Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Bu prosedürün genel amacı, biyokatman interferometrisi kullanarak farklı pH ortamlarında protein komplekslerinin dinamik montajını gözlemlemek ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi kullanarak bileşenleri doğrulamaktır. Protein kompleksi oluşumunu ve montajını yöneten özgüllüğün tanımlanması ve anlaşılması, biyokimyasal araştırmacılar için son derece ilgi çekicidir. Bugün bahsettiğimiz metodoloji, araştırmacıların tahmin edilen makromoleküler kompleksleri bir araya getirmesine, görselleştirmesine ve doğrulamasına olanak tanır.

Biyosensör yüzeyinin karmaşık doğası, araştırmacıların elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi analizi için birleştirilmiş kompleksleri küçük mikro hacimlere kolayca serbest bırakmasına izin verir. Bu gösteride, şarbon toksin kompleksinin pH kaynaklı yapısal yeniden düzenlemelerinin kinetiğini takip ettik ve bu yeniden düzenlemeleri elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi yöntemleriyle doğruladık, tüm bunları yaparken topaklanmadan kaçındık. BLI biyosensör yüzeyindeki şarbon toksin düzeneğini, makro numune salımını ve EM-negatif boyama prosedürlerini göstermek, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri Alexandra Machen ve Pierce O'Neil olacak.

Dr.Antonio Artigues, Orbitrap Fusion Lumos kütle spektrometresini kullanarak BLI tarafından salınan mikro örneklerin analiz edilmesinde ve tanımlanmasında etkilidir. Başlamak için, bir amin reaktif ikinci nesil BLI biyosensör ucunu 250 mikrolitre suya batırarak nemlendirin ve 10 dakika inkübe edin. Blitz yazılımında, adım sürelerini bu tabloda listelendiği gibi programlayın.

Biyosensör kalınlığı ve yoğunluğunun ilk taban çizgisini ölçmek için biyosensör ucunu 30 saniye boyunca 250 mikrolitre suya batırarak BLI çalışmasını başlatın. Daha sonra, ucu yedi dakika boyunca 250 mililitre 50 milimolar NHS ve 200 milimolar EDC'ye daldırarak biyosensörü etkinleştirin. Daha sonra, aktive edilmiş bir biyoreaktif yüzey oluşturmak için aktive edilmiş biyosensörü, 0.1 molar borat tamponu, pH 8.5 içinde çözülmüş 50 milimolar PDEA'ya beş dakika daldırın.

Şimdi, aktive edilmiş biyoreaktif biyosensörü, 10 milimolar sodyum asetat pH beş, 100 milimolar sodyum klorür tamponunda 100 nanomolar E126C LFn içeren bir çözeltinin 250 mikrolitresine beş dakika daldırın. Kalan serbest tiyol-reaktif grupları söndürmek için LFn ucunu 50 milimolar L-sistein, 1 molar sodyum klorür, 0.1 molar sodyum asetat pH beşe dört dakika daldırın. Tampon taban çizgisi oluşturmak için söndürülmüş LFn ucunu 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorüre batırdıktan sonra, LFn PA-prepore kompleksini oluşturmak için ucu beş dakika boyunca 0.5 mikromolar koruyucu antijen preparatörü, 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorüre daldırın.

PA-prepore ilişkilendirildikten sonra, ucu PA-prepore solüsyonundan çıkarın ve spesifik olarak bağlanmamış PA-prepore'u yıkamak için ucu 30 saniye boyunca 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorüre batırın. LFn PA-prepore kompleksini beş dakika boyunca 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorür içinde 0.5 mikromolar CMG2'ye daldırın. LFn PA-prepore CMG2 kompleksini 50 milimolar Tris, 50 milimolar sodyum klorür içine 30 saniye daldırın ve pre-endozomal bir kompleks oluşturmak için bağlanmamış CMG2'yi yıkayın.

EM analizi için, ucu beş mikrolitre 50 milimolar DTT, 50 milimolar Tris ve 50 milimolar sodyum klorür içeren bir PCR tüpüne daldırarak LFn PA-prepore CMG2 kompleksini biyosensör ucundan serbest bırakın. Kompleksten peptitlerin tandem MS analizi için, biyosensörü beş mikrolitre 50 milimolar DTT, altı molar keratin içermeyen guanidin hidroklorür ve 25 milimolar amonyum bikarbonat, pH sekiz içeren bir PCR tüpüne daldırarak LFn PA-prepore CMG2 kompleksini biyosensör ucundan serbest bırakın. pH geçişinden sonra kompleksi görüntülemek için, LFn PA-prepore CMG2 kompleksini az önce gösterildiği gibi biyosensör üzerine monte edin.

PA preparatının PA gözeneğine geçişini başlatmak için biyosensör ucunu beş dakika boyunca 10 milimolar asetat pH beşe daldırın. Bu geçiş, artan genlik ile gösterilir, ardından azalmış bağlanma afinitesine bağlı olarak tam reseptör ayrışması için önemli olduğu varsayılan daha büyük bir genlik düşüşü gelir. EM analizi için, disülfid salınımından sonra çözeltide toplanmayı önlemek için biyosensör ucunu beş dakika boyunca 1.25 milimolar misel içeren bir çözeltiye daldırın.

Negatif leke elektron mikroskobu yapmak için, karbon kaplı bakır 300 ızgarayı 0,38 milibar kararlı atmosfer basıncında ve eksi 15 miliamperde 20 saniye boyunca kızdırarak boşaltarak başlayın, ardından cihazı hava ile havalandırın. Izgarayı bir çift temiz cımbız arasına sabitleyin. Daha sonra dört mikrolitre salınan karmaşık numuneyi ızgaraya pipetleyin ve 60 saniye boyunca adsorpsiyona izin verin.

Bir filtre kağıdı takozu ile kalan sıvıyı fitille uzaklaştırın. Ardından, üzerine beş mikrolitre %0,75 nokta sıfır iki mikron filtrelenmiş uranil format pipetleyerek ızgarayı boyayın ve beş saniye sonra fazla lekeyi fitilleyin. Izgaranın üstü kapalıyken oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.

Ardından numuneyi görüntülemek için transmisyon elektron mikroskobunu kullanın. Son olarak, metin protokolüne göre kütle spektrometresi için numuneler hazırladıktan sonra, kütle spektrometresini CID ve otomatik kontrol altında 35'lik normalleştirilmiş çarpışma enerjisi kullanarak sürekli olarak bir MS taraması yapmak için çalıştırın ve ardından üç saniyelik bir süre içinde mümkün olduğunca çok sayıda tandem MS-MS taraması yapın. BLI sentogram izi, şarbon toksin bileşenlerinin spesifik olarak eklenmesinden kaynaklanan genlik değişikliklerinin gerçek zamanlı bir okumasıdır.

İlk yükselme LFn'nin uca yüklenmesidir. Su verme ve taban çizgisinden sonra, PA-prepore LFn'ye bağlanır, ardından çözünür CMG2 eklenir ve bu da monte edilmiş pre-endozomal kompleks ile sonuçlanır. Kompleks daha sonra reseptör bağlanmasını zayıflatan düşük pH'a tabi tutulur ve prepore'un misellerin eklenmesiyle onaylanan genişletilmiş gözenek onayına geçmesine neden olur.

Burada, biyosensörden serbest bırakıldıktan sonra komplekslerin negatif leke EM görüntüleri gösterilmektedir. Pre-endozomal numune ızgaraları, LFn PA-prepore CMG2'den oluşan sağlam üçlü komplekslerle tutarlı yoğunluklar gösterdi. Asitleşme sonrası kompleks ızgaralar, PA'nın gözeneklere geçtiğini ve belirgin bir CMG2 yoğunluğu olmaksızın misel inklüzyonu ile çözündüğünü gösterir.

Protein komplekslerini doğrulayan MS tarafından görüldüğü gibi, endozomal öncesi MS örnekleri, LFn, PA ve CMG2 için sırasıyla% 60.46, 67.97 ve 54.15 kapsama alanına sahip üç toksin bileşeninin hepsinden peptitler içeriyordu. Post-endozomal numuneler sadece LFn ve PA'dan peptitler içeriyordu. CMG2 eksikliği, gözenek oluşumu sırasında gözlenen BLI nanometre azalması ile tutarlıdır. Büyük makromolekül komplekslerinin montajını izleme ve doğrulama yeteneği, büyük biyomoleküler düzeneklerin özgüllüğünü ve işlevselliğini anlamak için çok önemli bir adımdır.

Elektron mikroskobu görselleştirmesi için önceden monte edilmiş makromoleküler kompleksleri biyosensörlerden mikro hacimlere bırakma yeteneğimiz, yapı analizi için son derece yararlı olacaktır. Biyosensör montaj kompleksleri bileşimine ilişkin analizimiz, asimile edilmiş endozomal asitleşmeden önce ve sonra bileşenlerini tanımlamak için salım kompleksinin yalnızca 0.04 femtomolünü kullandı. Biyosensör düzeneği salım protokolü, viral protein yapılarındaki diğer bakteriyel toksinlerin doğal ancak anlaşılması zor pH kaynaklı endozomal geçişlerini takip edecek şekilde uyarlanabilir ve protein agregasyonundan kaçınma bonusu da eklenebilir.