Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için

Bu prosedürün genel amacı, farklı farelerden beyaz yağ dokusu depolarının yeterli örnek toplanmasını sağlamak ve dokudan yüksek miktarda iyi kaliteli RNA'yı izole etmektir. Bu yöntem, metabolizma, biyokimya ve moleküler biyoloji alanlarında, örneğin tedavi edilmiş veya genetik olarak değiştirilmiş farelerden alınan yağ dokusundaki gen ekspresyonu ile ilgili temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tipik olarak düşük RNA içeriğine sahip olan yağ dokusundan yüksek miktarlarda kaliteli RNA'nın izolasyonuna izin vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Emilie Pepin olacak. Bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, metin protokolüne göre cildi linea alba üzerinden kesin, ardından göğüs kafesinin ortasından sağ kola doğru ve sağ arka uzuvun üzerindeki genital organlara yakın yaklaşık iki santimetrelik iki kesi yapın. Açılan derinin bir köşesini gerin ve pedin üzerine sabitlemek için 22 gauge bir iğne kullanın.

Ardından, diğer köşeyi sabitleyin. Cilde mümkün olduğunca düz bir şekilde yerleştirilmiş cerrahi makas kullanarak, abdominal deri altı yağının veya SCF'nin künt diseksiyonunu gerçekleştirin, ardından önceden kesilmiş bir alüminyum folyo parçasına aktarın. Hayvanın sol tarafı için diseksiyonu tekrarlayın.

Ardından, alüminyum folyoda hem sol hem de sağ toplanan yağ pedlerini çekin ve numuneyi dondurmak için sıvı nitrojen kullanın. Viseral yağ dokusuna erişmek için, karın kasını linea alba boyunca kesin. Ardından, karın kaslarında cinsel organlardan farenin arkasına doğru her iki tarafta bir kesi yapın.

Üreme organlarının etrafındaki yağ, perigonadal yağ veya PGF'dir. Sol ve sağ yağ yastıkçıklarını epididimden, testislerden ve duktus deferenslerinden ayırın ve önceden etiketlenmiş alüminyum folyoya aktarın. Ardından, numuneyi sıvı nitrojen içinde dondurun.

Sol taraftan başlayarak, bağırsağı karın boşluğundan sağ tarafa doğru hareket ettirerek böbrekleri açığa çıkarın. Burada böbreği ve böbreküstü bezlerini çevreleyen yağ dokusu perirenal yağ veya PRF'dir. PRF'yi toplamadan önce adrenal bezleri izole edin ve çıkarın.

Yağ dokusundan biraz daha pembe oldukları için bu sıkıcı olabilir. Şimdi, PRF'yi arka kas duvarından izole edin ve PRF ile böbreği vücudun geri kalanından ayıran üreter, renal arter ve veni kesin. Ardından, böbrek kapsülünü kesip çıkararak PRF'yi böbrekten izole edin.

Sağ PRF'yi izole ettikten sonra, numuneyi sol taraftan doku ile birlikte alüminyum folyoya aktarın ve numuneleri dondurmak için sıvı nitrojen kullanın. 1,5 mililitrelik RNaz içermeyen konik tüpleri, bir havan ve havan tokmağı ve bir spatulayı metin protokolüne göre sıvı nitrojen içinde soğutun. Yağ dokusu örneğini harcın içine koyun, ardından havaneli sıvı nitrojenden kaldırmak ve harcın içine sığdırmak için birkaç kat kahverengi kağıt kullanın.

Havaneli kağıtla tutarken, havaneli üst kısmına bir veya iki kez vurmak için çekiç kullanın. Daha sonra, ince bir toz elde edilene kadar numuneyi döndürme hareketi kullanarak öğütün. Ardından, havaneli çıkarın, spatulayı sıvı nitrojenden alın ve numuneyi karşılık gelen önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik konik tüpe aktarmak için kullanın.

Numunenin erimesini önlemek için spatulayı zaman zaman tekrar sıvı nitrojene batırın. Ayrıca, numunenin çözülmesini önlemek için konik tüpü kuru buz üzerinde tutun. Yeterli RNA verimi için konik tüpü yaklaşık 2/3 kapasiteye kadar öğütülmüş numune ile doldurun.

Ardından, kalan örnekleri metin protokolüne göre hazırlayın. Kimyasal bir başlık altında ve laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takarken sıvı nitrojenden öğütülmüş bir numuneyi çıkarın. Tüpü yavaşça açın ve 500 mikrolitre fenol çözeltisi ekleyin.

Tüpün kapağını kapatın ve yaklaşık beş saniye boyunca maksimum hızda girdaplayın, ardından nitrojenden gelen basıncı boşaltmak için tüpü yavaşça ve dikkatlice açın. Tüpten çıkan havanın sesi duyulacaktır. Tüpe 500 mikrolitre fenol çözeltisi daha pipetleyin.

Ardından, girdap yapın ve daha önce olduğu gibi yavaşça açın. Numuneyi tamamen eriyene kadar vorteksleyin. Ardından, ek numuneleri işlemeden önce basıncı boşaltmak için tüpü açın.

Tüm numuneler işlendikten sonra, kısa bir süre maksimum hızda girdap yapın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Tüpleri 10 dakika boyunca 12.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından tüpleri tekrar oda sıcaklığına getirin.

Kontaminasyonu önlemek için, her numune için, tüpün yan tarafına yakın bir yerde lipit fazını delerek ortadaki pembe tabakadan mümkün olduğunca fazla RNA'yı izole etmek için filtrelenmiş uçlu bir P1000 pipeti kullanın. Ucun dışında bulunan lipitlerin transferini önlemek için RNA'yı tüplerin kenarlarına dokunmadan yeni konik tüplere dağıtın. Her numuneye 200 mikrolitre saf kloroform ekleyin ve tüpleri 15 saniye ters çevirerek karıştırın.

Daha sonra, numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, tüpleri 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin ve tüpleri tekrar oda sıcaklığına getirin. Her numune için, mümkün olduğunca çok sulu şeffaf RNA içeren üst fazı karşılık gelen konik tüplerin ikinci setine aktarmak için bir P1000 pipeti ve filtrelenmiş uçlar kullanın. Daha sonra, her numuneye 500 mikrolitre% 100 izopropanol ekleyin ve tüpleri 15 saniye ters çevirerek karıştırın.

Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Tüpleri oda sıcaklığına geri getirmeden önce 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. İzopropanolü her tüpten dökerek atın.

Şimdi, her numuneye bir mililitre% 75 etanol ekleyin ve tüpleri maksimum hızda kısaca girdaplayın. Ardından, numuneleri beş dakika boyunca 7.500 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Numuneleri döndürdükten ve oda sıcaklığına getirdikten sonra, her bir tüpü ters çevirerek ve kalan etanolü çıkarmak için kahverengi kağıda hafifçe vurarak %75 etanolü atın.

Kapağı açık bırakın ve RNA peletini yaklaşık 15 ila 20 dakika havayla kurutun. RNA peletlerinin boyutunu değerlendirdikten sonra, her numuneye 10 ila 25 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin. Numuneleri 60 santigrat derecede bir ısı bloğunda beş dakika inkübe edin.

Ardından, tüpleri kısaca girdaplayın. Numuneleri aynı ısı bloğunda beş dakika daha inkübe edin. Ardından, tüm numuneleri hızlı bir şekilde döndürün ve hemen buzun üzerine yerleştirin.

Metin protokolüne göre yağ dokusunda gen ekspresyonu için RT-PCR gerçekleştirin. Beklendiği gibi, yüksek yağlı diyetteki fareler, normal diyetteki çöp arkadaşlarına kıyasla vücut ağırlığını ve kilo alımını artırdı. Bu gözlemlere, obez farelerde normal diyettekilere kıyasla PGF, PRF ve SCF'nin ağırlığında iki kattan fazla bir artış eşlik etti.

Bu tablo, her bir beyaz yağ dokusu için, fenol çözeltisi ile RNA izolasyonunun, RNA için saf olarak kabul edilen yaklaşık 2.0'lık OD280 üzeri bir OD260 ile numuneler ürettiğini göstermektedir. Bu çubuk grafikte görüldüğü gibi, gerçek zamanlı PCR verileri, leptin mRNA ekspresyonunun obez farelerin PGF, PRF ve SCF'sinde normal diyet uygulayanlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi. Leptin mRNA ekspresyonunda gözlenen farklılıklar, CT değerleri değişmediği için iki fare grubu arasındaki sonuçları normalleştirmek için kullanılan referans gen olan s16'nın bir varyasyonundan kaynaklanmamıştır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, RNA ekstraksiyon prosedürü sırasında RNaz içermeyen bir ortamda çalışmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonu modifikasyonları gibi ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, metabolizma alanındaki araştırmacıların kemirgenlerde obezite ve diyabet ile ilgili yağ dokusu modülasyonlarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, farklı yağ yastıkçıklarını nasıl izole edeceğinizi ve bunlardan RNA'yı nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Fenol çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.