Name: Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Öğrenin, split-BioID ile yerel hücresel ortamlarda bağlam bağımlı protein komplekslerini yüksek çözünürlüklü analiz etme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerde dinamik protein etkileşimlerini keşfetmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmalar Alman Araştırma Konseyi (DFG) Alman mükemmellik girişimi (CellNetworks DFG-hariç 81) ve SFB638 ortak araştırma merkezi tarafından kısmi bir finansman yoluyla destekleriyle gerçekleştirilmiştir.

<ol><li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules%2C+big+targets%3A+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li>
<li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li>
<li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li>
<li>Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50(2009).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li>
<li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Asc1p%2FReceptor+for+Activated+C+Kinase+1+%28RACK1%29+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li>
<li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962(2017).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSITe%3A+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li>
<li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li>
<li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID%3A+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039(2017).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/10/02/196980">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Seviyelendirilmiş yordamı genler ilgi Böl-BioID clone Plazmidler, etkileşim kaynaklı biotinylation için test edileceğini ve kütle spektrometresi analiz için biotinylated proteinler yalıtmak nasıl açıklar. Biz burada geçici transfection dayalı bir açıklayınız. Ifade füzyon proteinlerin Orta olarak eklendi dox miktarına göre ayarlanmış olsa da, geçici transfection fena halde endojen için karşılaştırıldığında füzyon protein overexpress bazı hücreler homojen olmayan protein ifadeyle neden olabilir meslektaşları. Bu distorsiyonları karşılık gelen interactomes ve sadakatle endojen protein içeren etkileşimlerin yansıtmıyor PPI neden olabilir. Böylece Böl-BioID ile geçici sistem kurulduktan sonra istikrarlı hücre hatları oluşturmak için genellikle tavsiye edilir. Plazmid Flp aracılı rekombinasyon sistemi ile uyumlu ve faiz aynı tet-yanıt veren öğe düzenleme altında her iki genler yer. Gerekirse ve uyumlu memeli hücreleri ile kullanıldığında, onlar istikrarlı indüklenebilir hücre hatları kolay oluşturulmasına olanak sağlar. Örneğin, rtTA transkripsiyon tetrasiklin-harekete geçirmek harekete geçirmek ve benzersiz bir targetable genomik locus tetrasiklin-aracılı gen ekspresyonu sıkıca düzenlenmiş12olabilen ifade HeLa-EM2-11 satırını kullanın. Bu hücre kültürünü ve Flp aracılı rekombinasyon kullanarak, tek bir kopyasını transgene içeren istikrarlı hücre hatları iki-üç hafta içinde elde edilebilir. Alternatif olarak, bir de yerel genomik loci ilgi genlerin içinde BirA * parçaları tanıtmak için geçerli genom düzenleme teknikleri kullanabilirsiniz.
Bir protein etiketleme dayanır herhangi bir tahlil olduğu gibi bir sonuç füzyon protein fonksiyonel olup olmadığını düşünün gerekir. Kullanılabilir veri hangi faiz proteinler (örneğin için çalışmalar düşsel GFP) takip ve işlevsel test yararlıdır BirA * parçaları olmalıdır karar için yukarı veya aşağı faiz genler klonlanmış. Böyle bir veri yoksa, bir N-ölümcül sınamanız gerekir veya C-ölümcül öğesini proteinler işlevsel bir tahlil. Örneğin, füzyon proteinlerin etkinlik içinde endojen protein edilmiş çaldı-out ve vahşi türü duruma kıyasla bir hücre kültürünü test edilebilir. Proteinler ilgi her iki N ve C terminali Etiketler hoş görürsen, her ikisi de test edilmelidir. Gerçekten de, BioID deneylerde füzyon protein yönünü22etiketleme verimliliğini etkileyebilir. Böl-BioID protein bir çift için uygulamak, hangi iki proteinlerin ya NBirA * için eklenir veya CBirA * parçalara ayırması da etkisi9etiketleme verimliliğini biz bu Ayrıca, gözlemledim. Böl-BioID plazmid 16 amino asit uzun glisin/zengin bağlayıcı proteinler ilgi BirA * parçaları için kaplin başka bir PCA23 almış ve bizim için tüm etkileşen proteinler için çalıştı serin defa test ettik. Ancak, bir bazı protein çiftleri daha kısa veya daha uzun halkalı ile daha iyi işe yarayabilecek düşünmelisiniz. Son Not başka bir tahlil Bollen grup24tarafından tanımlanmıştır. Bu tahlil, BirA * bizimkinden (E256/G257) başka bir yerinde (E140/Q141) ayrılmıştır. Biz her iki Böl-BioID tatlar-yan yana test ve E256/G257, bu protokol için açıklanan iki etkileşen protein birleştiğinde daha güçlü yeniden etkinleştirme yol açar bulunan9.
Bu yöntemin bir dezavantajı genel etiketleme yavaş hızıdır. Tipik olarak, 6-24 h kuluçka biotin zamanla kayda değer biotinylation6protein kompleksleri dinamik modelleme eğitimi için bu tekniğin kullanımı engellemek, elde etmek gereklidir. İki protein etkileşim kurulduğunda sadece aktif olarak bu tahlil kısmen bu bilmeniz gereken adresleri ise çok dinamik süreçler için ya da kısa ömürlü proteinlerin analiz etmek için çalışmak için kullanımı engel etiketleme yavaş hızı. Mühendislik peroksidaz APEX2 1 dk3içinde proksimal proteinlerin verimli etiketleme teşvik bilinmektedir. APEX2 üzerinde dayalı bir PCA böylece BioID kaynaklı deneyleri yavaş etiketleme hız sınırlamaları adresi. Bir kanıt prensibi çalışma böyle bir split-APEX2 tahlil25nitelendirdi. Bir homodimerizing protein başarıyla biotinylated olsa da, ancak, tahlil de etiket ve etkileşen proteinler bir çift bir araya proteinler tanımlamak için kullanılıp kullanılamayacağı göstermiş kalmaya devam eder. Son zamanlarda, yönlendirilmiş evrim TurboID ve miniTurbo, 10 dk26aşağı daha kısa etiketleme zaman windows sağlayan iki çeşidini BirA * gelişmiş aktivite ile oluşturmak için kullanılan. Böl-BioID bu yeni çeşitleri için adapte uygulamaların daha geniş bir alana bu tekniğin kullanımı daha da uzatır.

En hücresel işlevler dinamik olarak makromoleküllerin kompleksleri araya proteinler tarafından gerçekleştirilen gibi protein-protein etkileşimleri (PPI) kimlik Biyomedikal Araştırma büyük bir çaba değildir. Nitekim, ÜFE kez hastalığında deregüle ve tedavi1için potansiyel hedefleri temsil eder. ÜFE tanımlaması benzeşme arıtma (AP) yaklaşım olan, için en yaygın yöntem kullanılan hücre lizis, ardından bir protein ilgi özellikle bir matris üzerinde saflaştırılmış ve ilişkili proteinler daha sonra kütle spektrometresi tarafından tespit (MS). AP-MS güçlü bir yaklaşım olmakla birlikte, bu genellikle de kötü çözünür protein kompleksleri, geçici çok etkileşimler veya sağlam bir hücre altı yapısı gerektiren PPI gerçekleştirmez. Ayrıca, tek bir protein genellikle birkaç farklı protein kompleksleri parçası olarak verilerin yorumlanması PPI ağlar, dinamik doğası gereği karmaşık.
BioID2 veya APEX23,4 gibi teknikleri yakınlık etiketleme son zamanlarda bazı AP-MS yaklaşımlar sınırlamaları gidermek üzere geliştirilmiştir. BioID içinde enzim BirA * (yabani tip e.coli enzimi G115R değişkenine karşılık gelen) değişken biotinyl-AMP ile Birincil aminler tepki verebilir (biyo-AMP) tromboksan. Biyo-AMFİ için aktif merkezini korur, vahşi türü enzim aksine BirA * biyo-AMP kendi Difüzyon komşu çevresi için izin serbest bırakır. Bu nedenle, faiz bir protein için erimiş ve hücrelerde ifade, proksimal proteinler 10 nm5tahmini bir yelpazesi içinde biotinylated olabilir. Bunlar işaretlenmiş proksimal proteinler sonra streptavidin açılan tarafından izole ve MS tarafından tanımlanan. AP-MS karşı BioID bir füzyon protein ifadesi gerektirir. Bu böylece sadece fonksiyonu etiketleyerek engel değil proteinler için uygulanabilir. Ayrıca, etiketleme hızı genellikle yavaş, 6-24 h2,6kısa ömürlü proteinlerin algılama zorlu yapma,. Henüz, AP-MS için karşılaştırıldığında, BioID-MS birkaç önemli avantajlar sunuyor: ilk, onun yakalar etkileşimleri kendi yerel hücresel ortamında; birleştirilmiş kompleksleri yerine ikinci, etiketli proteinler hücre lizis izole edilmiştir; Üçüncü olarak, streptavidin pulldowns denaturing arabellekleri ve sert çamaşır koşulları kullanarak izin veriyoruz. Bu nedenle, daha hassas geçici veya zayıf etkileşimler7 veya belirli bir ortaya etkileşimleri algılamaya ve hücre altı yapısı8yalıtmak zor yöntemidir.
Ancak, çoğu proteinler genellikle hücresel cues göre ya da yapılması gereken işlevine yeni model daha büyük kompleksler bir parçasıdır. Bu nedenle, tek bir protein genellikle birkaç kompleksleri, farklı işlevsel birimler için karşılık gelen, farklı içeren ve/veya ÜFE örtüşen bir parçasıdır. Her iki yaklaşımın tüm ilişkilendirmeleri verilen bir protein olabilir genel bir bakış vermek, ama onlar bireysel PPI bağlamında adrese başarısız. İkinci çözünürlüğü artırmak için biz bir protein parçaları uluslara tahlil (PCA) hangi iki etkin olmayan parçaları BirA * (NBirA * katalitik etki alanı içeren ve CBirA * yeniden etkinleştirme etki alanı olarak görüntülenebilir) olabilir tasarladık tekrar yakın iki tarafından getirdiğinde etkin bir enzim içine proteinler9etkileşim. Elde edilen Böl-BioID tahlil yakınlık bağımlı biotinylation etkileşen proteinler bir çift bir araya ve böylece bağlam kimliği bağımlı protein derlemeler sağlayan proteinler üzerinde odaklanır. Son zamanlarda iki ayrı protein kompleksleri miRNA-aracılı gen susturmak yolu9' dahil çözülerek Böl-BioID en iyi çözünürlük gücünü gösterdi.
Özet olarak, bir tek ve basit yöntemi, keşfetmek ve özellikle PPI içinde belirli bir protein dahil, karşılık gelen protein kompleksi ek bir etkileşen protein bilinen sağlanan tanımlanmış işlevsel birimleri için atama Böl-BioID sağlar.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit (buzul)</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td>TAE tamponu yapmak için</td></tr><tr><td>Agaroz</td>, <td>Sigma</td><td>A9539</td>, <td>DNA analizi ve ekstraksiyonu için TAE-agaroz jelleri alın</td></tr><tr><td>, Amonyak çözeltisi, %25 NH3</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td>, <td>Biotin'i çözmek için</td></tr><tr><td>Ampisilin</td>, <td>Sigma</td><td>A9518</td>, <td>Dönüştürülmüş bakterileri seçmek için</td></tr><tr><td>, Bioruptor plus sonifikasyon cihazı</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Diğer sonifikasyon cihazları da tamam</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>Verimli biyotinilasyonu uyarmak için büyüme ortamına eklenecek</td></tr><tr><td>Sığır serum albümin fraksiyonu V</td><td>Carl Roth</td><td>8076</td><td>Western blot tamponlarında ve Bradford tahlillerinde bir protein standardında kullanılır</td></tr><tr><td>Bradford Ultra reaktifi</td><td>Expedeon</td><td>BFU05L</td><td>Protein tayini için başka herhangi bir yöntem/kit iyidir, bu özel reaktif, deterjana diğer Bradford reaktiflerinden daha toleranslıdır</td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcılar</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>Başka herhangi bir model de iyidir</td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>Bölünmüş BioID plazmitlerine klonlama için kısıtlama enzimi (NBirA* füzyonu)</td></tr><tr><td>DMEM ortamı</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td>Başka bir hücre hattı kullanıyorsanız, ilgili optimal büyüme ortamını kullanın</td></tr><tr><td>DNA miniprep kiti</td><td>Sigma</td><td>PLN350</td><td>Diğer herhangi bir kit de iyidir</td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Aplikesi</td><td>A2951</td><td>Dox ışığa duyarlıdır</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Uygulaması</td><td>A2948</td><td>1M stok çözeltisi yapın, -20 ° C'de saklayın; C ve her zaman taze</td></tr><tr><td>DyLight 680-konjuge streptavidin</td><td>Thermo scientific</td><td>21848</td> kullanın <td>LiCor Western leke tarama cihazı</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>C1 boncukları BSA kaplı değildir, bu da aşağı akış MS uygulamaları için tercih edilir (son elüsyonda BSA'dan sızıntı olmaz)</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>Uygulaması</td><td>A5097</td><td>500 mM'lik bir stok yapın, EDTA tozunu çözerken pH'ı 8'e ayarlayın</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>32205</td><td>Doksisiklin'in 10 mg.mL-1</td></tr><tr><td>Fastgene Jel/PCR DNA Ekstraksiyon Kiti'nde</td> çözülebildiği %70'lik bir stok çözeltisi yapın <td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>Başka herhangi bir kit de iyidir</td></tr><tr><td>HCl %37</td> <td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td>Biotin stok çözeltisinin pH değerini ayarlamak için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763</td><td>500 mM'lik bir stok çözeltisi yapın, pH'ı 7.4</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF membranı, 0.45&nbsp; &mikro; m</td><td>Millipore IPFL00010</td><td></td><td>Bu membran, bir LiCor Western leke tarama cihazı</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Gr&uuml ile kullanıldığında minimum otofloresan gösterir; ssing GmbH</td><td>12083</td><td>5M stok çözümü yapın</td></tr><tr><td>Odyssey CLx görüntüleme sistemi</td><td>LI-COR</td><td>N/A</td><td>Florofor etiketli antikor ile süslenmiş Western blot membranını taramak için</td></tr><tr><td>Doğrusal polietilenimin (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>Diğer herhangi bir transfeksiyon reaktifi de iyidir</td></tr><tr><td>Süt tozu</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>Western leke zarlarını bloke etmek için</td></tr><tr><td>MluI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>Bölünmüş BioID plazmitlerine klonlama için kısıtlama enzimi (NBirA* füzyonu)</td></tr> <tr><td>Na-deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>%10 (a/h) stok çözeltisi yapın</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>5M stok çözeltisi yapın</td></tr><tr><td>NP-40 (Nonidet P40 ikamesi)</td> <td>Sigma</td><td>74385</td><td>%20 (h/h) stok çözümü yapın</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>Bölünmüş BioID plazmitlerine klonlama için kısıtlama enzimi (CBirA* füzyonu)</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin (PBS)</td><td>Sigma</td><td>806552</td> PmeI New England Biolabs'ı <td>hurdaya çıkarmadan önce hücreleri yıkamak için</td></tr><tr><td></td><td></td><td>R0560</td><td>Bölünmüş BioID plazmitlerine klonlama için kısıtlama enzimi (CBirA* füzyonu)Proteaz</td></tr> <tr><td>inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Proteini önlemek için lizis tamponuna eklenir bozunma</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90003</td><td>Split-BioID plazmid, NBirA*-FKBP ve CBirA*-FRB'nin birlikte ekspresyonuna aracılık eder, FKBP ve FRB diğer iki ORF ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90004</td><td>Split-BioID plazmid, FKBP-NBirA* ve CBirA*-FRB'nin birlikte ekspresyonuna aracılık eder, FKBP ve FRB diğer iki ORF ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90008</td><td>Split-BioID plazmid, NBirA*-FKBP ve FRB-CBirA*'nın birlikte ekspresyonuna aracılık eder, FKBP ve FRB diğer iki ORF ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>Split-BioID plazmid, FKBP-NBirA* ve FRB-CBirA*'nın birlikte ekspresyonuna aracılık eder, FKBP ve FRB diğer iki ORF ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Kaliteli PCR kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>Test edilecek proteinler için ORF kodlamasını amplifiye etmek. Diğer herhangi bir termostabil DNA polimeraz iyidir.</td></tr><tr><td>Hızlı ligasyon kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>DNA parçalarını bölünmüş BioID plazmitlerine bağlamak için başka herhangi bir DNA ligasyon sistemi yeterlidir.</td></tr><tr><td>RunBlue %4-20 SDS prekast jeller</td><td>Expedeon</td><td>BCG42012</td><td>MS analizi için numuneleri çalıştırırken kullanmak üzere</td></tr><tr><td>RunBlue LDS Numune Tamponu</td><td>Expedeon</td><td>NXB31010</td><td>RunBlue prekast jeller</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td> için çalışan tampon <td>%20 stok solüsyon olarak gelir</td></tr><tr><td>Tet içermeyen serum</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>Füzyon proteinlerinin bazal ekspresyonunu en aza indirmek için tet içermeyen serum kullanıyoruz</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td>Yüksek hızlı Western blotting transfer sistemi, diğer herhangi bir transfer sistemi de iyidir</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855</td><td>Yeterli pH (7.4 ve 8) ile 1M stok çözeltileri yapın</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975</td><td>%20 (h/h) stok çözeltisi yapın</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>Western blot tamponlarında kullanılan Tween 20, yüksek arka plan floresansına yol açar ve blokaj ve son yıkama adımında atlanmalıdır</td></tr></tbody></table>

split-bioid — proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel protein kompleksleri

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Varolan benzeşme arıtma (AP) tamamlayacak protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlanması için yaklaşımlar, enzimler yakınlık bağımlı yaşayan hücrelerde proteinlerin etiketleme izin tanıttı. Bir tür enzim, BirA * (BioID yaklaşımda kullanılır), aracılık eder yaklaşık 10 tonluk bir içindeki proteinlerin biotinylation nm. Bu nedenle, faiz bir protein için erimiş ve hücrelerde ifade zaman, kendi doğal ortamlarında proksimal proteinler etiketlerine göre sağlar. Birleştirilmiş protein kompleksleri arıtma üzerinde dayanır AP aksine, BioID olursa olsun izole olduklarında olup olmadığı hala faiz protein ile etkileşim vardır hücrelerin içindeki işaretlenmiş proteinler algılar. Çünkü biotinylates proksimal proteinler, bir Ayrıca yararlanmak için çok verimli bir şekilde onları ayırmak biotin streptavidin olağanüstü benzeşme hakkında. BioID AP daha iyi tanımlayıcı geçici veya zayıf etkileşimler için yapar iken, her iki AP ve BioID kütle spektrometresi yaklaşım tüm olası etkileşim belirli bir protein olabilir genel bir bakış sağlar. Ancak, onlar her tanımlanan PPI içeriğine bilgi vermeyin. Gerçekten de, çoğu proteinler genellikle birkaç kompleksleri, farklı olgunlaşma adımları veya farklı işlevsel birimler için karşılık gelen bir parçasıdır. Her iki yöntem de bu ortak sınırlama adrese, BirA * enzim üzerinde dayalı bir protein parçaları uluslara tahlil mühendislik. Bu tahlil, iki etkin olmayan parçaları BirA * yakın hangi onlar erimiş iki etkileşen proteinler tarafından getirdiğinde etkin bir enzim içine yeniden monte. Elde edilen Böl-BioID tahlil böylece etkileşen proteinler bir çift bir araya proteinler etiketlerine göre sağlar. Bu iki yalnızca belirli bir bağlamda etkileşim sağlanan bölme-BioID onların yerel hücresel ortamlarında belirli içerik bağımlı işlevsel birimler analiz sonra sağlar. Burada, test etmek ve split-BioID etkileşen proteinler çiftine uygulanan adım adım bir protokol sağlar.

Nasıl bu yöntem inşaat Ago2, proteinlerin açık okuma çerçevesi (ORFs) göstermek için TNRC6C ve Dicer (tüm yolu susturmak miRNA-aracılı gen içinde karıştırmak) Böl-BioID plazmid klonlanmış. Ago2 çeviri represses bir miRNA-induced silencing kompleksi içinde (miRISC) TNRC6C ile etkileşim ve hedef mRNA'ların14çürüme teşvik olduğu bilinmektedir. MiRISC, Ago2 birleştirmek için baş rahip Dicer, içinde miRNA15ile dolu bir kompleksi içinde olgun miRNAs üreten enzim ile etkileşim. Bu nedenle Böl-BioID Ago2/Dicer çifti veya Ago2/TNRC6C çift uygulandı. İçin her çifti test edilmiş proteinlerin Ago2 ya NBirA * veya CBirA * bizim split-BioID plazmid (Şekil 2) kullanarak için erimiş ve Dicer ve TNRC6C için karşılık gelen soydaş BirA * parçası oldu. Buna ek olarak, her protein CBirA * erimiş ve bir NBirA * ile eşleştirilmiş-GFP füzyon olarak bir negatif kontrol. Bu test protein (Tablo 1) birbirine çiftinin dört yinelemenin test sonuçlar.
Böl-BioID test edilmiş proteinlerin çifti etkileşim aktif olup olmadığını sınamak için şekil 1' de tasvir düzeni takip ettik. Plazmid geçici bir tet-sistem uyumlu HeLa hücre kültürünü transfected. Ifade füzyon proteinlerin Doksisiklin (dox) ile indüklenen ve biotinylation aşırı biotin büyüme ortamına ekleyerek teşvik. 20 h kuluçka ile bir süre dox ve biotin, hücreleri lysed ve biotinylated proteinler algılamaya konjuge streptavidin kullanarak Western Blot tarafından analiz edilebilir. Memeli hücrelerinde iki büyük grup genellikle konjuge streptavidin untransfected örnek (şekil 3, yıldız) tarafından algılanır ve endogenously biotinylated proteinler (en büyük olasılıkla mitokondrial karboksilaz) karşılık gelir. Bu iki grup tüm örneklerinde bulunması ve uygun iç yükleme denetimi olarak kullanılabilir, bu nedenle eşit protein miktarları yüklenmesini denetlemek için bir temizlik protein tespiti yersiz olur. Tipik bir BioID/Böl-BioID deney, gözlenen ek büyük gruplar kendi biotinylated var füzyon proteinlerdir. Diğer bir biotinylated protein görüldüğünde bile biotinylation füzyon proteinlerin zaten bu aşamada tespit iki test protein hücrelerde etkileşim gösterir. Şekil 3üzerinde tasvir deneyde, bu bir NBirA * olan belli ki-CBirA * TNRC6C veya Dicer füzyon ile eşleştirilmiş Ago2 füzyon proteinidir hangi CBirA ters kombinasyonları daha verimli-Ago2 diğer iki NBirA * füzyon için eşleştirilmiş proteinler (şekil 3, üst paneli, Kulvar 6-7 için 2-3 hatlarının yoğunluklarda karşılaştırın). Ayrıca, belgili tanımlık harekete geçirmek CBirA * füzyon hiçbiri NBirA * etkinleştirmek gibi belirli-GFP denetim füzyon protein kayda değer düzeyde (şekil 3, Karşılaştır şeritli 1, 4-5 untransfected hücrelere karşılık gelen lane 8). Bizim plazmid içinde NBirA * myc etiket ve CBirA * bir bayrak etiket (Şekil 2) vardır beri her füzyon protein ifade seviyede bu iki etiket (şekil 3, alt paneli) karşı antikor ile analiz edilebilir.
Etkileşim kaynaklı biotinylation gözlenen deney ölçeklendirilebilir ve biotinylated proteinler streptavidin birleştiğinde boncuk Protokolü (şekil 4) 4 paragrafta belirtildiği şekilde izole. Yalıtım ilk kez gerçekleştirilirken, tüm belgili tanımlık merdiven arıtma Western Blot (şekil 5tarafından) analiz. Genellikle, boncuk bağlama-meli var olmak neredeyse nicel ve hemen hemen hiçbir sızıntı yoluyla yıkar dikkat edilmelidir. Önce işleme örnekleri için kütle spektrometresi, indüklenen biotinylation beklendiği gibi çalıştı ve füzyon protein ifade edildi emin olmak için bir Western blot çalışan öneririz. Ya zavallı transfection verimlilik veya hatalı dox indüksiyon nedeniyle ifade füzyon proteinlerin eksikliğidir. Füzyon protein ifade edildi ancak hiçbir biotinylation gözlenen, aşırı biotin (50 mikron) aslında Orta olarak eklendi ve hisse senedi biotin hala etkin olduğunu denetleyin. Eluted malzeme üzerinde bir protein Coomassie lekeli jel (şekil 6), tipik olarak analiz edilir zaman, uyması gereken en güçlü grup yaklaşık 17 kDa çalışır ve monomeric streptavidin karşılık gelir. Endojen biotinylated proteinler ve füzyon protein karşılık gelen bantları da gözlenen. Biz genellikle streptavidin grup yükleme iyi (şekil 6) kadar yukarıda örnek lane alan tüketim. Eksize grubun bir 1,5 mL tüp içinde saklanır ve bir kütle spektrometresi tesisine gönderilir. Alternatif olarak, ilişkili proteinler de streptavidin birleştiğinde boncuk tripsin sindirmek olabilir ve eluted sindirilmiş peptidler sütun oluşturur. Biz düzenli olarak kullanın (çoğunlukla varsayılan parametrelerini kullanarak başvuru 9 tipik MS sonuçları ve daha fazla bilgi için bkz: lizin biotinylation mümkün translasyonel modifikasyon ekleme,) MaxQuant yazılım ve16 MS ham veri analiz etmek ve Perseus suite17 sonraki istatistiksel analiz için her ikisi de özgür yazılım olan. Örnekler genellikle üç biyolojik çoğaltır çalıştırılır. Etiket içermeyen miktar kullanarak, özel olarak zenginleştirilmiş proteinler denetim koşulları üzerinde tespit edilebilir. Endogenously biotinylated proteinleri ve özellikle sigara BirA * enzim tarafından etiketlenir proteinler için filtre uygulamak için yalnızca önemli ölçüde üzerinde sayısı altı ilgisiz proteinler ile oluşturulan altı veri kümesinden gelen zenginleştirilmiş proteinler düşünün. Buna ek olarak, biz sadece üzerinde bir split-BioID veri kümesi içinde NBirA * füzyon protein yerini almış NBirA * tarafından zenginleştirilmiş sayısı düşünün-GFP. Diğer veri analizi stratejileri özellikle hücre kültürü (SILAC) kantitatif proteomik18amino asitleri ile kararlı izotop etiketleme kullanarak önerilmiştir. Ayrıca, çeşitli stratejileri biotinylated peptidler organik çözücüler19 veya biotin özgü kullanarak özel elüsyon koşullar biotin18, zayıflamış benzeşimli bir streptavidin değişken kullanarak doğrudan yalıtımı için tarif var antikorlar20,21. Mutlaka daha fazla protein keşfi için önde gelen, biotinylation siteleri tanımlaması Ekle sayısı belirgin olarak daha fazla güven ve yararlı ne zaman bir etkileşim topolojisinin ele alıyor.
<img alt="Proteomik analiz iş akışı: Split-BioID, klonlama, transfeksiyon, biyotinilasyon, MS, Western lekesi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: split-BioID yordam bakış. Protein 1 protein 2 karmaşık bir parçası olarak ya da protein 3 karmaşık B. parçası olarak etkileşim kurar Özellikle karmaşık a kompozisyon soruşturma için protein 1 ve 2 Böl-BioID uygulanabilir. Kütle Spektrometre fotoğrafı bir Creative Commons Attribution-Share Alike 3,0 dağıtıma açıktır lisansı altında ve https://commons.wikimedia.org ThermoScientificOrbitrapElite.JPG dosya adı ile indirilen. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="BamHI, MluI, ClaI kısıtlama bölgeleri ile gen düzenleme plazmid haritaları; Klonlama kurulumları için diyagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: split-BioID plazmid ifade kasetleri. Biz NBirA * ve CBirA * füzyon protein tüm kombinasyonları test izin vermek için dört plazmid sağlar. Plazmid ve tam haritalar addgene.org belirtilen numaraları altında bulabilirsiniz. Plazmid tet-yanıt veren öğe (7 x tetO) ve tet ifade sistemi ile uyumlu bir hücre satır kullanılmak üzere gerekir. Ayrıca tüm plazmid FRB ve FKBP ORFs NBirA * erimiş ve parçaları CBirA * sırasıyla dikkat edin. Sadece rapamycin varlığında bu iki protein etkileşim ve bu nedenle plazmid sistemi bu kimyasal9içinde hızlı bir şekilde test için kullanılabilir. Belirtilen kısıtlama benzersiz sitelerdir. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Protein elektroforezi sonuçları; Dicer, TNRC6C, Ago2'nin antikorlarla western blot analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Resim 3: bir split-BioID deneme için tipik Western blot. Üst paneli: biotinylated proteinler fluorescently etiketli streptavidin ile tespiti. Alt paneli: Anti-Myc ve anti-bayrak antikorları ile füzyon proteinlerin algılama. İki çift proteinlerin test edildi: Ago2/TNRC6C ve Ago2/Dicer. Yolları 2 &amp; 3, Ago2 CBirA * parçası için eklenen. Yolları 6 &amp; 7, Ago2 NBirA * parçası için eklenen. Önemli sinyal yok ne zaman herhangi üç proteinlerin NBirA * ile kombine edilmiştir gözlendi-GFP (şerit 1, 4-5). Yıldızlar endogenously iç yükleme denetimi olarak hizmet verebilir biotinylated proteinler karşılık gelen grupları gösterir. Bu rakam Schopp vd. şekil 5B adapte 9 bir Creative Commons Attribution 4.0 uluslararası lisansı altında. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Manyetik boncuklar kullanarak hücre saflaştırma iş akışı; SDS-PAGE sonuçları; protein analiz yöntemi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Şekil 4: streptavidin açılan yordama genel bakış. Kütle spektrometresi analiz için biotinylated proteinlerin yalıtım için önemli adımlar tasvir edilmektedir. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="SDS-PAGE protein saflaştırma sonucu, konjuge-streptavidin etkileşimi, elektroforez jeli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Şekil 5: tipik Western blot streptavidin açılan deneme için. Eşit hacimli belirtilen her örnek üzerinde bir SDS-polyacrylamide jel dolu. Western Blot takiben biotinylated proteinler HRP birleştiğinde streptavidin ile tespit edildi. NBirA * karşılık gelen bantları-TNRC6C ve CBirA *-Ago2 belirtilir. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="SDS-PAGE jel, protein bandı ayrımı, Split-BioID, streptavidin, moleküler ağırlık belirteçleri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Şekil 6: kütle spektrometresi analiz için tipik Coomassie lekeli protein jel. Streptavidin birleştiğinde boncuk eluted örnekten prekast protein jel üzerinde yüklü ve örnek göç kadar 2-3 cm çalıştırın. 17 kDa görülen büyük grubudur streptavidin. Hemen üstüne o grup alanı eksize ve kütle spektrometresi tesisine gönderdi. NBirA * karşılık gelen bantları-TNRC6C ve CBirA *-Ago2 belirtilir. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transfection örnek</td>
			<td colspan="3">Test durumu</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">yok transfection</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Split-BioID için iki protein uygularken koşullar genellikle test edilmiştir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sıralama astar</td>
			<td>sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaset 1 ters astar (CBirA füzyon)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaset 2 ters astar (NBirA füzyon)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: astar için split-BioID plazmid sıralanıyor.

Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücreler içinde yakınlığa bağlı protein biyotinilasyonunu indükleyen bir protein fragmanı tamamlama testi olan split-BioID kullanarak ilgilenilen bir çift etkileşimli protein etrafında spesifik olarak bir araya gelen protein komplekslerinin bileşimini araştırmaktır. Bu yöntem, protein komplekslerinin farklı hücresel işlevleri düzenlemek için dinamik olarak nasıl yeniden şekillendiği gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bağlama özgü protein komplekslerinin doğal hücresel ortamlarında ve çok yüksek çözünürlükle kolayca tanımlanmasına izin vermesidir.Nihai kütle spektrometrik analizi için, aşağıdaki adımlar keratin içermeyen koşullarda gerçekleştirilmelidir ve tüm malzeme ve reaktifler mümkün olduğunca keratin içermemelidir. İlgilenilen iki proteinin ORF'lerini bölünmüş BioID plazmidine klonladıktan sonra, geçici transfeksiyon gerçekleştirdikten ve ardından metin protokolüne göre biyotin takviyeli ortam ekledikten sonra, hücreleri iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Her plakaya 1.5 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri toplamak için bir kazıyıcı kullanın, daha sonra her koşul için hücreleri ayrı bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpleri 1, 200 kez yerçekimi ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün.Süpernatanları çıkarın ve peletleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Daha sonra tüpleri daha fazla işleme kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücre lizatlarını hazırlamak için, peletleri yeniden süspanse etmek için bir mililitre RT lizis tamponu kullanın.Daha sonra hücreleri 25 gauge iğneden 10 ila 20 kez geçirin. Sonra örnekleri sonikleştirin. Daha sonra% 2'lik bir final konsantrasyonu için 900 mikrolitre geri kazanılmış sonikasyonlu lizat başına 100 mikrolitre% 20 Triton X-100 ekleyin, NaCl konsantrasyonunu ayarlamak için mililitre lizat başına 2.3 mililitre 50 milimolar Tris, pH 7.4 ekleyin.Daha sonra ayarlanmış lizatları 1.5 mililitrelik tüplere dağıtın ve on dakika boyunca 16.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanları 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve giriş malzemesi olarak 50 ila 100 mikrolitre tutun. Bir streptavidin çekme işlemi gerçekleştirmek için, her koşul için 200 mikrolitre streptavidin bağlantılı manyetik boncuk süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve depolama tamponunu çıkarmadan önce yaklaşık bir dakika bekleyin. Bir mililitre dengeleme tamponu ile boncukları hafifçe karıştırarak yıkayın. Ardından, dengelenmiş boncukları gerekli sayıda tüpte eşit şekilde dağıtın ve manyetik rafa geri yerleştirin.Dengeleme tamponunu çıkardıktan sonra, her bir boncuk setini eşit miktarda karşılık gelen hücre lizatları ile yeniden süspanse edin. Daha sonra numuneleri gece boyunca dönen bir tekerlek üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin.Boncuklar tüplerin kenarına yapışana kadar bekleyin ve süpernatanları akış olarak etiketlenmiş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. 200 mikrolitre yıkama tamponu bir ile, her tüpteki boncukları yeniden süspanse edin ve 1,5 mililitrelik tüplerde bir duruma karşılık gelen her bir yeniden askıya alınmış boncuk setini birleştirin. Boncukları sekiz dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde iki kez yıkamak için bir mililitre yıkama tamponu kullanın.Daha sonra iki, üç ve dört yıkama tamponları için ikişer yıkama yapın. Son yıkama adımından sonra yıkama tamponunun tamamen ortadan kaldırıldığından emin olmak için, süpernatantın çoğunu çıkardıktan sonra numuneleri aşağı doğru döndürün. Ardından bunları manyetik rafa geri koyun ve kalan tamponu çıkarın.Boncuklara 30 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin, ardından numuneleri 98 santigrat derecede on beş dakika inkübe edin ve tüpleri hemen manyetik rafa taşıyın. Ayrıştırılan numuneyi yeni bir tüpe aktarın ve tüpleri daha sonraki işlemlere kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Her giriş numunesi için, eşit miktarda proteini toplam 28 mikrolitrelik bir hacimde uygun hacimde 3X SDS yükleme tamponu ile karıştırarak bir PAGE numunesi hazırlayın.Ardından, her bir elüsyon örneğinden beş mikrolitreyi 2,5 mikrolitre 3X SDS yükleme tamponu ile karıştırarak PAGE örneklerini hazırlayın. Numuneleri bir SDS poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Daha sonra metin protokolüne göre elektroforez ve western blotting'e devam edin.MS analizi için SDS-PAGE'i gerçekleştirmek için, her bir elüsyon numunesinin 18,75 mikrolitresine 6,25 mikrolitre 4X numune tamponu ekleyin ve numuneleri, jelin içine iki ila üç santimetre geçene kadar dört ila %20'lik bir önceden dökülmüş SDS jeli üzerinde çalıştırın. 15 santimetrelik bir petri kabında, jeli kolloidal Coomassie Brilliant Blue G250 boyası ile boyayın. Streptavidin bandı hariç her numune için tüm şeritleri eksize etmek için temiz bir neşter kullanın ve eksize edilen bantları MS analizi için 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.Bir BioID, split-BioID deneyinde tanımlanan endojen biyotinillenmiş proteinlere ek olarak, western blot tarafından gözlemlenen ek ana bantlar, kendi kendine biyotinile olan füzyon proteinleridir, bu da test edilen iki proteinin, bu örnekte Ago2 ve TNRC6C veya Ago2 ve Dicer'in hücrelerde etkileşime girdiğini gösterir. Ek olarak, western blot'un sonuçları, TNRC6C veya Dicer'e CBirA*füzyonları ile eşleştirilmiş bir NBirA*Ago2 füzyon proteinine sahip olmanın, CBirA*Ago2'nin diğer iki proteinin NBirA*füzyonları ile eşleştirildiği zıt kombinasyonlardan daha verimli olduğunu göstermektedir. Ayrıca, aktivasyon spesifikti, çünkü CBirA * füzyonlarının hiçbiri NBirA * GFP kontrol füzyon proteinini kayda değer seviyelere aktive edemedi.İzolasyonu ilk kez gerçekleştirirken, saflaştırmanın tüm adımları western blotlama ile analiz edilmelidir. Burada gösterildiği gibi, boncuklara bağlanma neredeyse kantitatif olmalı ve yıkamalarda neredeyse hiç sızıntı gözlenmemelidir. Ayrıştırılan materyal, protein ekspresyonu ve indüklenmiş biyotinilasyondan sonra Coomassie lekeli bir jel üzerinde çalıştırıldığında, gözlemlenen en güçlü bant yaklaşık 17 kilodaltonda çalışır ve monomerik streptavidine karşılık gelir.Yükleme kuyusuna kadar streptavidin bandının üzerindeki numune şeridinin alanı tipik olarak MS analizi için eksize edilir. Bu prosedürü verilen iki proteine uygularken, füzyon proteinlerinin farklı kombinasyonlarını test etmek önemlidir. Gerçekten de, genel biyotinilasyon verimliliğinin, N veya C terminali BirA fragmanlarına hangi proteinin eklendiğine yakından bağlı olabileceğini sık sık gözlemledik.En az bir negatif kontrol bölme-BioID deneyi eklemek de aynı derecede önemlidir. Örneğin, ilgilenilen protein çifti ile ilgili olmayan bir çift etkileşimli protein üzerinde. Bu prosedürü ve kütle spektrometresini takiben, tanımlanan peptitleri negatif kontrol deneylerine karşı puanlamak için hesaplamalı analiz uygulanmalıdır.Örneğin, Almanya'nın Münih kentindeki Cox ve Mann laboratuvarları tarafından geliştirilen MaxQuant ve Perseus yazılımlarını kullanıyoruz.

split-bioid-proteomic-analysis-context-specific-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin, split-BioID ile yerel hücresel ortamlarda bağlam bağımlı protein komplekslerini yüksek çözünürlüklü analiz etme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerde dinamik protein etkileşimlerini keşfetmeye yardımcı olur.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Daha fazla video keşfet