Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Bu prosedürün genel amacı, hedef proteinlerdeki plazmodesmata lokalizasyon sinyalini belirlemektir. Bu yöntem, proteinleri plazmodesmatalara yönlendiren ve böylece büyük moleküllerin hücreden hücreye taşınmasını kolaylaştıran sinyallerdeki kritik unsurların tanımlanması yoluyla, bitkilerin hücreler arası bağlantılarını inceleyen temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, prosedürün güvenilir olması ve çoğu plazmodesmata hedefli proteinlerdeki plazmodesmata lokalizasyon sinyal dizilerinin keşfi için kolayca uyarlanabilmesidir.

Dikim filtrasyonu ve konfokal gözlem hazırlık aşamaları tipik basılı yayınlarla öğrenilmesi zor adımlar olduğundan, bu yöntemin video gösterimi kritik öneme sahiptir. Nicotiana benthamiana tohumlarını ıslak toprağa ve yüksek yoğunlukta dikin. Büyüme aşamasında, bitkileri 20 ila 25 °C sıcaklıkta, günde 16 saat ışık altında ve saniyede metrekare başına yaklaşık 75 µmol foton içeren kontrollü bir çevre odasında tutun.

u. fil çapı yarım santimetreye ulaştığında, fideleri dikkatlice daha büyük saksılara aktarın ve büyümelerine aynı oda içerisinde aynı koşullar altında devam edin. Bitkileri, dört hafta içerisinde dört ila sekiz yapraklı evreye gelene kadar muhafaza edin.

Bu aşamada, en büyük yaprakların çapı dört ila altı santimetre olmalıdır. Kolay tanımlama ve analiz için bir ekspresyon sistemi seçin ve her bir eksprese edilen proteini ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde floresanla işaretleyin. Açıklandığı şekilde pPZP-RCS2 tabanlı bir plazmit hazırlayın ve bunun bir mikrogramını, Agrobacterium tumefaciens'ten elde edilen kompetan hücrelerin 100 mikrolitrelik kültürüne ekleyin.

Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Ardından, hücreleri sıvı azot içerisinde bir dakika boyunca şok dondurun. Daha sonra, hücreleri 28 °C'de 15 dakika boyunca ısıtın ve ardından kompetan hücre karışımına bir mililitre LB ortamı ekleyin.

LB besiyerini ekledikten sonra, hücreleri iki saat boyunca 28 °C'de bekletin. Ardından, hücreleri 3.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini 0,2 mL LB besiyerinde yeniden süspanse edin ve antibiyotikli seçici LB agar plaklarına ekin.

Hücreleri, tekil koloniler görünür hale gelene kadar 48 saat boyunca 28 °C'de plakalarda büyütün. Ardından, birkaç tekil koloniyi seçerek taze LB agar plakalarına ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca 28 °C'de büyütün. Daha sonra, analiz için her plaktan az miktarda bakteri alın ve ilgilenilen spesifik biner konstrüktlerin varlığını doğrulamak için Koloni PCR'ı uygulayın.

İlgili konstrükte sahip her bir agrobacterium kolonisini, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre LB besiyerine ekleyin. Hücreleri 28 °C'de gece boyunca büyütün. Ardından, hücreleri 3,000 ×g'de santrifüjleyin. Peleti, agroinfiltrasyon tamponunda 0,5 OD600 değerine ulaşacak şekilde yeniden süspande edin.

Süspansiyonu oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin ve ardından inokülumu bir mililitrelik plastik bir şırıngaya doldurun. Tam olgunlaşmış bir N.Benthamiana yaprağını, eldivenli bir parmağınızla adaksiyel yüzeyden tutarak, şırınganın ucunu yaprağın alt epidermisne bastırın. Daha sonra, infiltrasyon ortamındaki agrobacterium'u ortamı enjekte ederek yavaşça içeri aktarın.

İnfiltre edilmiş bitkiyi, gözlem yapılana kadar muhafaza edin. İnfiltrasyondan 24 ila 48 saat sonra, her bir yaprağı damarlar arasından parçalar halinde kesmek için bir bistüri kullanın. Yaprak dilimlerini, abaksiyel yaprak yüzeyi yukarı bakacak şekilde nesne lamı üzerine yerleştirin.

Ardından, yaprak kesitinin üzerine bir damla su damlatın ve üzerini kapatma camı ile örtün. Kapatma camını her iki yanından küçük bant parçalarıyla sabitleyin. Bir lamı lazer taramalı konfokal mikroskobun altına yerleştirin ve en iyi sinyale sahip hücreleri belirlemek için 10X objektif lens kullanın.

Ardından, daha detaylı gözlemler için görüntüler kaydetmek amacıyla 63X objektif lens kullanın. Ek olarak, eksprese edilen floresan proteinleri uyarmak için uygun floresanları kullanın. Deneyler arasında tutarlılığı korumak için görüntü elde etmede kullanılan tüm ayarları saklayın.

Her bir deneysel koşul için ortalama 100 ila 120 hücreyi inceleyin. Konfokal mikroskop görüntülerini kullanarak test edilen proteinlerin lokalizasyonunu belirleyin. Bu görüntüler, kargo molekülü CFP ile birleştirilmiş tam uzunluktaki TMV hareket proteininin, CFP ile birleştirilmiş tanımlanan plazmodesmata lokalizasyon sinyalinin ve aynı zamanda DsRed ile birleştirilmiş, birlikte eksprese edilen plazmodesmata lokalizasyon proteini PDCB1 için gözlenen karakteristik periferik noktasal plazmodesmata lokalizasyon modellerini göstermektedir.

Kontrol koşulları altında, CFP'ye füzyone edilmiş tam uzunluktaki TMV hareket proteininin plazmodesmata hedeflemesi ve CFP'ye füzyone edilmiş TMV hareket proteinindeki lokalizasyon sinyali, CFP'nin hücre altı lokalizasyonu ve marker DsRed2'nin nükleositoplazmik lokalizasyonu ile burada gösterildiği gibi görünmektedir. Dördüncü amino asit olan valin, alanine mute ettiğinde, hem tam uzunluktaki TMV hareket proteininin hem de TMV hareket proteininde tanımlanan lokalizasyon sinyalinin plazmodesmata hedeflemesi kaybolur. Bu durum, söz konusu kalıntının plazmodesmata lokalizasyon sinyal yapısı veya fonksiyonu için önemli olduğunu göstermektedir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde 50 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, bitkilerin çok sağlıklı durumda olduğundan ve uygun yaprak evresinde bulunduğundan emin olmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, yalnızca plazmodesma lokalizasyon protein sinyallerinin nasıl tanımlanacağını değil, aynı zamanda bitki proteinlerindeki diğer belirli sinyallerin nasıl tanımlanacağını da iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.