Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Bu prosedürün genel amacı, standart bir optik mikroskop ve görüntü işleme ile kütle ve hacim dahil olmak üzere hücresel örneklerin temel fiziksel özelliklerini ölçmektir. Bu, önce cam kapak astarları üzerinde büyütülen hücresel örneklerin mikroskop slaytları üzerine monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra odak, parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri elde edilir.

Daha sonra her bir Z görüntü yığını, fiziksel verileri çıkaran ayrı MATLAB görüntü işleme programlarına girilir. Sonuç olarak, hücresel örneklerin temel fiziksel özellikleri, parlak alan kontrastı ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında odak yoğunluğu ölçümleri kullanılarak elde edilir. Bu tekniğin floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücresel örneklerin sabitlenmesine, nüfuz etmesine veya boyanmasına gerek olmamasıdır.

Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin hücre döngüsü sırasında veya bir hastalık durumuna katkıda bulunan farklı hücre popülasyonları arasında hücre altı yoğunluğunun nasıl organize edildiği Hem DIC hem de parlak alan özelliklerine ve metin protokolüne göre ek özelliklere sahip bir mikroskop kullanarak, slayt kitabı yazılımını açarak ve görüntü toplama için yeni bir slayt oluşturarak başlayın. Ardından, odak penceresini açın ve filtre seti bölümünün altında DIC'yi seçin Kondansatör bölümünün altındaki kapsam sekmesinde diyafram kaydırma çubuğunu en sağ konuma ayarlayın. Bu, yüksek sayısal açıklık aydınlatması sağlar ve numunenin optik kesitini geliştirir.

Örneğin bir DIC yığınını yakaladıktan sonra odak penceresini açın ve aç'ı seçin. Filtre seti bölümünün altında, düşük NA aydınlatması sağlamak için diyafram kaydırma çubuğunu en sol konuma, tamamen kapalı olacak şekilde ayarlayın. Sinyal yoğunluğunu ayarladıktan sonra, görüntü yakalama penceresini açın.

DICZ yığın alımından elde edilen 3D yakalama ayarları, görüntü yakalama penceresinin filtre seti bölümünde görüntülenecektir. Açık kutuyu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü bilgileri bölümünde, görüntüyü adlandırın ve Zack görüntü alımını başlatmak için başlat'ı seçin.

Ardından, JoVE HT DCO V one M başlıklı H-T-D-I-C MATLAB programında bir kez hacim ölçümleri yapmak için Z yığınlarını metin protokolüne göre dışa aktarın Sıfır bölümünün altında, hilbert'i içeren dizini kopyalayıp yapıştırarak bağımlılıklar dizin değişkenini güncelleyin. DM ve sobel edge'i dönüştürün Explorer'dan M dosyalarını algılayın. Aşağıdaki bağımlılık dizini olan tek tırnak işaretleri arasında, joco HT DCO V one M programının yürütme bölümü sıfıra eşittir.

Birinci bölümde, odak odak görüntülerini içeren dizini nokta TIF biçiminde kopyalayıp yapıştırarak görüntüler dizinini güncelleyin. Tek tırnak işaretleri arasında, görüntüleri hizalamak ve döndürmek için bu bölümü yalnızca bir kez çalıştırın. Hilbert dönüşümü çalıştırması için kodun ikinci bölümü HT DIC parametrelerini tanımla başlıklı bir iletişim kutusu görünecektir.

Ardından, numunenin DIC görüntüsünün odakta olduğu odak düzlemi numarasını, yanal çözünürlüğü, eksenel çözünürlüğü, hilbert dönüşümünü gerçekleştirmek için gereken DIC görüntüsünün dönüş açısını ve son olarak ilgilenilen bölge boyutunu girin. Ardından Tamam'ı tıklayın. Odak düzlemi numarası tarafından belirtilen DIC odak düzleminin bir görüntüsü mavi bir kutu ile görünecektir.

Kutuyu, hücre gibi ilgilenilen özelliğin üzerine getirin. Kutu istenen bölgenin üzerine yerleştirildikten sonra, B'nin içine çift tıklayın.Görüntünün kontrastı, koyu özellikler solda, parlak özellikler sağda görünecek şekilde olmalıdır. Mavi kutuyu ilgilendiğiniz bölgenin üzerine sürükleyin ve gerektiği gibi yeniden şekillendirin.

Ardından, üçüncü bölümün altında, dikdörtgen bir maske oluşturmak için, yorum satırı 1 6 7 ve yorum satırı 1 7 0 görüntüyü tıklatarak ve dikdörtgen maskeyi tanımlamaya başlamak için fareyi sürükleyerek programın üçüncü bölümünü yürütün. Ardından kabul etmek için kutuya çift tıklayın. Elle çizilmiş bir maske oluşturmak için, yorum satırı 1 6 7 ve yorum satırını kaldır 1 7 0 üçüncü bölümü yürütmeden önce İstenilen maskeyi fare ile tıklayıp çizerek, dördüncü bölümü çalıştırdıktan sonra kabul etmek için maskeye çift tıklayın, metin protokolüne göre hilbert dönüştürülmüş görüntü yığınları oluşturmak için beşinci bölümü çalıştırır.

İlgilenilen bölgenin xz kesit görüntülerinin görüntü segmentasyonunu optimize etmek. Program tarafından üretilen Şekil 500, üç farklı kontrast türü göstererek görünür. Hücrenin sınırlarını bulmak için algoritmanın başarısı, kullanılan maskenin bir kombinasyonuna ve programın 2, 2, 9. satırındaki eşik değerinin bir kombinasyonuna bağlıdır, 0.5 değeriyle başlar ve eşiğin değerini ayarlar ve sütunlardan birinde uygun anahat elde edilene kadar programın bu bölümünü yeniden çalıştırır.

Anahat birinci sütunda en iyisiyse, DIC segmentasyonunda, hacmi belirlemek için altıncı bölümü kullanın. İkinci sütun en iyi sonuçları verdiyse, hilbert'ten hücre hacmini belirlemek için yedinci bölümü çalıştırın, üçüncü sütun en iyi sonuçları verdiyse, sekizinci bölümü çalıştırırken forer filtreli hilbert dönüşümü DIC görüntülerini kullanın, NIQ PM MATLAB programında kütle ölçümleri almak için hacmi belirlemek için ve JO VCO NI qpm V1 M Sıfır bölümünün altında başlıklı. Birinci bölümü çalıştırdıktan sonra üç dizin bağımlılığının, BRIGHTFIELD ve DIC dizininin konumunu güncelleyin, N-I-Q-P-M parametrelerini tanımla başlıklı diyalog kutusuna ikinci bölümü çalıştırın, örneğin parlak alan görüntüsünün odakta olduğu odak düzlemi numarasını, yanal çözünürlüğü, eksenel çözünürlüğü ve ilgilenilen bölge boyutunu girin.

Ardından Tamam'ı tıklayın. Odak düzlemi numarası tarafından belirtilen parlak alan odak düzleminin bir görüntüsü mavi bir kutu ile görünecektir. Gerekirse ikinci bölümü yeniden çalıştırarak odağı ayarladıktan sonra, kutuyu görüntünün etrafına sürükleyin ve kutunun düğümlerini seçin ve kabul etmek için kutunun içine çift tıklamadan önce yeniden boyutlandırmak için sürükleyin.

Üçüncü bölüm çalıştırılarak bir parlak alan görüntüleri yığını oluşturulduktan sonra, faz haritasını, sahte DIC görüntülerini ve parlak alan görüntüleri ve gerçek DIC görüntüsüyle karşılaştırmaları oluşturmak için dördüncü bölümü çalıştırın Sahte DIC ve gerçek DIC görüntüleri mümkün olduğunca benzer olduğunda, kullanıcının kütle yoğunluğu haritasını oluşturmak için hücrenin ana hatlarını çizmesine olanak tanıyan beşinci A veya beş B bölümünü çalıştırın, Hücre yoğunluğunun toplam kütlesi ve histogramı doğru. Odak görüntüsü alımı sırasında örnek aydınlatma, N-I-Q-P-M ve H-T-D-I-C algoritmasının başarılı bir şekilde uygulanması için kritik öneme sahiptir. Bu şekil, bir polistiren küre ve insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı SW six 20 için hem DIC hem de parlak alan kontrastı altında düşük ve yüksek NA aydınlatmasını göstermektedir.

Bu paneller N-I-Q-P-M için en uygun görüntülemeyi gösterir ve bunlar HT DIC için en uygun görüntülemeyi gösterir. Bu görüntüler, hem başarılı hem de başarısız uygulamaları vurgulayan NIQ PM algoritmasının parametre bağımlılığını göstermektedir. Burada 4.8 mikrometre çapında bir polistiren kürenin faz profilini keşfediyoruz.

Beklenen profil teorik olarak bilinir ve bu nedenle doğrudan NIQ PM rekonstrüksiyonu ile karşılaştırılabilir. Bu paneller, kürenin hem sınırlarında hem de iç kısımlarında küre kırınım etkileri için elde edilebilecek en iyi rekonstrüksiyonu sunar ve küre üzerindeki tüm noktalarda kararlı rekonstrüksiyonu önler. Kürenin merkezi bölgesi, faz özellikleri bilinmeyen Panel L hücresel örneklerinde görüldüğü gibi, yüzde bir ila %5'lik bir hata ile N-I-Q-P-M ile yakalanabilir.

A priori, sahte bir DIC görüntüsünü gerçek bir DIC görüntüsüyle karşılaştırmak için bir prosedürle birlikte NIQ PMM kullanılarak yeniden yapılandırılabilir. N-I-Q-P-M'nin bir serbest parametresi vardır. Hesaplamanın ortalandığı sağ alan görüntü yığınındaki düzlem.

Bu merkezi odak düzlemi, sahte DIC ve gerçek DIC görüntüleri mümkün olduğunca benzer görünene kadar ayarlanmalıdır. Burada, odak dışı bir sözde DIC görüntüsü, optimal bir sözde DIC görüntüsü ve 0.9'luk bir aydınlatma NA ile çekilen hücrenin karşılık gelen DIC görüntüsü sunulmaktadır. İlginç bir şekilde, en iyi faz haritası ve karşılık gelen sahte DIC görüntüsü, bu panellerde gösterildiği gibi odaktaki bir parlak alan görüntüsüne karşılık gelmek zorunda değildir.

Son olarak, burada H-T-D-I-C görüntü işleme algoritmasında yer alan adımlar, NA'nın 0.9 aydınlatmaya eşit olduğu odak görüntüleri aracılığıyla DIC'den gösterilmiştir, DIC görüntülerinin temel kabartmasını çıkarmak için hilbert dönüşümü gerçekleştirilir. Bu, optik eksen boyunca yüksek geçişli forer filtrelemeden çıkarılabilen bir miktar bulanıklık ile birlikte gelir. Bu son görüntüler, toplam hücresel hacmi çıkarmak için numunenin her bir kesit düzlemindeki alanı belirlemek için kolayca bölümlere ayrılır.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben parlak alan cevheri diferansiyel kontrast görüntüleme için doğru aydınlatmayı hatırlamak önemlidir. Floresan mikroskobu gibi diğer yöntemler, numunenin yoğunluk haritaları ile zemin kuvvetinin kolokalizasyonu kullanılarak ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.