İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Bu elektrofizyolojik testin genel amacı, doğum sonrası gelişim sırasında koklear saç hücrelerinin morfolojik ve fonksiyonel değişikliklerini araştırmaktır. Bu yöntem, işitsel asistan departmanı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: İşitmenin başlangıcında saç hücrelerimiz işlevlerini ne zaman kazanır? Bu tekniğin ana avantajı, doğum sonrası sıçan yavrularından izole edilen bireysel saç hücrelerinin işlevini değerlendirebilmemizdir.

Prosedürü gösterenler, laboratuvarımızdan öğrenciler olan Wenlu Pan, Shasha Guo ve Nana Xu olacak. Bu işleme başlamak için, uyuşturulmuş hayvanı, hayvanın vücudunu hareketsiz hale getirmek için bir polietilen köpük kalıba yerleştirin. Ardından, hayvanı ses azaltıcı bir odada titreşim önleyici bir masaya yerleştirin.

Bir ısıtma yastığı ile hayvanın vücut ısısını 37,5 santigrat derecede tutun. Ardından, baş bölgesini %70 etanol ile silin. Referans elektrodu veya toprak elektrodunu yerleştirmek için dış kulak kepçesine ventral lateral olarak bir ila iki milimetrelik bir kesi yapın.

Ardından, kafatasının tepe noktasına bir subdermal kayıt elektrodu yerleştirin. Fonksiyon üretecini kullanarak, çeşitli frekans ve yoğunluklarda kalibre edilmiş ton patlamaları oluşturun. Ses uyaranlarını, hayvanın başından 10 santimetre uzakta bulunan elektrostatik bir hoparlör aracılığıyla iletin.

İşitsel beyin sapı yanıtlarını elde etmek için, ses ortaya çıkan potansiyeller filtrelenir, yükseltilir ve çok işlevli bir işlemci kullanılarak ortalaması alınır. 40 dakikalık ABR kaydı çevrimiçi olarak izlenir ve çevrimdışı analiz için saklanır. Bu bölümde, hayvanın kafasını %70 etanol püskürterek sterilize edin.

Ardından, kafatasını sagital orta hat boyunca makasla açın ve iç kulağı ortaya çıkarmak için beyni çıkarın. Ardından, iç kulağı üç mililitre buz gibi Leibovitz'in L-15 Medium'u ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, kokleanın kemikli kapsülünü çıkarmak için ince forseps kullanın.

Bundan sonra, modiolus'tan ilişkili OC ve SV'yi açın. SV'nin bazal kısmını forseps ile tutarak, tabandan tepeye doğru yavaşça gevşeterek OC'yi SV'den tamamen ayırın. Daha sonra, ince makas kullanarak OC'yi eşit şekilde üç parçaya kesin.

Bozulmayı ve doku bozulmasını en aza indirmek için tüm adımlar buz gibi L-15'te mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Bu adımda, 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, OC segmentlerini bir cam slayt üzerine aktarın. Dört santigrat derecede en az dört saat boyunca 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.

Bunu takiben, paraformaldehiti 100 mikrolitre taze PBS ile değiştirerek dokuyu yıkayın. Ardından, mendili her seferinde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, dokuyu PBS'de% 0.3 geçirgenlik ajanı ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, geçirgenlik maddesini atın ve dokuyu PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, dokuyu oda sıcaklığında% 10 normal keçi serumu ve PBS ile bir saat boyunca bloke edin. Dokuyu anti-prestin C terminal antikoru ve bloke edici solüsyon ile oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede iki saat inkübe edin.

Daha sonra, dokuyu her seferinde beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, dokuyu karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde Alexa 488 konjuge ikincil antikor ile inkübe edin. Dokuyu karanlıkta her seferinde beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, dokuyu karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rodamin phalloidin ile inkübe edin. Dokuyu karanlıkta beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, numuneyi montaj ortamı olan bir cam slayt üzerine monte edin.

405 nanometre, 488 nanometre ve 594 nanometre lazer kullanarak konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Bu prosedürde pipet çekiciyi ve mikro forger'ı kullanın. Uç çapı iki ila üç mikron olan yama pipetleri yapın.

Ardından, pipetleri hücre içi çözelti ile doldurun. 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, bir parça OC'yi 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Dokuyu 100 mikrolitre enzimatik sindirim ortamı ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca sindirin.

Daha sonra, enzimatik sindirim ortamını 100 mikrolitre L-15 ile değiştirin. Saç hücrelerini izole etmek için bir mikro neşter kullanarak dokuyu küçük parçalar halinde kesin. Nazik pipetlemeden sonra, hücreleri enzim içermeyen banyo solüsyonu ile doldurulmuş ev yapımı küçük bir plastik hazneye aktarın.

Ardından, odayı ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin ve sağlıklı görünen soliter OHC'leri bulun. Ardından, yama pipetini bir 700B'nin kafa aşamasına yükleyin amplifier. Yama pipetini dış saç hücresinin alt kısmına yerleştirin.

Bunu takiben, tüm hücre yaması, hücre gövdesinin yan duvarını kapatarak OHC'yi sıkıştırır. Hücre zarı yırtılana kadar hafif emme uygulayın. Ardından, tutma potansiyelini 70 milivolt olarak ayarlayın.

10 ila 17 megaohm arasında değişen erişim direncine ve 100 ila 500 megaohm arasında değişen zar direncine sahip hücreler, başarılı bir tam hücre konfigürasyonu olarak kabul edilir. Tüm hücre akımlarını ortaya çıkarmak için hücreye hiperpolarize edici ve depolarize edici voltaj uygulayın. Yama kelepçesi yazılımı tarafından kontrol edilen iki sinüs dalgası voltaj uyaran protokolü kullanarak OHC'lerin membran kapasitansını ölçün.

Uyarma voltaj aralığını 140 ila 110 milivolt arasında ayarlayın ve verileri çevrimdışı analiz için saklayın. Nazik sindirimden sonra, OHC'ler OC'den izole edildi. Tüm hücre voltaj klemp kayıtları, sıçan kokleasından akut olarak izole edilen OHC'lerden gerçekleştirildi. 140 ila 107 milivolt arasında değişen membran potansiyeline yanıt olarak izole edilmiş bir P9 OHC'den kaydedilen tüm hücre akımının temsili bir örneği burada gösterilmektedir.

Bu şekil, farklı yaşlardaki iki OHC'den elde edilen doğrusal olmayan membran kapasitansını göstermektedir. Kapasitans voltaj tepkileri Boltzmann fonksiyonuna uyarlandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, saç hücrelerindeki prestin gibi bazı proteinlerin ekspresyon seviyesinin değerlendirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için Western blotlama ve PCR gibi diğer önlemler alınabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, saç hücreleri alanındaki araştırmacıların koklear ve vestibüler sistemdeki elektrofizyolojik özellikleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, doğum sonrası gelişim sırasında koklear saç hücrelerinin morfolojik ve fonksiyonel değişikliklerini nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.