Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri
April 20th, 2018
Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.
Bu prosedürün genel amacı, canlı hücreler içinde yakınlığa bağlı protein biyotinilasyonunu indükleyen bir protein fragmanı tamamlama testi olan split-BioID kullanarak ilgilenilen bir çift etkileşimli protein etrafında spesifik olarak bir araya gelen protein komplekslerinin bileşimini araştırmaktır. Bu yöntem, protein komplekslerinin farklı hücresel işlevleri düzenlemek için dinamik olarak nasıl yeniden şekillendiği gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bağlama özgü protein komplekslerinin doğal hücresel ortamlarında ve çok yüksek çözünürlükle kolayca tanımlanmasına izin vermesidir.
Nihai kütle spektrometrik analizi için, aşağıdaki adımlar keratin içermeyen koşullarda gerçekleştirilmelidir ve tüm malzeme ve reaktifler mümkün olduğunca keratin içermemelidir. İlgilenilen iki proteinin ORF'lerini bölünmüş BioID plazmidine klonladıktan sonra, geçici transfeksiyon gerçekleştirdikten ve ardından metin protokolüne göre biyotin takviyeli ortam ekledikten sonra, hücreleri iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Her plakaya 1.5 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri toplamak için bir kazıyıcı kullanın, daha sonra her koşul için hücreleri ayrı bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpleri 1, 200 kez yerçekimi ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün.
Süpernatanları çıkarın ve peletleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Daha sonra tüpleri daha fazla işleme kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücre lizatlarını hazırlamak için, peletleri yeniden süspanse etmek için bir mililitre RT lizis tamponu kullanın.
Daha sonra hücreleri 25 gauge iğneden 10 ila 20 kez geçirin. Sonra örnekleri sonikleştirin. Daha sonra% 2'lik bir final konsantrasyonu için 900 mikrolitre geri kazanılmış sonikasyonlu lizat başına 100 mikrolitre% 20 Triton X-100 ekleyin, NaCl konsantrasyonunu ayarlamak için mililitre lizat başına 2.3 mililitre 50 milimolar Tris, pH 7.4 ekleyin
.Daha sonra ayarlanmış lizatları 1.5 mililitrelik tüplere dağıtın ve on dakika boyunca 16.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanları 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve giriş malzemesi olarak 50 ila 100 mikrolitre tutun. Bir streptavidin çekme işlemi gerçekleştirmek için, her koşul için 200 mikrolitre streptavidin bağlantılı manyetik boncuk süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve depolama tamponunu çıkarmadan önce yaklaşık bir dakika bekleyin. Bir mililitre dengeleme tamponu ile boncukları hafifçe karıştırarak yıkayın. Ardından, dengelenmiş boncukları gerekli sayıda tüpte eşit şekilde dağıtın ve manyetik rafa geri yerleştirin.
Dengeleme tamponunu çıkardıktan sonra, her bir boncuk setini eşit miktarda karşılık gelen hücre lizatları ile yeniden süspanse edin. Daha sonra numuneleri gece boyunca dönen bir tekerlek üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin.
Boncuklar tüplerin kenarına yapışana kadar bekleyin ve süpernatanları akış olarak etiketlenmiş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. 200 mikrolitre yıkama tamponu bir ile, her tüpteki boncukları yeniden süspanse edin ve 1,5 mililitrelik tüplerde bir duruma karşılık gelen her bir yeniden askıya alınmış boncuk setini birleştirin. Boncukları sekiz dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde iki kez yıkamak için bir mililitre yıkama tamponu kullanın.
Daha sonra iki, üç ve dört yıkama tamponları için ikişer yıkama yapın. Son yıkama adımından sonra yıkama tamponunun tamamen ortadan kaldırıldığından emin olmak için, süpernatantın çoğunu çıkardıktan sonra numuneleri aşağı doğru döndürün. Ardından bunları manyetik rafa geri koyun ve kalan tamponu çıkarın.
Boncuklara 30 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin, ardından numuneleri 98 santigrat derecede on beş dakika inkübe edin ve tüpleri hemen manyetik rafa taşıyın. Ayrıştırılan numuneyi yeni bir tüpe aktarın ve tüpleri daha sonraki işlemlere kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Her giriş numunesi için, eşit miktarda proteini toplam 28 mikrolitrelik bir hacimde uygun hacimde 3X SDS yükleme tamponu ile karıştırarak bir PAGE numunesi hazırlayın.
Ardından, her bir elüsyon örneğinden beş mikrolitreyi 2,5 mikrolitre 3X SDS yükleme tamponu ile karıştırarak PAGE örneklerini hazırlayın. Numuneleri bir SDS poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Daha sonra metin protokolüne göre elektroforez ve western blotting'e devam edin.
MS analizi için SDS-PAGE'i gerçekleştirmek için, her bir elüsyon numunesinin 18,75 mikrolitresine 6,25 mikrolitre 4X numune tamponu ekleyin ve numuneleri, jelin içine iki ila üç santimetre geçene kadar dört ila %20'lik bir önceden dökülmüş SDS jeli üzerinde çalıştırın. 15 santimetrelik bir petri kabında, jeli kolloidal Coomassie Brilliant Blue G250 boyası ile boyayın. Streptavidin bandı hariç her numune için tüm şeritleri eksize etmek için temiz bir neşter kullanın ve eksize edilen bantları MS analizi için 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.
Bir BioID, split-BioID deneyinde tanımlanan endojen biyotinillenmiş proteinlere ek olarak, western blot tarafından gözlemlenen ek ana bantlar, kendi kendine biyotinile olan füzyon proteinleridir, bu da test edilen iki proteinin, bu örnekte Ago2 ve TNRC6C veya Ago2 ve Dicer'in hücrelerde etkileşime girdiğini gösterir. Ek olarak, western blot'un sonuçları, TNRC6C veya Dicer'e CBirA*füzyonları ile eşleştirilmiş bir NBirA*Ago2 füzyon proteinine sahip olmanın, CBirA*Ago2'nin diğer iki proteinin NBirA*füzyonları ile eşleştirildiği zıt kombinasyonlardan daha verimli olduğunu göstermektedir. Ayrıca, aktivasyon spesifikti, çünkü CBirA * füzyonlarının hiçbiri NBirA * GFP kontrol füzyon proteinini kayda değer seviyelere aktive edemedi.
İzolasyonu ilk kez gerçekleştirirken, saflaştırmanın tüm adımları western blotlama ile analiz edilmelidir. Burada gösterildiği gibi, boncuklara bağlanma neredeyse kantitatif olmalı ve yıkamalarda neredeyse hiç sızıntı gözlenmemelidir. Ayrıştırılan materyal, protein ekspresyonu ve indüklenmiş biyotinilasyondan sonra Coomassie lekeli bir jel üzerinde çalıştırıldığında, gözlemlenen en güçlü bant yaklaşık 17 kilodaltonda çalışır ve monomerik streptavidine karşılık gelir.
Yükleme kuyusuna kadar streptavidin bandının üzerindeki numune şeridinin alanı tipik olarak MS analizi için eksize edilir. Bu prosedürü verilen iki proteine uygularken, füzyon proteinlerinin farklı kombinasyonlarını test etmek önemlidir. Gerçekten de, genel biyotinilasyon verimliliğinin, N veya C terminali BirA fragmanlarına hangi proteinin eklendiğine yakından bağlı olabileceğini sık sık gözlemledik.
En az bir negatif kontrol bölme-BioID deneyi eklemek de aynı derecede önemlidir. Örneğin, ilgilenilen protein çifti ile ilgili olmayan bir çift etkileşimli protein üzerinde. Bu prosedürü ve kütle spektrometresini takiben, tanımlanan peptitleri negatif kontrol deneylerine karşı puanlamak için hesaplamalı analiz uygulanmalıdır.
Örneğin, Almanya'nın Münih kentindeki Cox ve Mann laboratuvarları tarafından geliştirilen MaxQuant ve Perseus yazılımlarını kullanıyoruz.
Genel Bakış
Bu makale, protein komplekslerini analiz etmek için yakınlık etiketlemeyi kullanan bir protein fragmanı tamamlama tahlili olan split-BioID için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu, protein etkileşimlerinin hücresel ortamlarında bağlamsal olarak incelenmesini sağlayarak hücresel fonksiyonlar hakkında yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Proteomiks
- Biyokimya
Arka Plan
- Protein etkileşimlerini anlamak, hücresel mekanizmaları açıklamak için kritik öneme sahiptir.
- BioID gibi yakınlık etiketleme teknikleri, canlı hücrelerde protein komplekslerinin tanımlanmasına olanak tanır.
- Split-BioID bu analizlerin özgüllüğünü ve çözünürlüğünü artırır.
- Bu yöntem maliyet etkilidir ve standart laboratuvar ekipmanları gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- Split-BioID kullanımı için adım adım bir protokol sağlamak.
- Bağlamsal olarak spesifik protein komplekslerinin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
- Araştırmacıların canlı hücrelerde dinamik protein etkileşimlerini araştırmasını sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Proteinlerin split-BioID plazmitlerine klonlanması.
- Geçici transfeksiyon ve biyotin takviyesi.
- Hücre lizisi ve pulldown tahlilleri için lizatların hazırlanması.
- SDS-PAGE ve western blotting sonrası kitle spektrometrik analizi.
Ana Sonuçlar
- Biyotinle yoluyla protein etkileşimlerinin başarılı tanımlanması.
- Farklı füzyon protein kombinasyonlarının verimliliğinin gösterilmesi.
- Western blotting ve kitle spektrometrisi ile yöntemin doğrulanması.
- Protein kompleksi oluşumunu gösteren spesifik etkileşimlerin gözlemlenmesi.
Sonuçlar
- Split-BioID, in vivo protein etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Yöntem, protein komplekslerinin yüksek çözünürlüklü analizini sağlar.
- Hücresel fonksiyonlar ve dinamikleri hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Split-BioID enables the identification of context-specific protein complexes in their native cellular environment, addressing a key limitation of traditional affinity purification and proximity-labeling methods. By requiring the reassembly of BirA* fragments only when two proteins of interest interact, the assay provides mechanistic de-risking for target validation by distinguishing functional units from transient or nonspecific associations. This supports predictive confidence in early discovery by clarifying which protein interactions are functionally relevant in specific biological contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating protein complexes that form specifically around a defined protein-protein interaction.
- Operational Value: Enables functional target validation through context-dependent labeling, reducing false positives from constitutive interactors.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying which protein interactions are active in disease-relevant cellular states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates biotinylated proximal proteins that can be efficiently captured via streptavidin pulldown, enabling standardized downstream proteomic analysis.
- Quantitative Output: Produces mass spectrometry-ready samples that allow comparative quantification of context-specific interactors across experimental conditions.
- Reproducibility: Includes built-in controls (e.g., negative fusion pairs) to assess specificity and ensure assay reliability before screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Allows analysis of protein complexes in native cellular environments, increasing translational fidelity of discovered interactions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether a target engages specific functional units in pathophysiological contexts, informing biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement by validating target engagement in complex-forming states rather than binary interactions.
Pipeline & Workflow Integration
Split-BioID fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly when context-dependent complex formation is a key mechanistic question.
- Discovery Biology: Tests whether a protein interaction nucleates a specific functional complex, supporting pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Prepares lysates for streptavidin-based enrichment, enabling reproducible isolation of proximal proteins for proteomic profiling.
- Analytics: Generates elution samples suitable for mass spectrometry, providing quantitative readouts to compare interactor composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase interaction data to preclinical validation by confirming complex assembly in native cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular plug-in assay where different protein pairs can be tested using the same core workflow, increasing platform leverage.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing stable, context-specific complexes from transient or artefactual associations.
- Operational Value: Leverages streptavidin-biotin affinity for efficient, specific capture, minimizing background and improving reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating target engagement in biologically relevant states, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on evidence of context-dependent complex formation in native environments.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise to generate split-BioID fusion constructs with appropriate N- and C-terminal BirA* fragments.
- Dependent on access to mass spectrometry and western blotting infrastructure for post-pulldown analysis.
- Necessitates optimization of fusion protein orientation, as biotinylation efficiency varies depending on which protein is fused to which BirA* fragment.
- Includes strong recommendation to run negative control experiments (e.g., non-interacting protein pairs) to filter background signals.
- Performance is influenced by expression levels and subcellular localization; thus, empirical testing of multiple construct combinations is advised.
