Name: Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin fare pankreasından yüksek bütünlüklü RNA izolasyonu için bu güvenilir yöntemi. Ribonükleaz zengin dokudan gen ekspresyonu analizine uygun RNA elde etmeyi keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onların yararlı yorum, öneri ve protokol paylaşımı için Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul GRIPPO ve Satyanarayana Rachagani teşekkür ederim. Bu çalışma hibe U01CA111294 ve Ohio State Üniversitesi İntramural Araştırma Programı&#39;ndan bir Fikir Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir.

1.. Hazırlık Aşağıdaki uygulamalar Kurum&#39;un Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen politikalara bağlı. <ol><li> Bu, herhangi bir gün içinde en fazla 6 fare pankreasları izole edilmesi tavsiye edilir. Temiz ve otoklav tüm cerrahi aletler, hayvan başına bir set var. </li><li> Tüm Mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. Hayvan başına dört 2 ml tüpler. </li><li> Buz üzerinde bir 50 ml santrifüj tüplerine reaktifi ile 8 ml yerleştirin. Not: Saflaştırma kiti pankreas izolasyonu için uygun olan bir guanidin tiyosiyanat fenol maddesi ile birlikte olsa da, liziz reaktif nedeniyle izolasyon başına gerekli olan büyük hacimlerde kullanılır. </li><li> Homojenleştirici ait bıçaklar temizlenmesi için bir 15 ml santrifüj tüplerine aşağıdaki çözümlerden yaklaşık 10 ml dağıtın. Etanol,% 70 (2 tüpler), HPLC dereceli su (1 tüp) yaklaşık 200 RNaz&#39;ın ul Dışarıda veya eşdeğer ribonükleez inaktivatör içeren HPLC dereceli su. </li></ol&gt; 2.. Cerrahi, Pankreas Diseksiyon ve Homojenleşmesi <ol><li> Pamuklu gazlı bez veya kağıt havlu içeren bir kavanoza izofluran 1-2 ml yerleştirin. Fareler izofluran kaynağını ulaşmasını engelleyen bir platform üzerine yerleştirilir. Öncesinde her fare anestezi için kavanoza taze isofluranın ekle. </li><li> Yavaşça izofluran içeren kavanozun içine fare yerleştirin. Kavanoz kapağı ve yavaşça ileri ve geri kavanoz çevirerek anestezi etkilerini izlemek. Onun kendi durmak mümkün olduğunu bir kez hayvan anestezi. </li><li> Anestezi teyidi için, kavanozdan hayvan kaldırmak ve sağlam bir ayak tutam uygulayın. Fare ayak tutam tepki vermezse, 2.5 adıma geçin. </li><li> Fare ayak tutam tepki, o adımları 2,2-2,3 tekrarlayın. </li><li> Yüzüstü pozisyonda tezgah üzerine anestezi hayvan yerleştirin. Sıkıca fare serviks üzerinde sol el koyarak mouse serviksini yerinden. Bizesağ fare kuyruğu kavramak ve hızlı bir şekilde rahim dağıtacağına yaklaşık yukarı bir 45 ° açı çekin ing. </li><li> 25 gauge derialtı iğneler kullanarak düz bir yüzeyin içine hayvanın dört pençeleri her delici bir yüzeye (kağıt havlu ile kaplı strafor bir seviye parça) için karkas sabitleyin. </li><li> Açık fare midsection kesti ve hızlı fare pankreas kaldırmak, steril cerrahi aletler kullanarak. Pankreas tutun ve yaylı makas kullanılarak dalak ve ince bağırsaktan kesmek için forseps kullanabilir. Fare çıkarılması sırasında pankreas germek için dikkatli olun. Doku bozulması Ribonuclease serbest olabilir. Not: Bu fare pankreas kaldırmak için gereken zamanı önemlidir. Yetenekli bir kişi, yaklaşık 1 dakika veya daha kısa bir pankreas incelemek gerekir. </li><li> Soğuk lisiz tepkin maddesinin 8 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içine tüm pankreas yerleştirin. Tüp kap ve kısaca ti öğrenmek sallamakayıraç içine ssue ve gecikmeden bir sonraki adıma geçin. Dokuya reaktifi oranı önemlidir. Liziz reaktifi farklı hacimleri kullanılarak izole RNA bütünlüğü bir karşılaştırma için sonuçlar bölümüne bakın. </li><li> 5 sn için homojenize edilmiştir. Bu doku etkili homojenizasyon için bıçakların içine çekilmesine izin vermek için, santrifüj tüpünün dibine homojenleştirici bıçakları basın önemlidir. </li></ol> Sindirilmemiş Doku 3. Kaldırma Not: Homojenizasyondan sonra doku küçük bit reaktifi kalacaktır. Bu hızlı homojenleştirici ve RNA risk bozulması üzerine yerine sindirilmemiş bazı doku bırakarak dokuyu parçalamak için daha önemlidir. <ol><li> Transfer 2 ml mikrosantrifüj tüpüne lize pankreas ihtiva eden liziz reaktifi 2 ml. Izolasyon başına homojenat iki mikrosantrifüj tüpleri toplayın. Gelecekteki çalışmalar için -80 ° C&#39;de kalan homojenatın veya mağaza atın. </li><li> Sent4 ° C, sindirilmemiş doku pellet haline getirmek için 5 dakika için 12,000 x g&#39;da rifuge. Bu büyük olasılıkla ribonüleaz (adım 5.13) ile numuneyi kontamine RNA sonraki çözümleri içine sindirilmemiş doku taşınmadan kaynaklanan gibi kritik bir adımdır. </li><li> 2 ml&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içine aktarın süpernatan 1 ml. Hemen izolasyonu ile devam edin ve gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de suret tüp saklayın. Bir sonraki aşamaya geçmeden ıslak buz üzerinde Homojenat içeren tüm tüpler yerleştirin. </li><li> Uygun bir kimyasal atık yuvasına kalan reaktifi atınız. </li></ol> Homojenizetör Blades 4. Temizleme <ol><li> Bir sonraki izolasyon geçmeden önce,% 70 etanol, 10 ml yerleştirerek homojenleştirici bıçakları temizleyin. Bıçakları yakalanmış olabilir dokusunun herhangi parçalarını kaldırmak için 20 saniye boyunca yaklaşık için homojenizer etkinleştirin. </li><li> Homogenizer bıçakları kalan herhangi parçaları kaldırmak için bir 200 ul pipet ucu kullanın. </li&gt; <li> Suyu, genel Rnase inaktivatör ve% 70 etanol adımı tekrarlayın 4.1. Temiz Kim ile homojenleştirici şaft silin kurulayın. </li><li> Kalan hayvanların pankreas izolasyonu için yineleyin 2.1, yerine RNA havuzu daha her hayvan ayrı izole tutmak RNA. </li></ol> 5. RNA İzolasyon Aşağıdaki bölüm, saflaştırma kiti protokol ile aynıdır. Saflaştırma kiti avantajı küçük RNA&#39;ların de dahil olmak üzere, toplam RNA izole olmasıdır. <ol><li> Dondurulmuş homojenat çözeltisi kullanılarak ise, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında beklemeye ıslak buz üzerinde ve çözülme sağlar. </li><li> Kloroform 200 ul ekleyin, tüp kap ve 15 saniye boyunca elle kuvvetlice sallayın. Tüp, 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> 12,000 xg, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj </li><li> Bir mikro santrifüj tüpüne üst Sulu tabakayı aktarın. Izopropanolün 1.5 sayılarını ve yukarı ve aşağı pipetleme birkaç kez iyice karıştırın. </li><li> 70 kadar transfer2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içine yerleştirilen bir sıkma kolona numunenin 0 ul. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj kapağı ve kapatın. </li><li> Flow-through atın. </li><li> Tekrar, numunenin geri kalanı ile, 5,5-5,6 adımları. </li><li> Döndürme kolonuna 700 ul Tampon RWT ekleyin. 8,000 x g de 15 saniye boyunca santrifüjleyin. Flow-through atın. </li><li> Spin kolon içine pipet 500 ul Tampon RPE. Sütunu yıkamak için 8.000 xg 15 saniye santrifüj. Flow-through atın. </li><li> Döndürme kolonuna 500 ul Tampon RPE ekleyin. Sütunu kuru 8000 x g&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne spin kolon aktarın. Doğrudan spin kolon zar üzerine Pipet 80 ul ribonükleaz içermeyen su. RNA elüt edilmesi için 8000 x g &#39;de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> RNA çözeltisine, 1 ul Rnaz inhibitörü ekleyin. -80 ° C&#39;de saklayın veya 5,13 geçin. </li><li> RNA bütünlüğünü doğrulamak için, ilk olarak RNA conce hesaplamakBir spektrofotometre kullanılarak ntration ve 260/280 oranı. </li><li> Moleküler biyoloji dereceli su ile yaklaşık olarak 500 ng / ul RNA çözeltinin bir bölümünün seyreltin. </li><li> Kapiller elektroforez analizi kullanılarak RNA Dürüstlük (yani, Rin) belirleyin. RNA çözelti yaklaşık 5 ul analiz için yeterlidir. </li><li> -80 ° C&#39;de RNA çözeltisi (bkz. Şekil 2) ve mağaza alikotu </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Zengin ribonükleaza olan dokulardan RNA izole moleküler biyoloji deneyleri için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Çeşitli belirteçler, ve kitler öncelikle RNA ekstraksiyon fenol guanidin tiyosiyanat yöntemine bağlı ticari olarak temin dayanır ki. Guanidin tiyosiyanat protein denatüre ve böylece ribonükleaz etkinliğini azaltır. Ancak, pankreas ribonükleaz çokluğu bir RNA izolasyonu standart protokollere ek değişiklikler gerektirir. Standart bir protokol guanidin tiyosiyanat yöntemine göre olduğu bildirilmektedir henüz b...

Yüksek bütünlük RNA izolasyonu örneğin kuzey blot 9, qRT-PCR 1 ve 5 gen ekspresyonu gibi rutin moleküler biyoloji deneyleri için gereklidir. RNA izolasyonu çoğu modern yöntemler, guanidin tiyosiyanat protokolleri 2, modifikasyonları dayanmaktadır 3. Guanidin tiyosiyanat güçlü protein denatüran ve etkili bir çoğu durumda ribonükleaz aktivitesini bozacak. Chomczynski ve Sacchi 3&#39;ün yaygın kullanılan yöntem, yaklaşık 4 saat için izolasyon süresini azaltmak, guanidin tiyosiyanat lizis çözeltisine fenol birleştirildi. Pek çok ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon reaktifleri Chomczynski ve Sacchi yöntem 3 üzerine dayanır. Bu tür insan veya fare gibi pankreas Ribonuclease zengin dokuların RNA&#39;nın izole edilmesi için ek bir zorluktur. Fare pankreas bazıları Durin çıkacak ribonükleaz 6 kadar olan 75 mg içerebilirg doku otoliz sonuçlanan pankreas dokusunun bozulması. Guanidin tiyosiyanat protokollerin modifikasyonları başarılı bir şekilde yüksek bütünlüğü 2, 4, 7, 10, yüksek bütünlüğü 4, 7, 10, RNA fare pankreası kolaylaştırılmış izolasyon içine RNA stabilizasyonu reajanı. Infusion Ancak infüzyon of ile pankreasından RNA&#39;yı izole etmek için kullanılmıştır pankreas içine çözümler, büyük bir beceri gerektirir böyle bir mikroskop ve işlem sırasında doku mimarisini bozan hücre parçalama neden olabilir gibi özel araçlar gerekebilir. RNA stabilizasyon reaktif ile dokuyu perfüze protein izolasyonu ve histolojik boyama gibi diğer uygulamaları ile etkileyebilir. Ayrıca, bu teknik, insan pankreasından RNA&#39;nın izole edilmesi için uygun değildir. Diğer protokoller 2 araştırmacı tarafından özel çözümler hazırlanmasını gerektirir. Biz fare pankreas yüksek bütünlük RNA izole etmek için bir protokol rapor. The protokolü daha önce yayınlanmış yöntemlerden elemanları içeren ve büyük ölçüde standart fenol / guanidin tiyosiyanat tabanlı liziz reaktif protokoller üzerine dayanır. Bu, özel bir çözeltilerin hazırlanmasını gerekli değildir, ne de pankreas içine reaktiflerin infüzyon gerektirir. Başarılı bir RNA izolasyonu için kritik adım doku oranı, elde edilen RNA çözeltiye ayırma ve bir ribonükleaz inhibitörü dahil faz önce sindirilmemiş doku çıkarılması için yüksek bir fenol / guanidin bazlı liziz reaktif içerir. Bu ve diğer değişiklikler kullanarak, tipik olarak daha büyük 7 rutin gen ekspresyon analizi için kullanılacak RIN ile RNA izole eder.

<table><tbody><tr><td>Güç Jeneratörü 500&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>Homojenizatör</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Soğutmalı mikrosantifuge</td></tr><tr><td>Trizol reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Lysis reaktifi</td></tr><tr><td>Öğrenci Vannas bahar makası Fisher</td><td></td><td>91500-09&nbsp;</td><td>Bağlı dokulardan pankreası kesmek için kullanın</td></tr><tr><td>Cerrahi makas, 6 inç</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>Farenin künt</td></tr><tr><td>uçlu forsepslerini</td> kesmek için kullanın <td>Fisher</td><td>1381239</td><td>İzofluran</td></tr> USP <tr><td></td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Anestezik</td></tr><tr><td>Rnaze dışarı (40 U/&mikro; l)</td> <td>Canlandırıcı</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhibitör</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>Genel Rnase inaktivatör</td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>Homojenizatör bıçaklarını yıkamak için</td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji sınıfı su</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>RNA elüsyonu</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Arıtma Kiti</td></tr><tr><td>2 ml mikrosantrifüj tüpleri, sertifikalı Rnase Dnase içermez</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%100 etanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & l pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>Homojenizatör bıçaklarını temizlemek için</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>Spektrofotometre</td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td></td><td>Kılcal elektroforez analizörü RNA bütünlüğünü ölçmek için</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td></td><td>RNA Stabilizasyon Reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp; Döndürme Sütunları&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Spin sütunları&nbsp; miRNeasy Mini kitinin bir parçası olarak</td></tr><tr><td>Fareler</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL/6</td><td>Yaşları 4 ila 12 ay arasında değişiyordu. &nbsp;</td></tr><tr><td>Fareler&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>suşu 129</td><td>Yaşları 4 ila 12 ay arasında değişiyordu. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

fare pankreasından alınan rna İzolasyonu: a ribonuclease zengin doku

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Fare pankreası gibi ribonükleaz açısından zengin dokudan yüksek kaliteli RNA'nın izolasyonu bir zorluk teşkil eder. Pankreasın birincil işlevi sindirime yardımcı olmak olduğundan, fare pankreası 75 mg ribonükleaz içerebilir. Fare pankreasından RNA'yı izole etmek için standart fenol / guanidin tiyosiyanat lizis reaktif protokollerinin modifikasyonlarını rapor ediyoruz. Guanidin tiyosiyanat güçlü bir protein denatüranıdır ve çoğu koşulda ribonükleazın aktivitesini etkili bir şekilde bozacaktır. Bununla birlikte, RNA'yı ribonükleaz açısından zengin dokulardan başarılı bir şekilde izole etmek için standart protokollerde kritik değişiklikler gereklidir. Anahtar adımlar, yüksek bir lizis reaktifinin doku oranını, faz ayrılmasından önce sindirilmemiş dokunun çıkarılmasını ve RNA çözeltisine bir ribonükleaz inhibitörünün dahil edilmesini içerir. Bu ve diğer modifikasyonları kullanarak, RNA Bütünlük Numarası (RIN) 7'den büyük olan RNA'yı rutin olarak izole ediyoruz. İzole edilen RNA, rutin gen ekspresyon analizi için uygun kalitededir. Bu protokolün, pankreasın yanı sıra ribonükleaz açısından zengin dokulardan RNA'yı izole etmek için adaptasyonu kolayca gerçekleştirilebilir olmalıdır.

Liziz Homojenat 1 ml toplam RNA verimi 20-40 ug'dır. OD 260/280 oranı tipik olarak yaklaşık 2.0 'dir ve RIN, 7.0' dan, daha geniş bir bulunmaktadır. RIN 6 ≤ ise, izolasyon tekrar edilmesi gerekecektir. Bazen, 8.0 'dan daha yüksek olan bir RIN elde edilir. Önce pankreas kaldırılması için fareler ötenazi iki en yaygın olarak kullanılan yöntemler, CO 2 asfiksi ya da izofluran teneffüs bulunmaktadır. Her iki teknik, servikal dislokasyon ile takip edilmektedir. Bu kimyasal madde ve / v...

Ribonükleaz açısından zengin fare pankreasından yüksek bütünlükte RNA'yı izole etmek için bir prosedür rapor ediyoruz.

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Bu prosedürün genel amacı, RNA'yı Ribonükleaz sırt fare pankreasından yüksek bütünlükle izole etmektir. Bu, pankreasın ötenazi yapılmış bir farenin karkasından hızlı bir şekilde çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, pankreas lizis reaktifine batırılır ve doku homojenize edilir.Santrifüjlemeyi takiben, RNA, standart protokoller kullanılarak süpernatanttan izole edilir ve RNA inhibitör çözeltisi, nihai RNA çözeltisine eklenir. Son adım, bıçaklara sıkışan doku parçalarını çıkararak ve ardından bir dizi etanol ve suyla yıkama gerçekleştirerek homojenizatör bıçaklarını dikkatlice temizlemektir. Sonuç olarak, bu prosedür, rutin gen ekspresyonu analizi için kullanılmak üzere yediden büyük bir RNA bütünlük sayısına sahip fare pankreası için RNA'nın izolasyonuna izin verir.Benim adım Tom Schmid ve 20 yılı aşkın bir süredir RNA ile çalışıyorum ve tüm bu süre boyunca, fare pankreası için RNA'yı yüksek bütünlükle izole etmek kadar zor bir şey yaşamadım. Size göstereceğimiz teknik fare pankreası için geliştirilmiştir, ancak aslında insan hücrelerinden alınan dokular, hücre dizileri veya fareden alınan diğer dokular da dahil olmak üzere çeşitli diğer dokular için kullanılmaması için hiçbir neden yoktur, kaburga çekirdeği açısından zengin dokular da dahil olmak üzere, dalak gibi. Bu protokoldeki önerileri kullanmak, RNA'yı fare pankreasından yüksek bütünlükle izole etmenize olanak tanır.Bu, QPCR, gen ekspresyon dizileri veya RNA-Seq gibi birçok alt uygulama için kullanılabilir. Ola Elgamal. Laboratuvarımdaki son sınıf bir yüksek lisans öğrencisi, metin protokolünde açıklandığı gibi fareyi ötenazi yaptıktan sonra bu tekniği gösterecek.Steril cerrahi aletler kullanarak 25 gauge hipodermik iğneler kullanarak hayvanların her birinin dört pençesini düz bir yüzeye delerek karkası sabitleyin. Farenin orta bölümünü kesin ve pankreası fareden hızlı bir şekilde çıkarın. Pankreası tutmak için forseps kullanın ve yaylı makas kullanarak dalak ve ince bağırsaktan kesin.Fareden çıkarma sırasında pankreasın gerilmemesine dikkat edin. Dokunun bozulması ribonükleaz salgılayabilir. Tüm pankreası, sekiz mililitre buz gibi soğuk lizis reaktifi tutan 50 santimetreküplük bir tüpe yerleştirin.Tüpü kapatın ve dokuyu reaktife batırmak için kısa bir süre sallayın ve gecikmeden hemen bir sonraki adıma geçin. Ardından, pankreası beş saniye boyunca homojenize edin. Verimli homojenizasyon için dokunun bıçaklara çekilmesini sağlamak için homojenizatör bıçaklarını santrifüj tüpünün dibine bastırmak önemlidir.Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için, parçalanmış pankreası içeren iki mililitre lizis reaktifini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sindirilmemiş dokuyu peletlemek için beş dakika boyunca dört santigrat derece, 12.000 kez G'de izolasyon santrifüjü başına iki mikro santrifüj homojenat tüpü toplayın. Bu kritik bir adımdır, çünkü sindirilmemiş dokunun sonraki RNA çözeltilerine taşınması muhtemelen numuneyi ribonükleaz ile kontamine edecektir.Homojenizatör bıçaklarını 10 mililitre %70 etanol içine yerleştirerek temizleyin. Bıçaklara takılabilecek doku parçalarını çıkarmak için homojenizatörü yaklaşık 20 saniye etkinleştirin. Ardından, homojenizatör bıçaklarında kalan parçaları çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.Homojenizatör bıçaklarını tekrar su, genel RNA syn aktivatörü ve %70 etanol içinde temizleyin. Son olarak, homojenizatör milini temiz bir Kim mendiliyle kurulayın. SNA'nın bir mililitresini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Bir sonraki adıma geçerken homojenat içeren tüm tüpleri ıslak buz üzerine yerleştirin. Hemen RNA izolasyonuna devam edin ve replikat tüpünü ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kalan lizis reaktifini uygun bir kimyasal atık kabına atın.Aşağıdaki bölümde bir RNA saflaştırma kiti kullanılmaktadır. Saflaştırma kitinin avantajı, küçük RNA'lar da dahil olmak üzere toplam RNA'yı izole etmesidir. Homojenat çözeltisine 200 mikrolitre kloroform ekleyerek izolasyona başlayın.Tüpü kapatın ve 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice çalkalayın. Daha sonra tüpü, 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjlemeyi takiben iki ila üç dakika oda sıcaklığında bekletin. Üst sulu tabakayı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.1,5 hacim izopropanol ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. 700 mikrolitreye kadar numuneyi, iki mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir döndürme sütununa aktarın. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleyin ve ardından akışı atın.Ardından, sıkma kolonuna ve santrifüje 700 mikrolitre tampon RWT ekleyin. Daha önce olduğu gibi, 500 mikrolitre tampon RPE'yi pipetten geçirerek akışı döndürme kolonuna atın ve kolonu yıkamak için tekrar santrifüjleyin. Akışı attıktan sonra, 8.000 kez iki dakika boyunca döndürme sütunu santrifüjüne 500 mikrolitre daha tampon RPE ekleyin G.To sütunu kurutun, döndürme sütununu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın pipet 100 mikrolitre kaburga çekirdeği içermeyen su doğrudan 8'de bir dakika boyunca döndürme sütunu membran santrifüjüne, 000 kez G'den elüte, RNA'ya.Daha sonra RNA çözeltisine bir mikrolitre RNA inhibitörü ekleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi kılcal elektroforez analizini kullanarak RNA bütünlüğünü belirlemeye devam edin: fare pankreasından izole edilen RNA'nın RNA bütünlük numarasının veya RIN'inin karşılaştırılması, homojenizasyonda kullanılan lizis reaktifinin hacmi ile RNA bütünlüğü arasında doğrudan bir korelasyon olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuçlar, sekiz mililitre lizis reaktifinin kullanılması gerektiğini göstermektedir Bu protokolde, RNA'nın sulu çözeltisine ribonükleaz inhibitörü eklenmiş ve donarak çözülme üzerine RNA bütünlüğü karşılaştırılmıştır. İnhibitörlü RNA çözeltisi için RIN, tekrarlanan donma çözülmesinin ribonükleaz inhibitörünü denatüre ederek etkisiz hale getirme olasılığını incelemek için inhibitör içermeyen çözelti için 2.9 artı veya eksi 0.65'e kıyasla 7.3 artı veya eksi 0.15 idi.Ribonükleaz inhibitörü içeren bir RNA çözeltisi test edildi. Beş defaya kadar dondurulan ve çözülen RNA çözeltileri hala yedi veya daha yüksek bir RIN üretti. Altı kez veya daha yüksek dondurulan ve çözülen bu çözeltiler, yedi rastgele asalın altında bir RIN üretirken, CDNA RNA'dan sentezlendi ve üç temizlik geninin ekspresyonu QPCR ile ölçüldü.Veriler, standart teknikler kullanarak, fare pankreas RNA'sının standart bir moleküler biyoloji tekniğinde başarılı bir şekilde kullanıldığını doğrular. Uygun şekilde eğitildikten sonra, yüksek lisans öğrencileri ve doktora sonrası öğrenciler bu tekniği yaklaşık 30 dakika içinde tamamlayabilmelidir. Ve size onu nasıl kullandığımızdan biraz bahsetmek istiyorum.Pankreas kanserinin transgenik fare modellerini inceliyoruz ve bu tekniği RNA'yı izole etmek için kullanıyoruz. Ve sonra RNA'yı elde ettiğimizde, bu hayvanlardaki mikro RNA'nın gen ekspresyonunu inceleyeceğiz.

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA'nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

İzole Edilmiş RNA'nın saflığı ve bütünlüğü, RNA'ya bağlı tahlillerde hayati bir adımdır. Burada, hasarsız pankreas dokusunun küçük bir miktar RNA ayıklamak için pratik, hızlı ve ucuz bir yöntem salıyoruz.

Rat Pankreas Dokusunun Hızlı ve Uygun Maliyetli RNA Ekstraksiyonu

Bu protokol, fare endotel hücrelerinin tüm pankreastan izolasyonunu tanımlar.

Fare Pankreas Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Öğrenin fare pankreasından yüksek bütünlüklü RNA izolasyonu için bu güvenilir yöntemi. Ribonükleaz zengin dokudan gen ekspresyonu analizine uygun RNA elde etmeyi keşfedin.

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Daha fazla video keşfet