İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Bu yöntem, RNA biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin insan hücrelerinde RdRP veya TERT'in biyolojik önemi nedir? Bu tekniğin temel avantajı, bu testin hücrelerde eksprese edilen insan RdRP aktivitesini tespit etmek için ilk hassas yöntem olarak kurulmuş olmasıdır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi HeLa hücrelerinin hazırlanması ile başlayın.

Hücreleri bir kez 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 1.450 katında santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri nazikçe pipetleme ile parçalamak için 10 milyon hücre başına bir mililitre buz gibi soğuk Lysis Buffer A kullanın.

Numuneyi 1.5 mililitrelik bir tüpte 10 saniye boyunca% 25'lik bir sonikatör amplifikasyonunda sonikleştirin. Sonikasyonun ardından, numuneyi dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20, 400 kez yerçekiminde santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve süpernatanın her birini bir mililitreyi 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Bir mililitre lizat başına 40 mikrolitre önceden yıkanmış Protein A-agaroz boncuk ekleyerek lizatı önceden temizleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Ardından, numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika döndürün.

Numuneyi dört santigrat derecede bir dakika boyunca yerçekiminin 13.000 katında santrifüjleyin ve süpernatanı geri kazanın. Daha sonra, önceden temizlenmiş lizata 40 mikrolitre önceden yıkanmış Protein A-agaroz boncukları ve 10 mikrogram anti-insan TERT antikoru ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın ve numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede döndürün.

Dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 3.300 kez yerçekiminde santrifüjlemenin ardından süpernatanı çıkarın. Ardından, boncukları Wash Buffer One ile yıkayın. Boncuklara bir mililitre Wash Buffer One ekleyin ve tüpü ters çevirerek iyice karıştırın.

Ardından, numuneyi dört santigrat derecede beş dakika döndürün. Numuneyi dört santigrat derecede 30 saniye boyunca yerçekiminin 3.300 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve bu adımı üç kez daha tekrarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi AGC solüsyonu yıkamanın ardından, boncukları nazikçe pipetleme yoluyla 60 mikrolitre mikrokokal nükleaz reaksiyon karışımında yeniden süspanse ederek mikrokokal nükleaz ile muamele edin. Ardından, numuneyi Peltier tipi bir inkübatörde ayarlanmış bir çalkalayıcının döner tablası üzerinde 25 santigrat derecede 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Numuneyi dört santigrat derecede 30 saniye boyunca yerçekiminin 3.300 katı sıcaklıkta santrifüjledikten sonra süpernatanı çıkarın.

Son olarak, boncukları üç milimolar EGTA içeren bir AGC solüsyonu ile iki kez yıkayın ve boncukları metin protokolünde açıklandığı gibi Yıkama Tamponu İki ile bir kez yıkayın. RdRP reaksiyon karışımını metin protokolünde açıklandığı gibi yeni bir tüpte hazırlayın. Reaksiyon karışımına P dash 32 ile alfa fosfat grubu üzerinde etiketlenmiş altı mikrolitre üridin trifosfat ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.

Ardından, karışıma bir mikrolitre şablon RNA ekleyin ve iyice karıştırın. Elde edilen RdRP reaksiyon karışımından 20 mikrolitre ile boncukları yeniden süspanse edin. Daha sonra, numuneyi 32 santigrat derecede iki saat boyunca Peltier tipi bir inkübatöre yerleştirilmiş bir çalkalayıcının döner tablası üzerinde hafifçe çalkalayın.

İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımına mililitre başına 5.4 mikrolitre 20 miligram Proteinaz K ve 45.4 mikrolitre 2X Proteinaz K Tamponu ekleyin. Pipetleme ile karıştırın ve numuneyi Peltier tipi bir inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika çalkalayın. Numuneye 109.2 mikrolitre RNaz içermeyen su ekledikten sonra 200 mikrolitre asit fenol-kloroform ekleyin.

Numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca yerçekiminin 21, 100 katı sıcaklıkta santrifüjlemeden önce girdap ile iyice karıştırın. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.

Daha sonra sulu faza 20 mikrolitre üç molar sodyum asetat, pH 5.2, dört mikrolitre çökeltme taşıyıcı ve 250 mikrolitre etanol ekleyin. Karıştırmak için tüpü iyice çalkalayın. Numuneyi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yerçekiminin 21, 100 katı sıcaklıkta santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Daha sonra, peleti eksi 20 santigrat derecede saklanan hacim başına% 70 soğuk etanol ile yıkayın. Numuneyi dört santigrat derecede 15 dakika boyunca yerçekiminin 21, 100 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti havayla kurutun.

Peletleri 20 mikrolitre RNaz içermeyen suda tekrar süspanse edin. RNase reaksiyon karışımını metin protokolünde açıklandığı gibi yeni bir tüpte hazırlayın. Numuneye 180 mikrolitre RNase reaksiyon karışımı ekleyin.

Ardından, tüpü 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Numuneye hacim başına 2,3 mikrolitre hacim SDS ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, numuneye mililitre Proteinaz K başına 20 miligramlık iki mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika daha inkübe edin.

Şimdi, numuneye 205 mikrolitre asit fenol-kloroform ekleyin. Daha önce olduğu gibi karıştırdıktan ve santrifüjledikten sonra, sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Sulu faza üç molar sodyum asetat, çökeltme taşıyıcısı ve etanol ekleyin, ardından peleti daha önce yapıldığı gibi karıştırın, santrifüjleyin ve yıkayın.

Burada, manipüle edilmemiş hücreler için nokodazol veya DMSO ile tedavi edilen HeLa hücrelerinde IP-RdRP testinin üç temsili sonucu gösterilmiştir. Şablon olarak kimyasal olarak sentezlenmiş 34 nükleotidli bir RNA kullanıldı. Gece boyunca maruz kaldıktan sonra, RdRP ürünleri, özellikle mitotik faz içindeki HeLa hücrelerinde 20 ila 30 nükleotid arasında görülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan TERT'inin RdRP aktivitesini nasıl tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.