Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Bu prosedürün genel amacı, standart bir optik mikroskop ve görüntü işleme kullanarak, kütle ve hacim dahil olmak üzere hücresel örneklerin temel fiziksel özelliklerini nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle cam lameller üzerinde büyütülen hücresel örneklerin mikroskop lamlarına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, odak boyunca parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri elde edilir.

Ardından, her bir Z yığını görüntüsü, fiziksel verileri çıkaran ayrı MATLAB görüntü işleme programlarına girdi olarak verilir. Nihayetinde, hücre örneklerinin temel fiziksel özellikleri; parlak alan kontrastı ve diferansiyel girişim kontrastlı mikroskopi altında, odak boyunca yoğunluk ölçümleri kullanılarak elde edilir. Bu tekniğin floresan mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre örneklerinin fikse edilmesi, permeabilize edilmesi veya boyanması gerekmemesidir.

Bu yöntem, hücre döngüsü sırasında veya bir hastalık durumuna katkıda bulunan farklı hücre popülasyonları arasında hücre altı yoğunluğun nasıl organize olduğu gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hem DIC hem de parlak alan özelliklerine sahip bir mikroskobu, metin protokolündeki ek özelliklere göre kullanarak, öncelikle slayt kitabı yazılımını açarak ve görüntü toplama için yeni bir slayt oluşturarak başlayın. Ardından, odaklama penceresini açın ve filtre ayarları bölümünden DIC'yi seçin. Mikroskop sekmesindeki kondenser bölümünde, açıklık kaydırma çubuğunu en sağ konuma getirin. Bu işlem, yüksek sayısal açıklıklı aydınlatma sağlar ve örneğin optik kesitlenmesini geliştirir.

Numunenin DIC yığınını yakaladıktan sonra odak penceresini açın ve "open" seçeneğini belirleyin. Filtre seti bölümünde, düşük NA aydınlatma sağlamak için diyafram kaydırıcı çubuğu en sol konumuna getirerek tamamen kapatın. Sinyal yoğunluğunu ayarladıktan sonra görüntü yakalama penceresini açın.

DICZ yığın alımından elde edilen 3D yakalama ayarları, görüntü yakalama penceresinin filtre seti bölümünde görüntülenecektir. Açık kutucuğu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü bilgisi bölümünde görüntüye isim verin ve Zack görüntü alımını başlatmak için başlat'ı seçin.

Ardından, H-T-D-I-C MATLAB programı olan JoVE HT DCO V one M'de hacim ölçümleri gerçekleştirmek için metin protokolüne göre Z yığınlarını dışa aktarın. Sıfırıncı bölümde, gezginden hilbert. Transform DM ve sobel edge Detect M dosyalarını içeren dizini kopyalayıp yapıştırarak dependencies directory değişkenini güncelleyin. dependencies directory = ifadesinden sonraki tek tırnakların arasına yapıştırın ve joco HT DCO V one M programının sıfırıncı bölümünü çalıştırın.

Birinci bölümde, odak boyunca alınan görüntülerin dot TIF formatındaki dizinini kopyalayıp yapıştırarak görüntü dizinini güncelleyin. Görüntüleri hizalamak ve döndürmek için tek tırnaklar arasındaki bu bölümü yalnızca bir kez çalıştırın. Hilbert dönüşümü için kodun ikinci bölümünü çalıştırın; "Define HT DIC parameters" başlıklı bir iletişim kutusu görünecektir.

Ardından, örneğin DIC görüntüsünün odakta olduğu odak düzlemi numarasını, lateral çözünürlüğü, aksiyal çözünürlüğü, hilbert dönüşümünü gerçekleştirmek için gereken DIC görüntüsünün rotasyon açısını ve son olarak ilgi alanı boyutunu girin. Sonra Tamam'a tıklayın. Belirtilen odak düzlemi numarasına ait DIC odak düzlemi görüntüsü, üzerinde mavi bir kutuyla birlikte görünecektir.

Kutuyu, bir hücre gibi ilgilenilen özelliğin üzerine yerleştirin. Kutu istenen bölgeye yerleştirildiğinde, B'nin içine çift tıklayın. Görüntünün kontrastı, koyu özelliklerin solda, parlak özelliklerin ise sağda görüneceği şekilde olmalıdır. Mavi kutuyu ilgilenilen bölgenin üzerine sürükleyin ve gerektiğinde yeniden şekillendirin.

Ardından, üçüncü bölüm altında, dikdörtgen bir maske oluşturmak için 167. satırın başındaki yorum işaretini kaldırın ve 170. satırı yorum satırı haline getirin; görüntünün içine tıklayıp fareyi sürükleyerek dikdörtgen maskeyi tanımlamaya başlayarak programın üçüncü bölümünü çalıştırın. Daha sonra, onaylamak için kutucuğa çift tıklayın. El ile çizilmiş bir maske oluşturmak için, üçüncü bölümü çalıştırmadan önce 167. satırı yorum satırı haline getirin ve 170. satırın başındaki yorum işaretini kaldırın; fare ile tıklayıp istenen maskeyi çizdikten sonra, onaylamak için maskeye çift tıklayın. Dördüncü bölümü çalıştırdıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak Hilbert dönüştürülmüş görüntü yığınlarını oluşturmak için beşinci bölümü çalıştırın.

İlgi bölgesinin xz kesit görüntülerinin görüntü segmentasyonunu optimize etmek için, program tarafından üretilen Şekil 500'de üç farklı kontrast tipi görünmektedir. Algoritmanın hücre sınırlarını bulmadaki başarısı, kullanılan maske ve programın 2, 2, 9. satırındaki eşik değerinin kombinasyonuna bağlıdır; 0.5 değeri ile başlayın ve sütunlardan birinde uygun çerçeveleme elde edilene kadar eşik değerini ayarlayıp programın bu bölümünü yeniden çalıştırın.

Eğer ana hat belirleme işlemi birinci sütunda en iyi sonucu verdiyse, DIC segmentasyonunda hacmi belirlemek için altıncı bölümü kullanın. Eğer ikinci sütun optimal sonuçlar verdiyse, hilbert'ten hücre hacmini belirlemek için yedinci bölümü çalıştırın; eğer üçüncü sütun optimal sonuçları verdiyse, hacmi belirlemek için sekizinci bölümü çalıştırırken forer filtrelenmiş hilbert dönüşümü DIC görüntülerini kullanın. NIQ PM MATLAB programında kütle ölçümleri almak için sıfırıncı bölüm altında JO VCO NI qpm V1 M başlıklı işlemi gerçekleştirin. Birinci bölümü çalıştırdıktan sonra üç dizin bağımlılığının, BRIGHTFIELD ve DIC dizininin konumunu güncelleyin; "define N-I-Q-P-M parameters" başlıklı diyalog kutusunda ikinci bölümü çalıştırarak örneğin parlak alan görüntüsünün odakta olduğu odak düzlemi numarasını, yanal çözünürlüğü, eksenel çözünürlüğü ve ilgi alanı boyutunu girin.

Ardından Tamam'a tıklayın. Belirtilen odak düzlemi numarasına ait brightfield odak düzleminin görüntüsü mavi bir kutuyla birlikte görünecektir. Gerekirse ikinci bölümü tekrar çalıştırarak odağı ayarladıktan sonra, kutuyu görüntü üzerinde sürükleyin, kutunun düğümlerini seçip yeniden boyutlandırmak için sürükleyin ve ardından onaylamak için kutunun içine çift tıklayın.

Üçüncü bölüm çalıştırılarak bir parlak alan görüntü yığını oluşturulduktan sonra, faz haritasını, pseudo DIC görüntülerini ve bunları parlak alan görüntüleri ile gerçek DIC görüntüsüyle karşılaştırmaları üretmek için dördüncü bölümü çalıştırın; pseudo DIC ve gerçek DIC görüntüleri birbirine mümkün olduğunca benzediğinde, kullanıcının hücrenin etrafını çizerek kütle yoğunluk haritasını, toplam kütleyi ve hücre yoğunluğu histogramını doğru şekilde oluşturmasını sağlayan beş A veya beş B bölümünü çalıştırın. Odak boyunca görüntü alımı sırasında örnek aydınlatması, N-I-Q-P-M ve H-T-D-I-C algoritmasının başarılı bir şekilde uygulanması için kritiktir. Bu şekil, bir polistiren küre ve insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı SW six 20 için hem DIC hem de parlak alan kontrastı altında düşük ve yüksek NA aydınlatmasını göstermektedir.

Bu paneller N-I-Q-P-M için optimal görüntülemeyi, bunlar ise HT DIC için optimal görüntülemeyi göstermektedir. Bu görüntüler, hem başarılı hem de başarısız uygulamaları vurgulayarak NIQ PM algoritmasının parametre bağımlılığını kanıtlamaktadır. Burada, 4.8 µm çapındaki bir polistiren kürenin faz profilini inceliyoruz.

Beklenen profil teorik olarak bilinmektedir ve bu nedenle NIQ PM rekonstrüksiyonu ile doğrudan karşılaştırılabilir. Bu paneller, küre difraksiyon etkileri için elde edilebilecek en iyi rekonstrüksiyonu sunmaktadır; kürenin hem sınırlarında hem de içinde meydana gelen etkiler, küre üzerindeki tüm noktalarda stabil rekonstrüksiyonu engeller. Kürenin merkez bölgesi, Panel L'de görüldüğü üzere %1 ile %5 arası bir yüzde hata ile N-I-Q-P-M ile yakalanabilir; burada faz özellikleri bilinmeyen hücresel örnekler yer almaktadır.

A priori, pseudo DIC görüntüsü ile gerçek bir DIC görüntüsünü karşılaştırmaya yönelik bir prosedürle birlikte NIQ PMM kullanılarak yeniden oluşturulabilir. N-I-Q-P-M'nin bir serbest parametresi vardır: hesaplamanın merkezlendiği sağ alan görüntü yığınıyla ilgili düzlemdir.

Bu merkezi odak düzlemi, pseudo DIC ve gerçek DIC görüntüleri mümkün olduğunca benzer görünene kadar ayarlanmalıdır. Burada, 0.9 illumination NA ile alınmış hücreye ait odak dışı bir pseudo DIC görüntüsü, optimal bir pseudo DIC görüntüsü ve karşılık gelen DIC görüntüsü sunulmuştur. İlginçtir ki, bu panellerde gösterildiği üzere, en iyi faz haritası ve buna karşılık gelen pseudo DIC görüntüsü, mutlaka odaklanmış bir bright field görüntüsüne karşılık gelmeyebilir.

Son olarak, burada NA eşittir 0.9 aydınlatma altında odaklama görüntüleri aracılığıyla DIC'den H-T-D-I-C görüntü işleme algoritımının adımları gösterilmiştir; DIC görüntülerinin taban kabartısını gidermek için Hilbert dönüşümü gerçekleştirilir. Bu işlem, yüksek geçiren filtreleme ile giderilebilen optik eksen boyunca bir miktar bulanıklığa neden olur. Bu son görüntüler, toplam hücresel hacmi belirlemek için örneğin her bir kesit düzlemindeki alanı saptamak amacıyla kolayca segmente edilir.

Bu prosedürü uygularken, işlem sonrası aydınlık alan veya diferansiyel kontrast görüntüleme için doğru aydınlatmanın hatırlanması önemlidir. Numunenin yoğunluk haritaları ile kuvvet haritalarının kolokalizasyonunu kullanarak ek soruları yanıtlamak için floresan mikroskopi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.