Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak
August 6th, 2018
Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.
Bu prosedürün genel amacı, biyokatman interferometrisi kullanarak farklı pH ortamlarında protein komplekslerinin dinamik montajını gözlemlemek ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi kullanarak bileşenleri doğrulamaktır. Protein kompleksi oluşumunu ve montajını yöneten özgüllüğün tanımlanması ve anlaşılması, biyokimyasal araştırmacılar için son derece ilgi çekicidir. Bugün bahsettiğimiz metodoloji, araştırmacıların tahmin edilen makromoleküler kompleksleri bir araya getirmesine, görselleştirmesine ve doğrulamasına olanak tanır.
Biyosensör yüzeyinin karmaşık doğası, araştırmacıların elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi analizi için birleştirilmiş kompleksleri küçük mikro hacimlere kolayca serbest bırakmasına izin verir. Bu gösteride, şarbon toksin kompleksinin pH kaynaklı yapısal yeniden düzenlemelerinin kinetiğini takip ettik ve bu yeniden düzenlemeleri elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi yöntemleriyle doğruladık, tüm bunları yaparken topaklanmadan kaçındık. BLI biyosensör yüzeyindeki şarbon toksin düzeneğini, makro numune salımını ve EM-negatif boyama prosedürlerini göstermek, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri Alexandra Machen ve Pierce O'Neil olacak.
Dr.Antonio Artigues, Orbitrap Fusion Lumos kütle spektrometresini kullanarak BLI tarafından salınan mikro örneklerin analiz edilmesinde ve tanımlanmasında etkilidir. Başlamak için, bir amin reaktif ikinci nesil BLI biyosensör ucunu 250 mikrolitre suya batırarak nemlendirin ve 10 dakika inkübe edin. Blitz yazılımında, adım sürelerini bu tabloda listelendiği gibi programlayın.
Biyosensör kalınlığı ve yoğunluğunun ilk taban çizgisini ölçmek için biyosensör ucunu 30 saniye boyunca 250 mikrolitre suya batırarak BLI çalışmasını başlatın. Daha sonra, ucu yedi dakika boyunca 250 mililitre 50 milimolar NHS ve 200 milimolar EDC'ye daldırarak biyosensörü etkinleştirin. Daha sonra, aktive edilmiş bir biyoreaktif yüzey oluşturmak için aktive edilmiş biyosensörü, 0.1 molar borat tamponu, pH 8.5 içinde çözülmüş 50 milimolar PDEA'ya beş dakika daldırın.
Şimdi, aktive edilmiş biyoreaktif biyosensörü, 10 milimolar sodyum asetat pH beş, 100 milimolar sodyum klorür tamponunda 100 nanomolar E126C LFn içeren bir çözeltinin 250 mikrolitresine beş dakika daldırın. Kalan serbest tiyol-reaktif grupları söndürmek için LFn ucunu 50 milimolar L-sistein, 1 molar sodyum klorür, 0.1 molar sodyum asetat pH beşe dört dakika daldırın. Tampon taban çizgisi oluşturmak için söndürülmüş LFn ucunu 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorüre batırdıktan sonra, LFn PA-prepore kompleksini oluşturmak için ucu beş dakika boyunca 0.5 mikromolar koruyucu antijen preparatörü, 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorüre daldırın.
PA-prepore ilişkilendirildikten sonra, ucu PA-prepore solüsyonundan çıkarın ve spesifik olarak bağlanmamış PA-prepore'u yıkamak için ucu 30 saniye boyunca 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorüre batırın. LFn PA-prepore kompleksini beş dakika boyunca 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorür içinde 0.5 mikromolar CMG2'ye daldırın. LFn PA-prepore CMG2 kompleksini 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorür içine 30 saniye daldırın ve pre-endozomal bir kompleks oluşturmak için bağlanmamış CMG2'yi yıkayın.
EM analizi için, ucu beş mikrolitre 50 milimolar DTT, 50 milimolar Tris ve 50 milimolar sodyum klorür içeren bir PCR tüpüne daldırarak LFn PA-prepore CMG2 kompleksini biyosensör ucundan serbest bırakın. Kompleksten peptitlerin tandem MS analizi için, biyosensörü beş mikrolitre 50 milimolar DTT, altı molar keratin içermeyen guanidin hidroklorür ve 25 milimolar amonyum bikarbonat, pH sekiz içeren bir PCR tüpüne daldırarak LFn PA-prepore CMG2 kompleksini biyosensör ucundan serbest bırakın. pH geçişinden sonra kompleksi görüntülemek için, LFn PA-prepore CMG2 kompleksini az önce gösterildiği gibi biyosensör üzerine monte edin.
PA preparatının PA gözeneğine geçişini başlatmak için biyosensör ucunu beş dakika boyunca 10 milimolar asetat pH beşe daldırın. Bu geçiş, artan genlik ile gösterilir, ardından azalmış bağlanma afinitesine bağlı olarak tam reseptör ayrışması için önemli olduğu varsayılan daha büyük bir genlik düşüşü gelir. EM analizi için, disülfid salınımından sonra çözeltide toplanmayı önlemek için biyosensör ucunu beş dakika boyunca 1.25 milimolar misel içeren bir çözeltiye daldırın.
Negatif leke elektron mikroskobu yapmak için, karbon kaplı bakır 300 ızgarayı 0,38 milibar kararlı atmosfer basıncında ve eksi 15 miliamperde 20 saniye boyunca kızdırarak boşaltarak başlayın, ardından cihazı hava ile havalandırın. Izgarayı bir çift temiz cımbız arasına sabitleyin. Daha sonra dört mikrolitre salınan karmaşık numuneyi ızgaraya pipetleyin ve 60 saniye boyunca adsorpsiyona izin verin.
Bir filtre kağıdı takozu ile kalan sıvıyı fitille uzaklaştırın. Ardından, üzerine beş mikrolitre %0,75 nokta sıfır iki mikron filtrelenmiş uranil format pipetleyerek ızgarayı boyayın ve beş saniye sonra fazla lekeyi fitilleyin. Izgaranın üstü kapalıyken oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
Ardından numuneyi görüntülemek için transmisyon elektron mikroskobunu kullanın. Son olarak, metin protokolüne göre kütle spektrometresi için numuneler hazırladıktan sonra, kütle spektrometresini CID ve otomatik kontrol altında 35'lik normalleştirilmiş çarpışma enerjisi kullanarak sürekli olarak bir MS taraması yapmak için çalıştırın ve ardından üç saniyelik bir süre içinde mümkün olduğunca çok sayıda tandem MS-MS taraması yapın. BLI sentogram izi, şarbon toksin bileşenlerinin spesifik olarak eklenmesinden kaynaklanan genlik değişikliklerinin gerçek zamanlı bir okumasıdır.
İlk yükselme LFn'nin uca yüklenmesidir. Su verme ve taban çizgisinden sonra, PA-prepore LFn'ye bağlanır, ardından çözünür CMG2 eklenir ve bu da monte edilmiş pre-endozomal kompleks ile sonuçlanır. Kompleks daha sonra reseptör bağlanmasını zayıflatan düşük pH'a tabi tutulur ve prepore'un misellerin eklenmesiyle onaylanan genişletilmiş gözenek onayına geçmesine neden olur.
Burada, biyosensörden serbest bırakıldıktan sonra komplekslerin negatif leke EM görüntüleri gösterilmektedir. Pre-endozomal numune ızgaraları, LFn PA-prepore CMG2'den oluşan sağlam üçlü komplekslerle tutarlı yoğunluklar gösterdi. Asitleşme sonrası kompleks ızgaralar, PA'nın gözeneklere geçtiğini ve belirgin bir CMG2 yoğunluğu olmaksızın misel inklüzyonu ile çözündüğünü gösterir.
Protein komplekslerini doğrulayan MS tarafından görüldüğü gibi, endozomal öncesi MS örnekleri, LFn, PA ve CMG2 için sırasıyla% 60.46, 67.97 ve 54.15 kapsama alanına sahip üç toksin bileşeninin hepsinden peptitler içeriyordu. Post-endozomal numuneler sadece LFn ve PA'dan peptitler içeriyordu. CMG2 eksikliği, gözenek oluşumu sırasında gözlenen BLI nanometre azalması ile tutarlıdır. Büyük makromolekül komplekslerinin montajını izleme ve doğrulama yeteneği, büyük biyomoleküler düzeneklerin özgüllüğünü ve işlevselliğini anlamak için çok önemli bir adımdır.
Elektron mikroskobu görselleştirmesi için önceden monte edilmiş makromoleküler kompleksleri biyosensörlerden mikro hacimlere bırakma yeteneğimiz, yapı analizi için son derece yararlı olacaktır. Biyosensör montaj kompleksleri bileşimine ilişkin analizimiz, asimile edilmiş endozomal asitleşmeden önce ve sonra bileşenlerini tanımlamak için salım kompleksinin yalnızca 0.04 femtomolünü kullandı. Biyosensör düzeneği salım protokolü, viral protein yapılarındaki diğer bakteriyel toksinlerin doğal ancak anlaşılması zor pH kaynaklı endozomal geçişlerini takip edecek şekilde uyarlanabilir ve protein agregasyonundan kaçınma bonusu da eklenebilir.
Genel Bakış
Bu makale, biyokatman girişimometrisi (BLI) kullanarak şarbon toksinin montaj ve demontajının izlenmesi için bir protokol sunar. Metodoloji, elektron mikroskobu ve kütle spektrometrisi aracılığıyla protein komplekslerinin görselleştirilmesini ve tanımlanmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Yapısal Biyoloji
- Protein Dinamiği
Arka Plan
- Protein kompleksi oluşumunu anlamak, biyokimyasal araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
- Biyokatman girişimometrisi, protein etkileşimlerinin gerçek zamanlı gözlemi için bir platform sağlar.
- Elektron mikroskobu ve kütle spektrometrisi, kompleks yapıların doğrulanması için esastır.
- Şarbon toksini, protein montaj dinamiklerinin incelenmesi için bir model olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- Değişen pH koşullarında protein komplekslerinin dinamik montajını gözlemlemek.
- Gelişmiş görüntüleme teknikleri kullanarak şarbon toksin kompleksinin bileşenlerini doğrulamak.
- Protein kompleksi oluşumunun özgüllüğü hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Montaj/demontaj kinetiğini izlemek için biyokatman girişimometrisi.
- Protein komplekslerinin görselleştirilmesi için elektron mikroskobu.
- Kompleks bileşenlerinin tanımlanması için kütle spektrometrisi.
- Yapısal yeniden düzenlemeleri incelemek için kontrollü pH ortamları.
Ana Sonuçlar
- Şarbon toksin kompleksinin başarılı montajı gösterildi.
- Yapısal geçişlerin gerçek zamanlı izlenmesi sağlandı.
- Elektron mikroskobu, salınan komplekslerin yapısal bütünlüğünü doğruladı.
- Kütle spektrometrisi, kompleks bileşenlerinin ayrıntılı tanımlanmasını sağladı.
Sonuçlar
- Protokol, protein kompleksi dinamiklerini etkili bir şekilde izler.
- BLI'yi EM ve MS ile birleştirmek, protein etkileşimlerinin kapsamlı bir analizini sunar.
- Bu metodoloji, benzer çalışmalar için diğer protein komplekslerine uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time monitoring of pH-induced protein complex assembly and disassembly, providing critical insights into target validation and mechanistic de-risking for toxin-based therapeutic development. By combining label-free BLI with EM and MS, it supports predictive confidence in early discovery by confirming complex identity and structural transitions under disease-relevant conditions. The approach addresses a key discovery inflection point: verifying that predicted macromolecular interactions occur with correct stoichiometry and environmental responsiveness before advancing to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by validating the assembly of specific protein complexes under controlled pH conditions that mimic endosomal environments.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of binding kinetics and complex stability, reducing mechanistic ambiguity in toxin-receptor interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming whether toxin components engage receptors with expected affinity shifts upon acidification, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by releasing defined complexes into microliter volumes suitable for structural and compositional analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sequential, easy-to-replicate procedures that yield quantifiable BLI sensogram traces correlating with complex formation.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse, as the BLI biosensor surface can be regenerated and reused for multiple rounds of complex assembly and release.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by modeling anthrax toxin endosomal transition, a mechanism applicable to other bacterial toxins and viral entry proteins.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural and compositional verification of complexes before and after pH transition.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by using EM and MS to confirm complex identity and receptor dissociation, reducing false positives in downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through real-time complex monitoring.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by allowing researchers to assemble, visualize, and validate predicted macromolecular complexes in a controlled, label-free format.
- Screening: Describes assay readiness through the release of assembled complexes into microvolumes for EM and MS analysis, ensuring reproducibility and quantitative output.
- Analytics: Highlights measurements such as BLI amplitude changes, EM density patterns, and MS peptide coverage (e.g., 60.46% for LFn, 67.97% for PA, 54.15% for CMG2 in pre-endosomal complexes) that enable teams to compare conditions and confirm complex integrity.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by confirming structural transitions (e.g., prepore to pore) and compositional changes (e.g., loss of CMG2 signal post-acidification) that mirror endosomal events.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability, noting that the BLI biosensor surface can be regenerated and the release protocol adapted to other pH-sensitive protein systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein complex formation, and confirmation of structural dynamics under disease-relevant conditions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of complex assembly and release procedures across runs and laboratories.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency through early de-risking, and reduced late-stage biological failure by validating complex behavior before investment.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on confirmed complex assembly, pH responsiveness, and component identity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biolayer interferometry, protein labeling and coupling, and interpretation of real-time binding kinetics.
- Dependent on instrumentation including BLI systems, transmission electron microscopes, and high-resolution mass spectrometers (e.g., Orbitrap Fusion Lumos).
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, pH shift timing, and release protocols to ensure consistent complex recovery for EM and MS.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other model systems, particularly regarding biosensor surface chemistry and stability of complexes under acidic or micelle-containing conditions.
- Includes practical limitations such as the need to prevent aggregation post-release (addressed by micelle inclusion) and the requirement for sufficient complex stability during transfer to analysis platforms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:28
Assembly of Prepore Anthrax Toxin Complex on a PDEA-modified Amine Reactive Biosensor Surface
4:37
Assembly of Pore Anthrax Toxin Complex on PDEA-modified Amine Reactive Biosensor Surface
5:26
Identification of Released Macromolecular Assemblies from BLI Biosensors by Negative Stain Electron Microscopy and Mass Spectrometry
6:50
Results: Analysis of Dynamic Protein Complexes by Biolayer Interferometry, Electron Microscopy, and Mass Spectrometry
8:29
Conclusion
