MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Bu mikronötralizasyon testinin genel amacı, MDCK-SIAT1 hücreleri kullanılarak insan serumlarında çağdaş H3N2 İnfluenza virüslerine karşı nötralize edici antikor tepkilerini ölçmektir. Bu yöntem, influenza bağışıklığını değerlendirmek için temel soruları cevaplamak için kullanılabilir. Örneğin, grip aşısının, enfeksiyonu önlemek için dolaşımdaki H3N2 virüslerine karşı yeterli nötralize edici antikor tepkilerini indükleyip indüklemediğini belirleyebilir.

Bu tekniğin ana avantajı, H3N2 influenza virüslerinin antijenik kümelerini sıfırlamak için antikor yanıtlarını tespit etmek için MDCK-SIAT1 hücrelerini ve mikronötralizasyon testlerini kullanmasıdır. Virüs stokları, mikronötralizasyon deneylerinde kullanılmadan önce yüksek enfeksiyöz titrelere yayılmalıdır. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi MDCK-SIAT1 hücrelerinde AH3N2 virüslerinin yayılmasıyla başlayın.

Birinci gün, bir şişe virüsü oda sıcaklığında çözün ve virüsü hemen buzun üzerine yerleştirin. Virüsü iki farklı başlangıç seyreltmesinde test etmek için, önce 10:2 ön seyreltme için 99 mililitre virüs seyrelticiye 100 mikrolitre virüs ekleyin. Daha sonra 10:3 ön seyreltme için 1 mililitre 10:2 ön seyreltmeyi 9 mililitre virüs seyrelticiye ekleyin.

İki mikrotitre plakası kullanarak, 96 kuyulu mikrotitre plakasının birinci sütunu hariç tüm kuyucuklara 100 mikrolitre mikro seyreltici ekleyin. Ardından, yarım günlük 10 seyreltme gerçekleştirin. Birinci sütundaki tüm kuyucuklara seyreltmeye başlayan 146 mikrolitre virüs ekleyin ve 46 mikrolitreyi birinci sütundan on birinci sütuna seri olarak aktarın.

Sütunlar arasında pipet uçlarını değiştirin. On birinci sütunu karıştırdıktan sonra, uçları 46 mikrolitre seyreltme ile atın. Yalnızca virüs seyreltici içeren hücre kontrolü olarak on ikinci sütunu kullanın.

Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte bir saat inkübe edin. MDCK-SIAT1 hücrelerini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Mikrotitre plakalarının her bir oyuğuna 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre ekleyin.

Ve plakaları örtün. Hücreleri 37 santigrat derecede, %5 karbondioksitte 18 ila 20 saat inkübe edin. İkinci günde, önce ortamı mikrotitre plakalarından çıkararak ELISA'yı gerçekleştirin.

Her kuyucuğu 200 mikrolitre PBS ile yıkadıktan sonra, her oyuğa 300 mikrolitre soğuk% 80 aseton ekleyin. Ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, sabitleyiciyi çıkarın.

Ve plakaların kurumasına izin verin. Daha sonra, anti-influenza A nükleoprotein monoklonal antikorunu, antikor seyrelticisindeki hedef konsantrasyona seyreltin. Plakaları 300 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

Daha sonra her oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İkincil antikor ilavesi için, HRP antikoruna konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG'yi antikor seyrelticisindeki hedef konsantrasyona seyreltin.

Plakaları 300 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeden önce her oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Daha sonra, plakaları 300 mikrolitre yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.

Ve tüy bırakmayan bir mendile dokunun. Her oyuğa 100 mikrolitre taze hazırlanmış alt tabaka ekleyin. Ve renk gelişimi doygunluğa ulaşana ve hücre kontrol kuyucuklarının optik yoğunluğu veya OD'si 0.2'den az olana kadar oda sıcaklığında inkübe edin.

Ardından tüm kuyucuklara 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak kuyuların OD'sini 490 nanometrede okuyun. Metin protokolünde açıklandığı gibi Reed-Muench yöntemini kullanarak virüsün TCID50'sini hesaplayın.

MN testinin birinci gününde, serumları 37 santigrat derece su banyosunda çözdürün ve çözüldükten hemen sonra çıkarın. İnsan serumlarını metin protokolünde anlatıldığı gibi 56 santigrat derece su banyosunda 30 dakika ısıtın ve aktive edin. Daha sonra serumları buzun üzerine yerleştirin ve 1:10 ön seyreltme elde etmek için virüs seyrelticiyi seruma ekleyin.

Bir virüsle test etmek için, 11 ve 12 numaralı sütunlar hariç B'den H'ye kadar olan satırlara 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Daha sonra, A1'den A10'a kadar olan sütunlara 100 mikrolitre 1:10 seyreltilmiş serum ekleyin. A'dan H'ye kadar iki katlı seri seyreltme gerçekleştirin ve H satırındaki son 50 mikrolitreyi atın.Virüs kontrolü için A12, B12, C12 ve D12 kuyularına 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin.

Hücre kontrolü için E12, F12, G12 ve H12 kuyularına 100 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Kontrol serumları için, 100 mikrolitre seyreltilmiş kontrol serumunu A sütununa 11 numaralı kuyuya ekleyin. Ve B11'den H11'e kadar olan kuyulara 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin.

Seri seyreltmeye devam edin. Plakaları örtün ve virüs ilavesi için hazır olana kadar 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin. Virüs ilavesi için, virüsü virüs seyreltici ile 50 mikrolitrede 100 TCID50'ye seyreltin.

Arka titrasyon plakalarındaki sütun 11 ve tüm plakalardaki hücre kontrol kuyuları, E12, F12, G12 ve H12 hariç tüm kuyucuklara 50 mikrolitre seyreltilmiş virüs ekleyin. Sütun 11'deki tüm kuyucuklara 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Daha sonra ilk kuyucuğa 50 mikrolitre içinde 100 TCID50'de 50 mikrolitre virüs ekleyin.

Daha sonra, iki katlı seri seyreltme gerçekleştirmek için 50 mikrolitreyi karıştırın ve ardışık kuyucuklara aktarın. Virüs taşınmasını önlemek için pipet uçlarını kuyucuklar arasında değiştirin. H11 kuyusundan 50 mikrolitre atın.

Ardından, son hacmi 100 mikrolitreye getirmek için sütun 11'e 50 mikrolitre virüs seyreltici ekleyin. Karıştırmak için plakalara dokunun. Plakaları 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte bir saat boyunca inkübe edin, daha önce olduğu gibi birinci gün MDCK hücre ilavesi ve ikinci gün ELISA gerçekleştirmeden önce.

Birincil ve ikincil antikorları ekledikten sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, substrat ekleme ve plaka okuması gerçekleştirin. Plakaları 300 mikrolitre yıkama tamponu ile beş kez yıkayın ve tüy bırakmayan bir mendil üzerine hafifçe vurun. Her oyuğa 100 mikrolitre taze hazırlanmış OPD substratı ekleyin.

Daha sonra, virüs kontrol kuyuları 0,8 ila 3 arasında 490 nanometrede bir optik yoğunluğa ulaşana kadar plakaları oda sıcaklığında inkübe edin ve hücre kontrolü 0,2'den daha düşük bir arka plan OD'sinde olsun. Daha sonra, tüm kuyucuklara 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak kuyuların OD'sini 490 nanometrede okuyun.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi her serum örneğinin nötralize edici antikor titresini belirleyin. Mikronötralizasyon testlerinin temsili sonuçları burada gösterilmektedir. Her bir oyuktaki OD, nötralize edici antikorlar içeren seri olarak seyreltilmiş serumların varlığında MDCK-SIAT1 hücrelerinde virüs enfeksiyonu ve replikasyon miktarını temsil eder.

% 50 nötralizasyon sınırı, virüs kontrol kuyucuklarının medyan OD'si artı hücre kontrol kuyularının medyan OD'si olarak tanımlanır, ikiye bölünür,% 50'ye eşit veya daha fazla nötralizasyona ulaşan en yüksek serum seyreltmesinin tersi, serum numunesi için antikor titresi olarak kabul edilir. Bu örnekte, iki hastadan influenza aşısı öncesi ve sonrası toplanan eşleştirilmiş serumlar, 2016-2017 influenza sezonu boyunca aşıda kullanılan H3N2 virüsüne karşı test edildi. Hasta 1 aşılama öncesi serumlarda, serum dilüsyonlarının hiçbiri virüs enfeksiyonunu inhibe etmedi ve bu nedenle negatif olarak kabul edilir.

Aşılamayı takiben, bu hastadan alınan serumlar nötralizasyon gösterdi. Bu serumdan elde edilen üçüncü seyreltme,% 50'lik sınırın altındaki en yüksek seyreltmedir, bu nedenle bu hastanın aşılama sonrası titresi 40'tır. Buna karşılık, ikinci hasta ön aşılamasından elde edilen serum, 320'lik bir titrede önceden var olan nötralize edici antikorlar içerir.

Aşılamayı takiben, titre 1280'in üzerine çıktı. Bu durumda, serumun 1:10 ön seyreltilmesinde, hiçbir antikor uç titresi elde edilmedi. Serum, son titreyi elde etmek için daha yüksek bir ön seyreltmede yeniden test edilebilir.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanılarak yapılan mikronötralizasyon testleri, H3N2 influenza virüslerinin son antijenik kümeleri için nötralize edici antikor yanıtlarını tespit etmede oldukça hassas, spesifik ve sağlamdır. Düzenli MDCK hücreleri kullanılarak, bu prosedür aynı zamanda H3N2 virüslerinin diğer suşlarına ve influenza virüslerinin diğer alt tiplerine karşı antikor yanıtlarını tespit etmek, influenzaya karşı koruyucu bağışıklığı değerlendirmek için de kullanılabilir.