Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Bu prosedürün genel amacı, RNA'yı Ribonükleaz sırt fare pankreasından yüksek bütünlükle izole etmektir. Bu, pankreasın ötenazi yapılmış bir farenin karkasından hızlı bir şekilde çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, pankreas lizis reaktifine batırılır ve doku homojenize edilir.

Santrifüjlemeyi takiben, RNA, standart protokoller kullanılarak süpernatanttan izole edilir ve RNA inhibitör çözeltisi, nihai RNA çözeltisine eklenir. Son adım, bıçaklara sıkışan doku parçalarını çıkararak ve ardından bir dizi etanol ve suyla yıkama gerçekleştirerek homojenizatör bıçaklarını dikkatlice temizlemektir. Sonuç olarak, bu prosedür, rutin gen ekspresyonu analizi için kullanılmak üzere yediden büyük bir RNA bütünlük sayısına sahip fare pankreası için RNA'nın izolasyonuna izin verir.

Benim adım Tom Schmid ve 20 yılı aşkın bir süredir RNA ile çalışıyorum ve tüm bu süre boyunca, fare pankreası için RNA'yı yüksek bütünlükle izole etmek kadar zor bir şey yaşamadım. Size göstereceğimiz teknik fare pankreası için geliştirilmiştir, ancak aslında insan hücrelerinden alınan dokular, hücre dizileri veya fareden alınan diğer dokular da dahil olmak üzere çeşitli diğer dokular için kullanılmaması için hiçbir neden yoktur, kaburga çekirdeği açısından zengin dokular da dahil olmak üzere, dalak gibi. Bu protokoldeki önerileri kullanmak, RNA'yı fare pankreasından yüksek bütünlükle izole etmenize olanak tanır.

Bu, QPCR, gen ekspresyon dizileri veya RNA-Seq gibi birçok alt uygulama için kullanılabilir. Ola Elgamal. Laboratuvarımdaki son sınıf bir yüksek lisans öğrencisi, metin protokolünde açıklandığı gibi fareyi ötenazi yaptıktan sonra bu tekniği gösterecek.

Steril cerrahi aletler kullanarak 25 gauge hipodermik iğneler kullanarak hayvanların her birinin dört pençesini düz bir yüzeye delerek karkası sabitleyin. Farenin orta bölümünü kesin ve pankreası fareden hızlı bir şekilde çıkarın. Pankreası tutmak için forseps kullanın ve yaylı makas kullanarak dalak ve ince bağırsaktan kesin.

Fareden çıkarma sırasında pankreasın gerilmemesine dikkat edin. Dokunun bozulması ribonükleaz salgılayabilir. Tüm pankreası, sekiz mililitre buz gibi soğuk lizis reaktifi tutan 50 santimetreküplük bir tüpe yerleştirin.

Tüpü kapatın ve dokuyu reaktife batırmak için kısa bir süre sallayın ve gecikmeden hemen bir sonraki adıma geçin. Ardından, pankreası beş saniye boyunca homojenize edin. Verimli homojenizasyon için dokunun bıçaklara çekilmesini sağlamak için homojenizatör bıçaklarını santrifüj tüpünün dibine bastırmak önemlidir.

Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için, parçalanmış pankreası içeren iki mililitre lizis reaktifini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sindirilmemiş dokuyu peletlemek için beş dakika boyunca dört santigrat derece, 12.000 kez G'de izolasyon santrifüjü başına iki mikro santrifüj homojenat tüpü toplayın. Bu kritik bir adımdır, çünkü sindirilmemiş dokunun sonraki RNA çözeltilerine taşınması muhtemelen numuneyi ribonükleaz ile kontamine edecektir.

Homojenizatör bıçaklarını 10 mililitre %70 etanol içine yerleştirerek temizleyin. Bıçaklara takılabilecek doku parçalarını çıkarmak için homojenizatörü yaklaşık 20 saniye etkinleştirin. Ardından, homojenizatör bıçaklarında kalan parçaları çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.

Homojenizatör bıçaklarını tekrar su, genel RNA syn aktivatörü ve %70 etanol içinde temizleyin. Son olarak, homojenizatör milini temiz bir Kim mendiliyle kurulayın. SNA'nın bir mililitresini iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Bir sonraki adıma geçerken homojenat içeren tüm tüpleri ıslak buz üzerine yerleştirin. Hemen RNA izolasyonuna devam edin ve replikat tüpünü ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kalan lizis reaktifini uygun bir kimyasal atık kabına atın.

Aşağıdaki bölümde bir RNA saflaştırma kiti kullanılmaktadır. Saflaştırma kitinin avantajı, küçük RNA'lar da dahil olmak üzere toplam RNA'yı izole etmesidir. Homojenat çözeltisine 200 mikrolitre kloroform ekleyerek izolasyona başlayın.

Tüpü kapatın ve 15 saniye boyunca elinizle kuvvetlice çalkalayın. Daha sonra tüpü, 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjlemeyi takiben iki ila üç dakika oda sıcaklığında bekletin. Üst sulu tabakayı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

1,5 hacim izopropanol ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. 700 mikrolitreye kadar numuneyi, iki mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir döndürme sütununa aktarın. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleyin ve ardından akışı atın.

Ardından, sıkma kolonuna ve santrifüje 700 mikrolitre tampon RWT ekleyin. Daha önce olduğu gibi, 500 mikrolitre tampon RPE'yi pipetten geçirerek akışı döndürme kolonuna atın ve kolonu yıkamak için tekrar santrifüjleyin. Akışı attıktan sonra, 8.000 kez iki dakika boyunca döndürme sütunu santrifüjüne 500 mikrolitre daha tampon RPE ekleyin G.To sütunu kurutun, döndürme sütununu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın pipet 100 mikrolitre kaburga çekirdeği içermeyen su doğrudan 8'de bir dakika boyunca döndürme sütunu membran santrifüjüne, 000 kez G'den elüte, RNA'ya.

Daha sonra RNA çözeltisine bir mikrolitre RNA inhibitörü ekleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi kılcal elektroforez analizini kullanarak RNA bütünlüğünü belirlemeye devam edin: fare pankreasından izole edilen RNA'nın RNA bütünlük numarasının veya RIN'inin karşılaştırılması, homojenizasyonda kullanılan lizis reaktifinin hacmi ile RNA bütünlüğü arasında doğrudan bir korelasyon olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuçlar, sekiz mililitre lizis reaktifinin kullanılması gerektiğini göstermektedir Bu protokolde, RNA'nın sulu çözeltisine ribonükleaz inhibitörü eklenmiş ve donarak çözülme üzerine RNA bütünlüğü karşılaştırılmıştır. İnhibitörlü RNA çözeltisi için RIN, tekrarlanan donma çözülmesinin ribonükleaz inhibitörünü denatüre ederek etkisiz hale getirme olasılığını incelemek için inhibitör içermeyen çözelti için 2.9 artı veya eksi 0.65'e kıyasla 7.3 artı veya eksi 0.15 idi.

Ribonükleaz inhibitörü içeren bir RNA çözeltisi test edildi. Beş defaya kadar dondurulan ve çözülen RNA çözeltileri hala yedi veya daha yüksek bir RIN üretti. Altı kez veya daha yüksek dondurulan ve çözülen bu çözeltiler, yedi rastgele asalın altında bir RIN üretirken, CDNA RNA'dan sentezlendi ve üç temizlik geninin ekspresyonu QPCR ile ölçüldü.

Veriler, standart teknikler kullanarak, fare pankreas RNA'sının standart bir moleküler biyoloji tekniğinde başarılı bir şekilde kullanıldığını doğrular. Uygun şekilde eğitildikten sonra, yüksek lisans öğrencileri ve doktora sonrası öğrenciler bu tekniği yaklaşık 30 dakika içinde tamamlayabilmelidir. Ve size onu nasıl kullandığımızdan biraz bahsetmek istiyorum.

Pankreas kanserinin transgenik fare modellerini inceliyoruz ve bu tekniği RNA'yı izole etmek için kullanıyoruz. Ve sonra RNA'yı elde ettiğimizde, bu hayvanlardaki mikro RNA'nın gen ekspresyonunu inceleyeceğiz.