Name: Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin, farelerden beyaz yağ dokusu toplama ve yüksek kaliteli RNA izolasyonu yöntemini. Metabolizma ve gen ekspresyonu çalışmaları için güvenilir bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser diyabet Kanada tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC. Public Health. 9, 88(2009).</li>
<li>Wronska, A., Kmiec, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characteristics+of+various+white+adipose+tissue+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots.</a> Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).</li>
<li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue%3A+structural+and+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/246759856_RNA_Isolation_from_Adipose_Tissue_An_Optimized_Procedure_for_High_RNA_Yield_and_Integrity">RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity.</a> Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).</li>
<li>Cirera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+isolation+of+total+RNA+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue.</a> BMC Res Notes. 6, 472(2013).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+protein+extraction%3A+the+past+and+the+present%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.</a> J Biomed Biotechnol. 2009, 574398(2009).</li>
<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnol. 14, 94(2014).</li>
<li>Tan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+prorenin%2Frenin+receptor+on+the+development+of+obesity+and+associated+cardiometabolic+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver.+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors.</a> Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), 1-5 (2010).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+increases+in+circulating+prorenin+are+not+associated+with+renal+or+cardiac+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies.</a> Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).</li>
<li>Dusaulcy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-specific+disruption+of+autotaxin+enhances+nutritional+fattening+and+reduces+plasma+lysophosphatidic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid.</a> J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+a+link+between+obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease.</a> J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+RT-quantitative+PCR%3A+firsthand+observations+of+implementation+of+minimum+information+for+the+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments+%28MIQE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE).</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Aşağıdaki HF-diyet, beslenme obez fareler vücut ve beyaz yağ dokusu ağırlık N diyet beslenen fareler için karşılaştırıldığında artmıştır bulunmuştur. Fenol çözüm kullanarak çıkarılan RNA iyi saflığı ile örnekleri vermiştir. Leptin öncelikle yağ dokusu tarafından üretilen bir adipokine ve olumlu fat kitle16ile ilişkilendirmek için bilinir. Beklendiği gibi leptin mRNA ifade obez farelerde concomitance onların yağ kitlesi ile artmıştır.
Bu yöntem birkaç önemli adımlar vard...

Obezite tip 2 diyabet1gibi komplikasyonlara yol açabilir bir dünya çapında salgın var. Obezite ve onun ilişkili komplikasyonlar diyet kaynaklı obez ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri araştırma için sık kullanılır. Geleneksel olarak, beyaz yağ dokuları aşırı enerji için bir saklama bölmesi olarak bilinir ve kahverengi yağ dokusu enerji ısı2,3içine dönüştürünceye çoğunlukla lipidler oluşur. Yağ dokusu dinamiktir ve genişletilir ve gıda alımı ve fiziksel aktivite gibi birçok faktöre bağlı olarak küçültme. Bu nedenle, bu değişiklikler için katkıda bulunan etkenleri belirlemek için yeterli yağ dokusu toplama ve işleme gerekli4vardır.
Beyaz yağ dokular arasında subkutan ve viseral yağ depoları anatomik Lokalizasyon gibi farklı özelliklere sahip ve2,5işlev genel olarak kabul. Bu nedenle, çelişkili sonuçlar veya büyük değişkenlik önlemek için dikkat yağ yastıkları toplarken farklı bu yağ depoları arasında çapraz bulaşma önlemek için alınması gerekir.
Dahası, RNA veya protein fareler beyaz Yağ dokusundan izole zaman üç önemli sorunlar vardır. Farklı beyaz yağ depoları birbirinden ayıran sınır her zaman açık, diğer organlar böbrekler ve kalp6gibi aksine değildir gibi ilk olarak, obez farelerde yağ yastıkları toplama kolay bir iş değil. İkinci olarak, protein veya RNA izolasyon sırasında yağ dokusu yüksek lipid içeriği nedeniyle lipidler tabakası üst yüzen ve örnek için doğrudan erişimi engeller. Üçüncü olarak, kahverengi yağ dokusu veya diğer dokularda aksine, beyaz yağ dokusu önemli ölçüde daha düşük RNA ve protein içeriğe sahip ve bu genç fare kullanırken büyük endişe kaynağıdır, fareler bir normal (N) diyet beslenen ve için beklenen fareler var düşük yağ kütlesi (Yani KO modelleri, ilaçlar, tedavi egzersiz eğitim, vb.) 7 , 8.
Bu nedenle, RNA Yağ dokusundan izole etmek için uygun olan yöntemi seçimi önemlidir. Fenol/kloroform ayıklama için alternatif yöntemler ticari kitleri vardır. Onlar genellikle RNA arıtma tarafından takip sütun9tarihinde bir ilk fenol ayıklama adım temel alır. Ancak, bu kitleri normalde daha pahalı olduğunu ve RNA kalitesi değişken olabilir ise daha düşük verim, örnekleri vermek ama daha az zaman alıcı. Ancak, burada açıklanan fenol çözüm/kloroform çıkarma için en büyük avantajlarından biri RNA, DNA ve protein bir tek örnek10izole imkanı vardır. Çünkü fareler yağ yastıkları genellikle küçük ve RNA ve proteinler küçük miktar (özellikle yalın fare modellerinde) vermek, bu protokoller bir küçük bir örnek dışarı alabilirsiniz veri en üst düzeye çıkarmak.
Bu kağıt amacı üç fare beyaz yağ dokusu depoları hem de miktar ve RNA izolasyon kalitesi yeterli örnek koleksiyonundan emin olmak için bir yöntem ayrıntılı olarak tarif etmektir. Bu iletişim kuralı takip ederek elde RNA gerçek zamanlı PCR deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı kültürlü birincil adiposit RNA izolasyonu için tasarlanmamıştır.

<table><tbody><tr><td>1 mL seriingler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1X TE çözeltisi (10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA & bull; Na<alt>2</alt>. pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G iğneler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G iğneler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%75 Etanol Blok</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ısıtıcı (kuru banyo)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Termo bilimsel</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Termo bilimsel</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Termo bilimsel</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNaz I (1 U/&mikro; l)&nbsp;</td><td>Termo bilimsel</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Başlangıç Evrensel SYBR yeşil Master (Rox)</td> <td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı başlangıç evrensel SYBR yeşil ana (Rox) floresan boya&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Filtreli uçlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forseps&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Gazlı Bez</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çekiç</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek yağlı kemirgen diyeti</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Leptin ileri PCR astarı (5'-GGGCTTCACCATTCTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptin ters PCR astarı (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima Ters Transkriptaz (enzim ve 5x tampon)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Nanosaf su (ultra saf su olarak adlandırılır)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril muayene eldivenleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril eldivenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal kemirgen diyeti</td><td>Harlan Laboratuvarları, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol çözeltisi (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Önceden tanımlanmış alüminyum folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuvars spektrofotometre küvet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR tüp şeritleri</td><td></td><td></td><td></td>için raf</tr><tr><td>RT-PCR tüp şeritleri için raflar</td> Rastgele heksamerler<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR Rotor Gen sistemi&nbsp;</td><td>Corbett araştırma</td><td>RG-3000 Rotor-Gen termal döngüleyici</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı tezgah üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase İnhibitörü &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen 1,5 mL eppendorf tüpleri,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen 1,5 mL vidalı kapaklı tüpler,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen PCR tüp şeritleri (0,2 mL) ve kapaklar,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR makinesi</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR tüp şeritleri (0.1 mL) ve kapaklar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 ileri PCR astarı (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 ters PCR astarı (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik havan ve havaneli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi pedler</td><td>Ev yapımı tek kullanımlık emici bir alt pedle</td><td></td><td></td>sarılmış bir köpük levha</tr><tr><td>Cerrahi makas&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici ve nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tartı spatulası</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare yağ dokusu toplama ve işleme rna analizi için

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Çoğunlukla lipidler içerdiğinden diğer dokulara karşılaştırıldığında, beyaz yağ dokusu gibi gerçek zamanlı PCR ve Western Blot, karşıdan akış uygulamaları için bir önemli ölçüde daha az RNA ve protein içeriği vardır. Ek adımlar bu lipitlerin önlemek için gerektiğinde RNA izolasyon yağ dokusu örneklerinden de meydan okuyor. Burada, bu örnekler işlemek ve RNA izolasyon gerçekleştirmek için fare üç anatomik olarak farklı beyaz yağ dokuları toplamak için bir yordam mevcut. Biz daha fazla gerçek zamanlı PCR kullanarak cDNA ve gen ifade deneyleri sentezi tarif. Burada açıklanan protokol hayvanın saç ve kan yağ yastıkları yanı sıra doku toplama sırasında farklı yağ yastıkları arasında çapraz bulaşma kirlenme azalma sağlar. Bu da yeterli miktar ve çıkarılan RNA kalitesini sağlamak için optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı nerede yağ doku örnekleri gerçek zamanlı PCR gibi rutin deneyler için gerekli olan herhangi bir fare modeli için yaygın olarak uygulanabilir ama birincil adiposit hücre kültürü izolasyonu için uygun değildir.

Nekropsi yordamı izleyerek üç beyaz yağ dokuları toplanmış ve fareler (N ve HF diyet beslenen farelerin) iki grup ağırlıklı. Beklendiği gibi fareler HF diyet son vücut ağırlığı ve kilo alımı littermates N diyet (Tablo 1) göre artmıştı. Logosuna 2 kat artış PGF, PRF ve SCF ağırlığını obez farelerde N diyet'e kıyasla daha fazla bu gözlemler eşlik edildi.
İzole RNA ile herhangi bir deneyler gerçekleştirmeden önce s...

Bu kağıt amacı farklı beyaz yağ dokuları fareler toplamak, yağ örnekleri işlemek ve RNA ayıklamak için bir adım adım yordam sunmaktır.

Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Bu prosedürün genel amacı, farklı farelerden beyaz yağ dokusu depolarının yeterli örnek toplanmasını sağlamak ve dokudan yüksek miktarda iyi kaliteli RNA'yı izole etmektir. Bu yöntem, metabolizma, biyokimya ve moleküler biyoloji alanlarında, örneğin tedavi edilmiş veya genetik olarak değiştirilmiş farelerden alınan yağ dokusundaki gen ekspresyonu ile ilgili temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tipik olarak düşük RNA içeriğine sahip olan yağ dokusundan yüksek miktarlarda kaliteli RNA'nın izolasyonuna izin vermesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Emilie Pepin olacak. Bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, metin protokolüne göre cildi linea alba üzerinden kesin, ardından göğüs kafesinin ortasından sağ kola doğru ve sağ arka uzuvun üzerindeki genital organlara yakın yaklaşık iki santimetrelik iki kesi yapın. Açılan derinin bir köşesini gerin ve pedin üzerine sabitlemek için 22 gauge bir iğne kullanın.Ardından, diğer köşeyi sabitleyin. Cilde mümkün olduğunca düz bir şekilde yerleştirilmiş cerrahi makas kullanarak, abdominal deri altı yağının veya SCF'nin künt diseksiyonunu gerçekleştirin, ardından önceden kesilmiş bir alüminyum folyo parçasına aktarın. Hayvanın sol tarafı için diseksiyonu tekrarlayın.Ardından, alüminyum folyoda hem sol hem de sağ toplanan yağ pedlerini çekin ve numuneyi dondurmak için sıvı nitrojen kullanın. Viseral yağ dokusuna erişmek için, karın kasını linea alba boyunca kesin. Ardından, karın kaslarında cinsel organlardan farenin arkasına doğru her iki tarafta bir kesi yapın.Üreme organlarının etrafındaki yağ, perigonadal yağ veya PGF'dir. Sol ve sağ yağ yastıkçıklarını epididimden, testislerden ve duktus deferenslerinden ayırın ve önceden etiketlenmiş alüminyum folyoya aktarın. Ardından, numuneyi sıvı nitrojen içinde dondurun.Sol taraftan başlayarak, bağırsağı karın boşluğundan sağ tarafa doğru hareket ettirerek böbrekleri açığa çıkarın. Burada böbreği ve böbreküstü bezlerini çevreleyen yağ dokusu perirenal yağ veya PRF'dir. PRF'yi toplamadan önce adrenal bezleri izole edin ve çıkarın.Yağ dokusundan biraz daha pembe oldukları için bu sıkıcı olabilir. Şimdi, PRF'yi arka kas duvarından izole edin ve PRF ile böbreği vücudun geri kalanından ayıran üreter, renal arter ve veni kesin. Ardından, böbrek kapsülünü kesip çıkararak PRF'yi böbrekten izole edin.Sağ PRF'yi izole ettikten sonra, numuneyi sol taraftan doku ile birlikte alüminyum folyoya aktarın ve numuneleri dondurmak için sıvı nitrojen kullanın. 1,5 mililitrelik RNaz içermeyen konik tüpleri, bir havan ve havan tokmağı ve bir spatulayı metin protokolüne göre sıvı nitrojen içinde soğutun. Yağ dokusu örneğini harcın içine koyun, ardından havaneli sıvı nitrojenden kaldırmak ve harcın içine sığdırmak için birkaç kat kahverengi kağıt kullanın.Havaneli kağıtla tutarken, havaneli üst kısmına bir veya iki kez vurmak için çekiç kullanın. Daha sonra, ince bir toz elde edilene kadar numuneyi döndürme hareketi kullanarak öğütün. Ardından, havaneli çıkarın, spatulayı sıvı nitrojenden alın ve numuneyi karşılık gelen önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik konik tüpe aktarmak için kullanın.Numunenin erimesini önlemek için spatulayı zaman zaman tekrar sıvı nitrojene batırın. Ayrıca, numunenin çözülmesini önlemek için konik tüpü kuru buz üzerinde tutun. Yeterli RNA verimi için konik tüpü yaklaşık 2/3 kapasiteye kadar öğütülmüş numune ile doldurun.Ardından, kalan örnekleri metin protokolüne göre hazırlayın. Kimyasal bir başlık altında ve laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takarken sıvı nitrojenden öğütülmüş bir numuneyi çıkarın. Tüpü yavaşça açın ve 500 mikrolitre fenol çözeltisi ekleyin.Tüpün kapağını kapatın ve yaklaşık beş saniye boyunca maksimum hızda girdaplayın, ardından nitrojenden gelen basıncı boşaltmak için tüpü yavaşça ve dikkatlice açın. Tüpten çıkan havanın sesi duyulacaktır. Tüpe 500 mikrolitre fenol çözeltisi daha pipetleyin.Ardından, girdap yapın ve daha önce olduğu gibi yavaşça açın. Numuneyi tamamen eriyene kadar vorteksleyin. Ardından, ek numuneleri işlemeden önce basıncı boşaltmak için tüpü açın.Tüm numuneler işlendikten sonra, kısa bir süre maksimum hızda girdap yapın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Tüpleri 10 dakika boyunca 12.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından tüpleri tekrar oda sıcaklığına getirin.Kontaminasyonu önlemek için, her numune için, tüpün yan tarafına yakın bir yerde lipit fazını delerek ortadaki pembe tabakadan mümkün olduğunca fazla RNA'yı izole etmek için filtrelenmiş uçlu bir P1000 pipeti kullanın. Ucun dışında bulunan lipitlerin transferini önlemek için RNA'yı tüplerin kenarlarına dokunmadan yeni konik tüplere dağıtın. Her numuneye 200 mikrolitre saf kloroform ekleyin ve tüpleri 15 saniye ters çevirerek karıştırın.Daha sonra, numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, tüpleri 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin ve tüpleri tekrar oda sıcaklığına getirin. Her numune için, mümkün olduğunca çok sulu şeffaf RNA içeren üst fazı karşılık gelen konik tüplerin ikinci setine aktarmak için bir P1000 pipeti ve filtrelenmiş uçlar kullanın. Daha sonra, her numuneye 500 mikrolitre% 100 izopropanol ekleyin ve tüpleri 15 saniye ters çevirerek karıştırın.Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığına geri getirmeden önce 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. İzopropanolü her tüpten dökerek atın.Şimdi, her numuneye bir mililitre% 75 etanol ekleyin ve tüpleri maksimum hızda kısaca girdaplayın. Ardından, numuneleri beş dakika boyunca 7.500 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Numuneleri döndürdükten ve oda sıcaklığına getirdikten sonra, her bir tüpü ters çevirerek ve kalan etanolü çıkarmak için kahverengi kağıda hafifçe vurarak %75 etanolü atın.Kapağı açık bırakın ve RNA peletini yaklaşık 15 ila 20 dakika havayla kurutun. RNA peletlerinin boyutunu değerlendirdikten sonra, her numuneye 10 ila 25 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin. Numuneleri 60 santigrat derecede bir ısı bloğunda beş dakika inkübe edin.Ardından, tüpleri kısaca girdaplayın. Numuneleri aynı ısı bloğunda beş dakika daha inkübe edin. Ardından, tüm numuneleri hızlı bir şekilde döndürün ve hemen buzun üzerine yerleştirin.Metin protokolüne göre yağ dokusunda gen ekspresyonu için RT-PCR gerçekleştirin. Beklendiği gibi, yüksek yağlı diyetteki fareler, normal diyetteki çöp arkadaşlarına kıyasla vücut ağırlığını ve kilo alımını artırdı. Bu gözlemlere, obez farelerde normal diyettekilere kıyasla PGF, PRF ve SCF'nin ağırlığında iki kattan fazla bir artış eşlik etti.Bu tablo, her bir beyaz yağ dokusu için, fenol çözeltisi ile RNA izolasyonunun, RNA için saf olarak kabul edilen yaklaşık 2.0'lık OD280 üzeri bir OD260 ile numuneler ürettiğini göstermektedir. Bu çubuk grafikte görüldüğü gibi, gerçek zamanlı PCR verileri, leptin mRNA ekspresyonunun obez farelerin PGF, PRF ve SCF'sinde normal diyet uygulayanlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi. Leptin mRNA ekspresyonunda gözlenen farklılıklar, CT değerleri değişmediği için iki fare grubu arasındaki sonuçları normalleştirmek için kullanılan referans gen olan s16'nın bir varyasyonundan kaynaklanmamıştır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, RNA ekstraksiyon prosedürü sırasında RNaz içermeyen bir ortamda çalışmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonu modifikasyonları gibi ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Geliştirildikten sonra bu teknik, metabolizma alanındaki araştırmacıların kemirgenlerde obezite ve diyabet ile ilgili yağ dokusu modülasyonlarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, farklı yağ yastıkçıklarını nasıl izole edeceğinizi ve bunlardan RNA'yı nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Fenol çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Ribonükleaz açısından zengin fare pankreasından yüksek bütünlükte RNA'yı izole etmek için bir prosedür rapor ediyoruz.

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

Dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar profillerle ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için sıvı nitrojen dondurucu değirmeni kullanarak murine patilerini işlemek için kriyojenik pulverizasyon yöntemi geliştirilmiştir. Yanıt.

Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Burada, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusunun diseksiyonu ve histolojik ve gen ekspresyon analizlerinin yapılması için pratik bir prosedür sunuyoruz.

Murin Supraklaviküler Kahverengi Yağ Dokusunun Diseksiyonu, Histolojik İşlemi ve Gen Ekspresyon Analizi

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Öğrenin, farelerden beyaz yağ dokusu toplama ve yüksek kaliteli RNA izolasyonu yöntemini. Metabolizma ve gen ekspresyonu çalışmaları için güvenilir bir teknik sunar.

Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için

Daha fazla video keşfet