Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Bu prosedürün genel amacı, hedef proteinlerdeki plazmodesmata lokalizasyon sinyalini tanımlamaktır. Yöntem, proteinleri plazmodesmataya yönlendiren sinyallerdeki kritik düşünceyi belirleyerek bitkilerin hücreler arası bağlantılarını incelerken temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve bu da büyük molekülerlerin hücreden hücreye taşınmasını kolaylaştırır. Bu tekniğin ana avantajı, prosedürün güvenilir olması ve çoğu plazmodesmata hedefli proteinde plazmodesmata lokalizasyon sinyal dizilerinin keşfi için kolayca uyarlanabilmesidir.

Bu yöntemin video gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü ekim, filtreleme ve konfokal gözlem adımlarına hazırlık, tipik baskı tabanlı yayınla öğrenilmesi zordur. Nicotiana benthamiana tohumlarını ıslak toprağa ve yüksek yoğunlukta ekin. Büyürken, onları 20 ila 25 santigrat derecede ve günde 16 saatin altında kontrollü bir çevre odasında tutun, bu da saniyede metre kare başına yaklaşık 75 mikromol foton içerir.

U. fil'in çapı yarım santimetreye ulaştıktan sonra, fideleri dikkatlice daha büyük saksılara aktarın ve aynı koşullar altında aynı haznede büyümelerine devam edin. Bitkileri dört hafta içinde dört ila sekiz yaprak aşamasına gelene kadar koruyun.

Bu noktada, en büyük yaprakların çapı dört ila altı santimetre olmalıdır. Kolay tanımlama ve analiz için, bir ekspresyon sistemi seçin ve ifade edilen her proteini beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi floresan olarak etiketleyin. Tarif edildiği gibi pPZP-RCS2 bazlı bir plazmit hazırlayın ve bunun bir mikrogramını Agrobacterium tumefaciens'ten 100 mikrolitrelik yetkin hücre kültürüne ekleyin.

Hücreleri 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Ardından, hücreleri bir dakika boyunca sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Daha sonra, hücreleri 28 santigrat derecede 15 dakika ısıtın ve ardından yetkili hücre karışımına bir mililitre LB ortamı ekleyin.

LB ortamını ekledikten sonra, hücreleri iki saat boyunca 28 santigrat dereceye geri koyun. Daha sonra, hücreleri bir dakika boyunca 3.000 kez G'de döndürün. Hücre peletini 0.2 mililitre LB ortamında yeniden süspanse edin ve bunları antibiyotik seçici LB agar plakaları üzerine koyun.

Plakalardaki hücreleri, tek tek koloniler görünene kadar 48 saat boyunca 28 santigrat derecede büyütün. Daha sonra, birkaç ayrı koloniyi taze LB agar plakalarına alın ve plakalayın ve hücreleri 48 saat boyunca 28 santigrat derecede büyütün. Daha sonra, analiz için her plakadan az miktarda bakteri alın ve ilgilenilen spesifik ikili yapıların varlığını doğrulamak için Colony PCR kullanın.

Her bir agrobacterium kolonisini, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre LB ortamına ilgilenilen yapıya ekleyin. Hücreleri gece boyunca 28 santigrat derecede büyütün. Daha sonra, hücreleri 3.000 kez G'de santrifüjleyin. Pelet, agroinfiltrasyon tamponunda 0.5'lik bir OD600'e yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu oda sıcaklığında iki saat inkübe edin ve ardından aşıyı bir mililitrelik plastik şırıngaya yükleyin. Tamamen olgunlaşmış bir N.Benthamiana yaprağını eldivenli bir parmakla adaksiyal yüzünde tutarak, şırınganın ağzını yaprağın alt epidermisine doğru bastırın. Daha sonra, ortamı enjekte ederek agrobakteriyi infiltrasyon ortamına yavaşça sokun.

Sızan bitkiyi gözlemlenene kadar koruyun. Her yaprağı sızmadan 24 ila 48 saat sonra damarlar arasında parçalara ayırmak için bir bıçak kullanın. Yaprak dilimlerini, abaksiyal yaprak yüzeyi yukarı bakacak şekilde nesne slaytına yerleştirin.

Daha sonra yaprak diliminin üzerine bir damla su damlatın ve üzerini kapak camı ile kapatın. Kapak camını her iki tarafta küçük bant parçalarıyla hareketsiz hale getirin. Bir slaytı lazer taramalı konfokal mikroskobun altına aktarın ve en iyi sinyale sahip hücreleri tanımlamak için 10X subjektif lens kullanın.

Ardından, daha ayrıntılı gözlemler için görüntüleri kaydetmek üzere 63X öznel lens kullanın. Ek olarak, ifade edilen floresan proteinleri uyarmak için uygun floresanları kullanın. Deneyler arasındaki tutarlılığı korumak için görüntü alımı için kullanılan tüm ayarları koruyun.

Ortalama olarak, her deney koşulu için 100 ila 120 hücreyi inceleyin. Konfokal mikroskop görüntülerini kullanarak test edilen proteinlerin lokalizasyonunu teşhis edin. Bu görüntüler, kargo molekülü CFP'ye kaynaşmış tam uzunlukta TMV hareket proteini ve CFP'ye kaynaşmış tanımlanmış plazmodesmata lokalizasyon sinyali için gözlemlenen karakteristik periferik punktat plazmodesmata lokalizasyon modellerini ve ayrıca DsRed'e kaynaşmış birlikte eksprese edilen plazmodesmata lokalizasyon proteini PDCB1 için gözlenen modelleri göstermektedir.

Kontrol koşulları altında, CFP'ye kaynaşmış tam uzunlukta TMV hareket proteininin ve CFP'ye kaynaşmış TMV hareket proteinindeki lokalizasyon sinyalinin plazmodesmata hedeflemesi, burada CFP'nin hücre altı lokalizasyonu ve DsRed belirtecinin nükleositoplazmik lokalizasyonu ile gösterildiği gibi görünür2. Dördüncü amino asit olan valin, bir alanine mutasyona uğradığında, hem tam uzunlukta TMV hareket proteini hem de TMV hareket proteininde tanımlanan lokalizasyon sinyali tarafından hedeflenen plazmodesmata kaybolur. Bu, bu kalıntının plazmodesmata lokalizasyon sinyal yapısı veya işlevi için önemli olduğunu gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa 50 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, bitkilerin çok sağlıklı durumda olduğunu ve bitkilerin doğru yaprak aşamasında olduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, sadece plazmodesmata lokalizasyon protein sinyalini nasıl tanımlayacağınızı değil, aynı zamanda bitki proteinlerindeki diğer belirli sinyalleri nasıl tanımlayacağınızı da iyi anlamalısınız.