Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Bu yöntemin genel amacı, canlı soya fasulyesi hücrelerindeki düzenleyici ve sinyalleşme mekanizmalarını incelemek için soya fasulyesinden yüksek kaliteli protoplast hücreleri elde etmektir. Bu yöntem, düzenleyici ağlardaki acil hedef genlerinin ne olduğu, transfüzyon faktörünün açılması ve etkileşimde bulunan partnerlerinin ne olduğu, bir protein açılması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı sanattır.

Büyük miktarlarda tek tip soya fasulyesi protoplast hücreleri üretir ve basit ve kolaydır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü belirli bir aşamada birleşmediğiniz sürece soya fasulyesi yapraklarından güzel protolastlar elde etmek çok zordur. Uygun bir gelişim aşamasında yaprak seçimi, başarılı bir soya fasulyesi protoplast hazırlığının anahtarıdır.

10 günlük soya fasulyesi fidelerinden yeni genişletilmiş yapraksız yaprakları kesin. Bir numunenin yüksek bir protoplast verimi verdiğinden emin olmak için, biraz farklı gelişim aşamalarında en az üç yapraksız yaprak örneği toplayın. Yeni bir tıraş bıçağıyla, her bir yapraktan orta kaburgayı çıkarın ve ardından kalıntıları 0,5 ila bir milimetrelik şeritler halinde kesin.

Bir çift forseps kullanarak, yaprak şeritlerini hemen 15 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre taze hazırlanmış enzim çözeltisine nazikçe aktarın. Yaprak şeritlerini oda sıcaklığında 15 dakika vakumla süzün. Yaprak şeritlerini enzim çözeltisi içinde, oda sıcaklığında dört ila altı saat boyunca düşük ışık altında hafif çalkalama ile inkübe edin.

Protoplastlar salındıkça, enzim çözeltisinin rengi sarı-yeşile dönecektir. En iyi protoplast sindirimine sahip numuneyi seçmek için enzim protoplast çözeltisini mikroskop altında 10x büyütmede kontrol edin. Serbest bırakılan protoplastlar küre şeklindedir, sindirilmemiş hücreler ise düzensiz veya oval şekillere sahiptir.

Sindirimi durdurmak için, en iyi protoplast sindirimi ile 10 mililitre enzim protoplast çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpe yavaşça dökün ve oda sıcaklığında 10 mililitre W5 çözeltisi ekleyin. Tüpü birkaç kez yavaşça ters çevirin. Daha sonra, sindirilmemiş yaprak dokularını çıkarmak için enzim protoplast çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 75 mikronluk temiz bir naylon ağa yavaşça dökün.

Daha sonra, enzim protoplast çözeltisinden geçen akışı oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, protoplast peletini bozmadan süpernatanı nazikçe çıkarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Protoplastı soğutulmuş W5 çözeltisinde tekrar süspanse edin ve 50 mililitrelik tüpü buz üzerinde tutun.

Mikroskop altında bir hemositometrede protoplast sayısını saydıktan sonra, soğutulmuş W5 çözeltisinde mililitre başına iki kez 10 ila beşinci protoplastlar konsantrasyonuna seyreltin. Protoplastı 30 dakika buz üzerinde tutun. Süspansiyonu oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin.

Ardından, protoplast peletini bozmadan W5 solüsyonunu nazikçe çıkarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Protoplastı MMG çözeltisi içinde oda sıcaklığında, mililitre başına iki kez 10 ila beşinci protoplast konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Protoplastı dönüşüme hazırlamak için, 1,5 mililitrelik düşük yapışmalı mikrosantrifüj tüplerinde 100 mikrolitrelik protoplast alikotları yapmak için kesilmemiş 200 mikrolitrelik pipet uçları kullanın.

Negatif kontrol olarak hizmet etmesi için bir alikot ayırın. Kalan protoplast alikotuna 10 mikrolitre plazmit DNA ekleyin. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünün iç duvarına 110 mikrolitre taze hazırlanmış peg solüsyonunu yavaşça ekleyin.

Ardından, çözelti homojen hale gelene kadar tüpü yavaşça ters çevirin ve döndürün. Dönüşüm karışımlarını oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Dönüşümü durdurmak için, oda sıcaklığında her 1,5 mililitrelik tüpe yavaşça 400 mikrolitre W5 çözeltisi ekleyin ve çözelti homojen hale gelene kadar tüpü yavaşça ters çevirin.

Tüpleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Her tüpe bir mililitre WI çözeltisi ekleyin.

Protoplastların plakaya yapışmasını önlemek için altı kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyu yüzeyini kaplayın. Her oyuğa bir mililitre yüzde beş steril buzağı serumu ekleyin ve birkaç saniye sonra buzağı serumunu bir pipet kullanarak çıkarın. Yeniden süspanse edilmiş protoplastları kültür plakasının kuyucuklarına aktarın ve plakayı bir kapakla örtün.

Hasattan önce, protoplastları karanlıkta iki gün boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. İki gün sonra, protoplast çözeltisini 1.5 mililitrelik düşük yapışma özelliğine sahip bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin.

Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın. 10 mikrolitre protoplastı bir cam slayt üzerine aktarın. Negatif kontrol olarak dönüştürülmemiş protoplastları kullanarak floresan veya konfokal mikroskopi altında floresan sinyallerini gözlemleyin.

Protoplast hücreleri 10 günlük soya fasulyesinin farklı organlarından hazırlandı ve mikroskop altında gözlendi. Hipokaudal ve epikaudal hücre duvarları zor sindirildi. Ve bazı hücreler birbirine bağlı kaldı.

Kuyruk kurşunu ve kökünde, hücre duvarları hücrelerin sadece küçük bir kısmında çıkarılmıştır. Buna karşılık, unifoliate kullanıldığında çok sayıda protoplast gözlendi. Bu fotoğraftaki fideler, soldan sağa, genişlememiş, yeni genişlemiş veya tamamen genişlemiş yaprakları göstermektedir.

Hem genleşmemiş hem de yeni genişlemiş birleşik yapraklar yüksek protoplast verimi ile sonuçlanırken, yeni genişlemiş unifoliattan elde edilen protoplastların boyutu, genleşmemiş unifoliattan daha tekdüzeydi. Tamamen genişlemiş birleşik için, hücre duvarları hücrelerin çoğunda hala sağlamdı. Bir dizi farklı miktarda plazmit DNA'nın test edilmesi, daha büyük miktarlarda DNA'nın daha yüksek dönüşüm verimliliği ile sonuçlandığını gösterdi.

Baklagillere özgü E1 genine kaynaşmış GFP'yi ifade eden yapı ile dönüştürülen soya fasulyesi protoplastlarının konfokal görüntüleri, Arabidopsis protoplast sistemini kullanan önceki çalışma ile tutarlı olarak E1 GFP füzyon proteininin nükleer lokalizasyonunu gösterdi. Bu prosedürü denerken, yaprak materyalinin doğru aşamasının seçimi, hücre duvarı sindirim süresinin uzunluğu, konsantrasyon yaşı ve transformasyon için plazmit DNA miktarı gibi her deneysel koşulu ampirik olarak optimize etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hangi genlerin veya hangi proteinlerin düzenlendiği veya düzenlenmediği gibi ek soruları yanıtlamak için RNA ve protein replikasyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kaliteli soya fasulyesi protoplast hücrelerinin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.