün uzun edinimi çözümlemek için kullanılan tam iletişim kuralı tanımlamak, 2.2 x 10 bir veri kümesi için önde gelen6 ölçümleri tek hücre morfolojisi ve 10584 hücre döngüsü izler.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Burada, hücrelerin reolojik özelliklerini ölçmek için optik cımbız ve defokus mikroskobuna dayanan entegre bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, değişken fizyo-patolojik koşullar altında eritrositlerin viskoelastik özelliklerinin incelenmesinde geniş uygulanabilirliğe sahiptir.

Kırmızı Kan Hücrelerinin Viskoelastik Özelliklerinin Optik Cımbız ve Bulanıklaştırma Mikroskobu Kullanılarak Kantitatif Analizi

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Optik çözünürlüklü foto akustik mikroskobu (OR-PAM), görüntüleme optik soğurma yeteneğine sahip gelişmekte olan bir teknoloji...

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

, Zaman içinde canlı organizmaların hücre füzyon izlemek için bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşım kullanır...

Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em

Öğrenin hücresel kütle, hacim ve yoğunluk ölçümü için standart optik mikroskop kullanarak canlı hücre analizi yapmayı. Bu yöntem boyama ve sabitleme gerektirmez.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Daha fazla video keşfet