Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücreler içinde yakınlığa bağlı protein biyotinilasyonunu indükleyen bir protein fragmanı tamamlama testi olan split-BioID kullanarak ilgilenilen bir çift etkileşimli protein etrafında spesifik olarak bir araya gelen protein komplekslerinin bileşimini araştırmaktır. Bu yöntem, protein komplekslerinin farklı hücresel işlevleri düzenlemek için dinamik olarak nasıl yeniden şekillendiği gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bağlama özgü protein komplekslerinin doğal hücresel ortamlarında ve çok yüksek çözünürlükle kolayca tanımlanmasına izin vermesidir.

Nihai kütle spektrometrik analizi için, aşağıdaki adımlar keratin içermeyen koşullarda gerçekleştirilmelidir ve tüm malzeme ve reaktifler mümkün olduğunca keratin içermemelidir. İlgilenilen iki proteinin ORF'lerini bölünmüş BioID plazmidine klonladıktan sonra, geçici transfeksiyon gerçekleştirdikten ve ardından metin protokolüne göre biyotin takviyeli ortam ekledikten sonra, hücreleri iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Her plakaya 1.5 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri toplamak için bir kazıyıcı kullanın, daha sonra her koşul için hücreleri ayrı bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpleri 1, 200 kez yerçekimi ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün.

Süpernatanları çıkarın ve peletleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Daha sonra tüpleri daha fazla işleme kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücre lizatlarını hazırlamak için, peletleri yeniden süspanse etmek için bir mililitre RT lizis tamponu kullanın.

Daha sonra hücreleri 25 gauge iğneden 10 ila 20 kez geçirin. Sonra örnekleri sonikleştirin. Daha sonra% 2'lik bir final konsantrasyonu için 900 mikrolitre geri kazanılmış sonikasyonlu lizat başına 100 mikrolitre% 20 Triton X-100 ekleyin, NaCl konsantrasyonunu ayarlamak için mililitre lizat başına 2.3 mililitre 50 milimolar Tris, pH 7.4 ekleyin

Daha sonra ayarlanmış lizatları 1.5 mililitrelik tüplere dağıtın ve on dakika boyunca 16.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanları 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve giriş malzemesi olarak 50 ila 100 mikrolitre tutun. Bir streptavidin çekme işlemi gerçekleştirmek için, her koşul için 200 mikrolitre streptavidin bağlantılı manyetik boncuk süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve depolama tamponunu çıkarmadan önce yaklaşık bir dakika bekleyin. Bir mililitre dengeleme tamponu ile boncukları hafifçe karıştırarak yıkayın. Ardından, dengelenmiş boncukları gerekli sayıda tüpte eşit şekilde dağıtın ve manyetik rafa geri yerleştirin.

Dengeleme tamponunu çıkardıktan sonra, her bir boncuk setini eşit miktarda karşılık gelen hücre lizatları ile yeniden süspanse edin. Daha sonra numuneleri gece boyunca dönen bir tekerlek üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin.

Boncuklar tüplerin kenarına yapışana kadar bekleyin ve süpernatanları akış olarak etiketlenmiş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. 200 mikrolitre yıkama tamponu bir ile, her tüpteki boncukları yeniden süspanse edin ve 1,5 mililitrelik tüplerde bir duruma karşılık gelen her bir yeniden askıya alınmış boncuk setini birleştirin. Boncukları sekiz dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde iki kez yıkamak için bir mililitre yıkama tamponu kullanın.

Daha sonra iki, üç ve dört yıkama tamponları için ikişer yıkama yapın. Son yıkama adımından sonra yıkama tamponunun tamamen ortadan kaldırıldığından emin olmak için, süpernatantın çoğunu çıkardıktan sonra numuneleri aşağı doğru döndürün. Ardından bunları manyetik rafa geri koyun ve kalan tamponu çıkarın.

Boncuklara 30 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin, ardından numuneleri 98 santigrat derecede on beş dakika inkübe edin ve tüpleri hemen manyetik rafa taşıyın. Ayrıştırılan numuneyi yeni bir tüpe aktarın ve tüpleri daha sonraki işlemlere kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Her giriş numunesi için, eşit miktarda proteini toplam 28 mikrolitrelik bir hacimde uygun hacimde 3X SDS yükleme tamponu ile karıştırarak bir PAGE numunesi hazırlayın.

Ardından, her bir elüsyon örneğinden beş mikrolitreyi 2,5 mikrolitre 3X SDS yükleme tamponu ile karıştırarak PAGE örneklerini hazırlayın. Numuneleri bir SDS poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Daha sonra metin protokolüne göre elektroforez ve western blotting'e devam edin.

MS analizi için SDS-PAGE'i gerçekleştirmek için, her bir elüsyon numunesinin 18,75 mikrolitresine 6,25 mikrolitre 4X numune tamponu ekleyin ve numuneleri, jelin içine iki ila üç santimetre geçene kadar dört ila %20'lik bir önceden dökülmüş SDS jeli üzerinde çalıştırın. 15 santimetrelik bir petri kabında, jeli kolloidal Coomassie Brilliant Blue G250 boyası ile boyayın. Streptavidin bandı hariç her numune için tüm şeritleri eksize etmek için temiz bir neşter kullanın ve eksize edilen bantları MS analizi için 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.

Bir BioID, split-BioID deneyinde tanımlanan endojen biyotinillenmiş proteinlere ek olarak, western blot tarafından gözlemlenen ek ana bantlar, kendi kendine biyotinile olan füzyon proteinleridir, bu da test edilen iki proteinin, bu örnekte Ago2 ve TNRC6C veya Ago2 ve Dicer'in hücrelerde etkileşime girdiğini gösterir. Ek olarak, western blot'un sonuçları, TNRC6C veya Dicer'e CBirA*füzyonları ile eşleştirilmiş bir NBirA*Ago2 füzyon proteinine sahip olmanın, CBirA*Ago2'nin diğer iki proteinin NBirA*füzyonları ile eşleştirildiği zıt kombinasyonlardan daha verimli olduğunu göstermektedir. Ayrıca, aktivasyon spesifikti, çünkü CBirA * füzyonlarının hiçbiri NBirA * GFP kontrol füzyon proteinini kayda değer seviyelere aktive edemedi.

İzolasyonu ilk kez gerçekleştirirken, saflaştırmanın tüm adımları western blotlama ile analiz edilmelidir. Burada gösterildiği gibi, boncuklara bağlanma neredeyse kantitatif olmalı ve yıkamalarda neredeyse hiç sızıntı gözlenmemelidir. Ayrıştırılan materyal, protein ekspresyonu ve indüklenmiş biyotinilasyondan sonra Coomassie lekeli bir jel üzerinde çalıştırıldığında, gözlemlenen en güçlü bant yaklaşık 17 kilodaltonda çalışır ve monomerik streptavidine karşılık gelir.

Yükleme kuyusuna kadar streptavidin bandının üzerindeki numune şeridinin alanı tipik olarak MS analizi için eksize edilir. Bu prosedürü verilen iki proteine uygularken, füzyon proteinlerinin farklı kombinasyonlarını test etmek önemlidir. Gerçekten de, genel biyotinilasyon verimliliğinin, N veya C terminali BirA fragmanlarına hangi proteinin eklendiğine yakından bağlı olabileceğini sık sık gözlemledik.

En az bir negatif kontrol bölme-BioID deneyi eklemek de aynı derecede önemlidir. Örneğin, ilgilenilen protein çifti ile ilgili olmayan bir çift etkileşimli protein üzerinde. Bu prosedürü ve kütle spektrometresini takiben, tanımlanan peptitleri negatif kontrol deneylerine karşı puanlamak için hesaplamalı analiz uygulanmalıdır.

Örneğin, Almanya'nın Münih kentindeki Cox ve Mann laboratuvarları tarafından geliştirilen MaxQuant ve Perseus yazılımlarını kullanıyoruz.