Name: Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Öğrenin soya fasulyesi protoplast izolasyonu için basit bir yöntemi. Canlı hücrelerde düzenleyici mekanizmaları ve sinyal yollarını incelemek için yüksek kaliteli protoplastlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bitki genom araştırma programı Ulusal Bilim Vakfı (NSF-PGRP-IOS-1339388) tarafından desteklenmiştir.

1. bitkilerin büyüme
<ol><li>5-10 soya tohumları (Williams 82) özel toprak karışımı üzerinde 25 ° c (16 h 1500 µmol m-2 s-1ışık) uzun günlük koşullarda sera içinde 13 cm tencerede soya için ekmek (1:1:1 oran toprak, perlit ve torpido kum).</li>
</ol>2. plazmid DNA hazırlanması
<ol><li>Steril pipet ucu veya kürdan kullanarak, bir koloni veya faiz gen içeren plazmid taşıyan E. coli donmuş gliserol hisse senedi almak ve 20 mL Luria-Bertani (LB) sıvı ortamda bir 50 mL şişe olarak uygun antibiyotik aşılamak.</li>
	<li>Gecede bir shaker olarak 37 ° C'de şişeye kuluçkaya. Bakteri süspansiyon 12.000 x g 5 min için oda sıcaklığında, centrifuging ve süpernatant atarak toplamak. Hulâsa ve plazmid hazırlık seti üreticinin prosedürü takip plazmid arındırmak.</li>
</ol>3. protoplast yalıtım
<ol><li>10 - gün eski soya fidan (şekil 1) yeni genişletilmiş unifoliate yaprakları kesti. Not: Yaprakları uygun bir gelişimsel aşamada başarının anahtarı soya protoplast hazırlık için seçimdir. Sadece sadece genişletilmiş yaprakları aşamalarında erken gelişimsel kullanın. Olgun yaprakları, hücre duvarları daha zor sindirmek için hale gelir.</li>
	<li>Taze bir tıraş bıçağı ile midrib unifoliate yaprak ve kalıntıları içine 0,5-1 mm şeritler kes çıkarın. Not: iki unifoliate yaprakları 10 mL enzim çözümde sindirmek için 10'dan fazla dönüşümleri yeterli önceki verecektir.</li>
	<li>Forseps, transfer bir çift kullanarak yaprak 10 mL taze hazırlanmış enzim çözeltisi (Tablo 1) bir 15 mL tüp içine hemen ve yavaşça şeritler. Vakum infiltrat yaprak 15 dakika oda sıcaklığında şeritler.</li>
	<li>Yaprak şeritler ile nazik ajitasyon (40 d/d) düşük ışık altında oda sıcaklığında 4-6 h için enzim çözümde kuluçkaya. Önceki yayımlanan olarak enzim çözüm sarı-yeşil döner emin olun. Enzim/önceki çözüm (X10) mikroskop altında denetleyin. Not: Yayımlanan önceki küresel şeklinde, sindirilmemiş hücreler düzensiz veya oval şekli varken.</li>
	<li>Yavaşça dökerek enzim/protoplast çözüm bir 50 mL tüp 10 mL transfer ve hazım durdurmak için oda sıcaklığında 10 mL W5 çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça tüp birkaç kez tersine çevirin. Yavaşça sindirilmemiş yaprak dokuları kaldırmak için 50 mL tüp üzerine yerleştirilen bir temiz 75 µm naylon mesh üzerinde enzim/önceki solüsyonu dökün.</li>
	<li>100 x g oda sıcaklığında 1-2 dk 50 mL tüp, akışı sayesinde enzim/önceki çözüm santrifüj kapasitesi. Yavaşça protoplast Pelet bozmadan bir 10 mL serolojik pipet kullanarak süpernatant çıkarın.</li>
	<li>Önceki resuspend ve (x10) mikroskop altında bir hemacytometer numaralı protoplast sayarak 2 x 105 mL-1 4 ° C'de soğutulmuş W5 çözümde bir konsantrasyon sulandırmak. Önceki 30 dk için buz üzerinde tutun.</li>
	<li>100 x g oda sıcaklığında 1-2 min için de süspansiyon santrifüj kapasitesi ve 1 mL pipet protoplast Pelet bozmadan kullanarak W5 çözüm yavaşça çıkarın. 2 x 105 mL-1 oda sıcaklığında bir konsantrasyon, MMG çözüm (Tablo 1) önceki resuspend.</li>
</ol>4. protoplast dönüştürme
<ol><li>100 µL aliquots önceki (2 x 104 önceki vasıl 2 x 105 mL-1), 1.5 mL düşük yapışma microcentrifuge tüplere kesilmemiş 200 µL pipet ipuçlarını kullanarak olun. Negatif denetimi hizmet için bir aliquot bir kenara koyun. Plazmid (10-20 µg) 10 µL her önceki dinlenme aliquot içine ekleyin.</li>
	<li>Yavaş taze hazırlanmış PEG çözüm (Tablo 1) 110 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp iç duvarında ekleyin ve sonra yavaşça tersine çevirin ve çözüm homojen hale gelinceye kadar tüp döndürün.</li>
	<li>Dönüştürme karışımı 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Dönüşümün durdurmak için yavaş yavaş 1,5 mL tüp, oda sıcaklığında 400 µL W5 çözüm ekleyin ve çözüm homojen hale gelinceye kadar tüpü yavaşça tersine çevirin. Tüp 100 gr oda sıcaklığında 1-2 min için santrifüj kapasitesi ve bir pipet kullanarak süpernatant atın.</li>
	<li>WI çözüm (Tablo 1) 1 mL tüp ekleyin ve hafifçe 1 - 2 defa pipetting tarafından resuspend. 1 mL % 5 (vol/vol) steril buzağı serum her şey yüzey kat ve önceki plakasına yapışmasını önlemek için 6-iyi doku kültürü plaka ekleyin.</li>
	<li>Birkaç saniye sonra bir pipet kullanarak buzağı serum atmak. Resuspended önceki kültür plaka bir kuyunun içine aktarın. Bir kapak ile plaka kapak.</li>
</ol>5. protoplast kuluçka ve hasat
<ol><li>1-2 gün içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında önceki kuluçkaya. Not: Bulduğumuz iki günde kuluçka genel olarak bir günlük kuluçka için karşılaştırıldığında güçlü floresan protein sinyali verir ve floresan protein sinyal 3-4 güne kadar sürebilir.</li>
	<li>Protoplast çözüm 1.5 mL düşük yapışma microcentrifuge tüp aktarın. Önceki hasat için oda sıcaklığında 1-2 min için 100 x g de tüp santrifüj kapasitesi. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve 10 µL önceki bir cam slayt üzerine aktarın.</li>
	<li>Floresan veya confocal mikroskobu altında floresan sinyal gözlemlemek. Sigara dönüştürülmüş önceki (sinyal yok dikkat edilmelidir) negatif kontrol kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00271144">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li>
<li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2474847">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li>
<li>Lörz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00330256">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Koop, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199 (2), 193-201 (1996).</li>
<li>Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003194220089679X">Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts.</a> Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).</li>
<li>Lin, W., Wittenbach, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+proteases+in+wheat+and+corn+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).</li>
<li>Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+cadmium+and+cadmium-binding+peptides+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves.</a> Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defence+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16(2009).</li>
<li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+polyubiquitin+genes%3A+structure%2C+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing%2C+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li>
<li>Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v335/n6189/abs/335454a0.html">Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts.</a> Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).</li>
<li>Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+fungal+elicitor+regulation+of+a+plant+defense+gene+promoter+in+electroporated+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).</li>
<li>Cocking, E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v187/n4741/abs/187962a0.html">A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.</a> Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li>
<li>Crossway, A., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00331634">Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).</li>
<li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li>
<li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Transduction%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li>
<li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9028-4">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li>
<li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-011-0002-z">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li>
<li>Grun, P., Chu, L. -J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2442587">Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae).</a> Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).</li>
<li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+protoplasts%3A+status+and+biotechnological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li>
<li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poinsettia+protoplasts-a+simple%2C+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14(2012).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).</li>
<li>Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+domestication%3A+the+origin%2C+genetic+architecture+and+molecular+bases%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases.</a> New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).</li>
<li>Yang, Y., Li, R., Qi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+plant+promoters+and+transcription+factors+by+agroinfiltration+of+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.</a> Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).</li>
<li>Marion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+protein+subcellular+localization+and+interaction+using+high-throughput+transient+transformation+of+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings.</a> Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).</li>
<li>Wu, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGROBEST%3A+an+efficient+Agrobacterium-mediated+transient+expression+method+for+versatile+gene+function+analyses+in+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings.</a> Plant methods. 10 (1), 19(2014).</li>
<li>Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+constitutive+viral+promoters+in+transgenic+soybean+roots+and+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules.</a> Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).</li>
<li>Nagamatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+soybean+genes+involved+in+flavonoid+biosynthesis+by+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing.</a> Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).</li>
<li>Juvale, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+Bean+pod+mottle+virus-induced+gene+silencing+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean.</a> Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).</li>
<li>Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+efficient+multipurpose+bean+pod+mottle+virus+viral+vector+set+for+foreign+gene+expression+and+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing.</a> Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).</li>
<li>Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mesophyll+protoplasts+from+mature+leaves+of+soybeans%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans.</a> Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-repeat+MYB+transcription+factor%2C+GmMYB176%2C+regulates+CHS8+gene+expression+and+affects+isoflavonoid+biosynthesis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean.</a> Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).</li>
<li>Faria, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAC+domain-containing+protein%2C+GmNAC6%2C+is+a+downstream+component+of+the+ER+stress-and+osmotic+stress-induced+NRP-mediated+cell-death+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway.</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).</li>
<li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+DREB1%2FCBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11992820">GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu iletişim kuralı soya önceki ve geçici ifade çalışmaları uygulama yalıtım için kapsamlı biçimde sınanmış ve çok iyi bizim laboratuarında çalışıyor. Yordamlar basit ve kolay ve sıradan ekipman ve minimum maliyet gerektirir. Bizim protokol Tekdüzen, yüksek kaliteli önceki daha önce bildirilen yöntemler34,35,36,37,38için karşılaştırıldığında büyük miktarlarda ü...

Önceki hücre duvarlarının kaldırılması içeren bitki hücreleri vardır. Onlar özelliklerin çoğunu ve bitki hücreleri faaliyetlerinin sürdürdükçe, önceki gözlemlemek ve çeşitli hücresel olaylar değerlendirmek için bir iyi model sistemi vardır ve somatik melezleştirme1 çalışma ve rejenerasyon2bitki değerli araçlardır. Hücre duvarları aksi halde DNA hücre içine geçişini engellemek istiyorsunuz bu yana önceki bitki dönüşümü3,4,5için aynı zamanda yaygın olarak kullanılan. Önceki bazı fizyolojik tepkilerin ve dolayısıyla hücre altı protein Yerelleştirme6,7,8çalışmaya temel araştırma temel değeri sunan sağlam bitkilerin hücresel süreçler sahip, protein-protein etkileşimleri9,10ve organizatörü etkinliği11,12,13 ' te hücreleri yaşıyor.
Bitki önceki yalıtım ilk 196014 ' te bildirildi ve protokolleri yalıtım ve önceki dönüşümü için geliştirilen ve en iyi duruma getirilmiş. Standart bir prosedür protoplast tecrit yaprakların kesme ve Enzimatik sindirim yayımlanan önceki ayrılması tarafından sindirilmiş sigara doku enkazı takip hücre duvarlarının içerir. Dönüşüm stratejileri elektroporasyon15,16, mikroenjeksiyon17,18ve polietilen glikol tabanlı (PEG)4,5,19 yöntemleri içerir. Türlerin geniş bildirilmiştir protoplast yalıtımı, narenciye20, Brassica21, Solanaceae22 ve diğer süs bitki aileler23,24gibi başarılı. Çeşitli doku tipleri çeşitli türler ise, Arabidopsis mesophyll işgal (TEAMP) geçici ifade Arabidopsis thaliana modeli bitki yapraklarından izole bir sistem iyi kurulmuş25 oldu ve çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kabul edilen.
Soya (Glycine max (L.) Merr'e.) bir en önemli protein ve yağ26kırpar. Arabidopsis ve pirinç aksine, transgenik soya bitkiler elde etmek oldukça zor ve düşük verimlilik olduğu bilinmektedir. Agrobacterium tumefaciens-aracılı infiltrasyon halk kullanılan tütün27 ' deki epidermal hücrelerin ve fidan Arabidopsis28,29, geçici gen ifade araştırmaları için ise Agrobacterium rhizogenes kıllı soya30kökleri dönüştürme için kullanılmıştır. Virüs kaynaklı gene yaklaşımlar susturmak için hedef genlerin31,32 ve geçici ifade33 downregülasyon sistemik bir şekilde kullanılmıştır. Önceki bu yaklaşımlar için değerli ve çok yönlü bir alternatif sağlar. Önceki soya'nın yerüstü malzemelerden elde edilebilir ve hızlı ve senkronize transgene ifade sağlar. Ancak, soya önceki341983 yılından bu yana ilk başarılı yalıtım sınırlı rapor edilmiştir önceki soya35,36,37, ve uygulamaya 38, öncelikle soya önceki nispeten düşük verimleri nedeniyle.
Burada, soya önceki yalıtım için basit ve etkili iletişim kuralı ve uygulama geçici gen ifade Etütler açıklayın. Soya fidan genç unifoliate yaprakları kullanarak, biz büyük miktarda hayati önceki birkaç saat içinde elde edebildik. Buna ek olarak, basit ve düşük maliyetli DNA soya önceki yüksek verimlilik ile teslim etmek PEG-kalsiyum-aracılı dönüşüm yöntemi optimize.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pektolyaz Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>SELÜLAZ "ONOZUKA" R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZİM R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biyomedikal</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DTT Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>naylon örgü</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Plakaları</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plazmid mini hazırlık kiti</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plazmid Mini Hazırlık Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Kontrol Cihazı</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmaz, RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Yenidoğan Buzağı Serumu</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Toprak</td><td>Ingram'ın Fidanlık</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perliti</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpido Kumu</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu, Lennox (Toz)</td> <td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soya (Glycine max (L.) Merr'e.) bir önemli bitki türü ve genetik ve biyokimyasal yolları araştırmalar baklagil modeli haline geldi. Bu nedenle, soya içinde bir verimli geçici gen ifade sistemi kurmak önemlidir. Burada, soya önceki hazırlanması için basit bir protokol ve geçici işlevsel analizleri için uygulama raporu. Bulduk soya fidan genç unifoliate yaprakları kaliteli önceki büyük miktarlarda sonuçlandı. PEG-kalsiyum-aracılı dönüşüm yöntemi optimize ederek, soya unifoliate önceki kullanarak yüksek dönüşüm verimliliği elde etti. Bu sistem etkin ve çok yönlü modeli karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelenmesi canlı soya hücrelerdeki için sağlar ve Bakliyat çeşitli hücresel, gelişimsel ve fizyolojik süreçleri anlamak zorunda yardım için daha iyi.

10 - gün eski soya fasulyesi farklı organları işgal hazırlık (şekil 1) için test edildi ve verimleri (Şekil 2) mikroskop altında gözlendi. Hücre duvarları hypocotyl ve epicotyl zor sindirmek ve bazı hücreler birbirine (2B şekil, 2 C) bağlı kaldı. Cotyledon (şekil 2B) ve kök (şekil 2A), hücre duvarları küçük bir hücre bölümün...

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Bu yöntemin genel amacı, canlı soya fasulyesi hücrelerindeki düzenleyici ve sinyalleşme mekanizmalarını incelemek için soya fasulyesinden yüksek kaliteli protoplast hücreleri elde etmektir. Bu yöntem, düzenleyici ağlardaki acil hedef genlerinin ne olduğu, transfüzyon faktörünün açılması ve etkileşimde bulunan partnerlerinin ne olduğu, bir protein açılması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı sanattır.Büyük miktarlarda tek tip soya fasulyesi protoplast hücreleri üretir ve basit ve kolaydır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü belirli bir aşamada birleşmediğiniz sürece soya fasulyesi yapraklarından güzel protolastlar elde etmek çok zordur. Uygun bir gelişim aşamasında yaprak seçimi, başarılı bir soya fasulyesi protoplast hazırlığının anahtarıdır.10 günlük soya fasulyesi fidelerinden yeni genişletilmiş yapraksız yaprakları kesin. Bir numunenin yüksek bir protoplast verimi verdiğinden emin olmak için, biraz farklı gelişim aşamalarında en az üç yapraksız yaprak örneği toplayın. Yeni bir tıraş bıçağıyla, her bir yapraktan orta kaburgayı çıkarın ve ardından kalıntıları 0,5 ila bir milimetrelik şeritler halinde kesin.Bir çift forseps kullanarak, yaprak şeritlerini hemen 15 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre taze hazırlanmış enzim çözeltisine nazikçe aktarın. Yaprak şeritlerini oda sıcaklığında 15 dakika vakumla süzün. Yaprak şeritlerini enzim çözeltisi içinde, oda sıcaklığında dört ila altı saat boyunca düşük ışık altında hafif çalkalama ile inkübe edin.Protoplastlar salındıkça, enzim çözeltisinin rengi sarı-yeşile dönecektir. En iyi protoplast sindirimine sahip numuneyi seçmek için enzim protoplast çözeltisini mikroskop altında 10x büyütmede kontrol edin. Serbest bırakılan protoplastlar küre şeklindedir, sindirilmemiş hücreler ise düzensiz veya oval şekillere sahiptir.Sindirimi durdurmak için, en iyi protoplast sindirimi ile 10 mililitre enzim protoplast çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpe yavaşça dökün ve oda sıcaklığında 10 mililitre W5 çözeltisi ekleyin. Tüpü birkaç kez yavaşça ters çevirin. Daha sonra, sindirilmemiş yaprak dokularını çıkarmak için enzim protoplast çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 75 mikronluk temiz bir naylon ağa yavaşça dökün.Daha sonra, enzim protoplast çözeltisinden geçen akışı oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, protoplast peletini bozmadan süpernatanı nazikçe çıkarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Protoplastı soğutulmuş W5 çözeltisinde tekrar süspanse edin ve 50 mililitrelik tüpü buz üzerinde tutun.Mikroskop altında bir hemositometrede protoplast sayısını saydıktan sonra, soğutulmuş W5 çözeltisinde mililitre başına iki kez 10 ila beşinci protoplastlar konsantrasyonuna seyreltin. Protoplastı 30 dakika buz üzerinde tutun. Süspansiyonu oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin.Ardından, protoplast peletini bozmadan W5 solüsyonunu nazikçe çıkarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Protoplastı MMG çözeltisi içinde oda sıcaklığında, mililitre başına iki kez 10 ila beşinci protoplast konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Protoplastı dönüşüme hazırlamak için, 1,5 mililitrelik düşük yapışmalı mikrosantrifüj tüplerinde 100 mikrolitrelik protoplast alikotları yapmak için kesilmemiş 200 mikrolitrelik pipet uçları kullanın.Negatif kontrol olarak hizmet etmesi için bir alikot ayırın. Kalan protoplast alikotuna 10 mikrolitre plazmit DNA ekleyin. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünün iç duvarına 110 mikrolitre taze hazırlanmış peg solüsyonunu yavaşça ekleyin.Ardından, çözelti homojen hale gelene kadar tüpü yavaşça ters çevirin ve döndürün. Dönüşüm karışımlarını oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Dönüşümü durdurmak için, oda sıcaklığında her 1,5 mililitrelik tüpe yavaşça 400 mikrolitre W5 çözeltisi ekleyin ve çözelti homojen hale gelene kadar tüpü yavaşça ters çevirin.Tüpleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Her tüpe bir mililitre WI çözeltisi ekleyin.Protoplastların plakaya yapışmasını önlemek için altı kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyu yüzeyini kaplayın. Her oyuğa bir mililitre yüzde beş steril buzağı serumu ekleyin ve birkaç saniye sonra buzağı serumunu bir pipet kullanarak çıkarın. Yeniden süspanse edilmiş protoplastları kültür plakasının kuyucuklarına aktarın ve plakayı bir kapakla örtün.Hasattan önce, protoplastları karanlıkta iki gün boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. İki gün sonra, protoplast çözeltisini 1.5 mililitrelik düşük yapışma özelliğine sahip bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin.Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın. 10 mikrolitre protoplastı bir cam slayt üzerine aktarın. Negatif kontrol olarak dönüştürülmemiş protoplastları kullanarak floresan veya konfokal mikroskopi altında floresan sinyallerini gözlemleyin.Protoplast hücreleri 10 günlük soya fasulyesinin farklı organlarından hazırlandı ve mikroskop altında gözlendi. Hipokaudal ve epikaudal hücre duvarları zor sindirildi. Ve bazı hücreler birbirine bağlı kaldı.Kuyruk kurşunu ve kökünde, hücre duvarları hücrelerin sadece küçük bir kısmında çıkarılmıştır. Buna karşılık, unifoliate kullanıldığında çok sayıda protoplast gözlendi. Bu fotoğraftaki fideler, soldan sağa, genişlememiş, yeni genişlemiş veya tamamen genişlemiş yaprakları göstermektedir.Hem genleşmemiş hem de yeni genişlemiş birleşik yapraklar yüksek protoplast verimi ile sonuçlanırken, yeni genişlemiş unifoliattan elde edilen protoplastların boyutu, genleşmemiş unifoliattan daha tekdüzeydi. Tamamen genişlemiş birleşik için, hücre duvarları hücrelerin çoğunda hala sağlamdı. Bir dizi farklı miktarda plazmit DNA'nın test edilmesi, daha büyük miktarlarda DNA'nın daha yüksek dönüşüm verimliliği ile sonuçlandığını gösterdi.Baklagillere özgü E1 genine kaynaşmış GFP'yi ifade eden yapı ile dönüştürülen soya fasulyesi protoplastlarının konfokal görüntüleri, Arabidopsis protoplast sistemini kullanan önceki çalışma ile tutarlı olarak E1 GFP füzyon proteininin nükleer lokalizasyonunu gösterdi. Bu prosedürü denerken, yaprak materyalinin doğru aşamasının seçimi, hücre duvarı sindirim süresinin uzunluğu, konsantrasyon yaşı ve transformasyon için plazmit DNA miktarı gibi her deneysel koşulu ampirik olarak optimize etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hangi genlerin veya hangi proteinlerin düzenlendiği veya düzenlenmediği gibi ek soruları yanıtlamak için RNA ve protein replikasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kaliteli soya fasulyesi protoplast hücrelerinin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

a-simple-method-for-isolation-soybean-protoplasts-application-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video 14 günlük fide Arabidopsis dokuları bozulmadan protoplast izole etmek için bir prosedür gösterir. Izole protoplast en az 96h bozulmadan kalır ve bir aylık olgun bitkilerin yerine fide izole olduğunu göz önüne alındığında, bu yordamı sağlam protoplast gerektiren testleri hızlandırır.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım...

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Bitkilerin modifikasyonu için mevcut yöntemlerin uygulanabilirliği sınırlıdır. Burada önerilen yeni peptit türevi teknoloji, eksojen protein veya genlerin bozulmamış bitkilerin istenen hücre içi bölmelerine sokulmasında hem basitlik hem de verimlilik vaat ediyor.

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Burada, mısır mezofil hücrelerinde büyük plazmid kütüphanelerini test etmek için milyonlarca mısır protoplastını geçici olarak transfekte etmek için yüksek verimli bir protokol sunuyoruz.

Mısır Mezofil Protoplastlarının Ölçeklenebilir Transfeksiyonu

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Öğrenin soya fasulyesi protoplast izolasyonu için basit bir yöntemi. Canlı hücrelerde düzenleyici mekanizmaları ve sinyal yollarını incelemek için yüksek kaliteli protoplastlar elde edin.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Daha fazla video keşfet