Name: Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Keşfedin yetişkin Danio rerio dolaşım sistemine mikroparçacık enjeksiyonu ve solungaçlarda canlı görüntüleme tekniği. Bu yöntem, floresan prob kullanarak balık kan pH'ının tekrarlanan ölçümlerini mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar büyük ölçüde Bogdan Osadchiy ve Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Rusya) yardımıyla video Protokolü hazırlanmasında kabul etmiş oluyorsunuz. Bu araştırma için temel araştırma (#15-29-01003) Rus Bilim Vakfı (#15-14-10008) ve Rus Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel yordamlar AB Direktifi 2010/63/AB hayvan deneyleri için uygun olarak yapılmıştır ve hayvan konularda araştırma komitesi, Enstitüsü biyoloji Irkutsk State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Microcapsules imalatı
Not: bir floresan boya taşıyan Microcapsules ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8katman katman Meclisi kullanarak hazırlanır. Tüm yordamları oda sıcaklığında yapıldı.
<ol><li>Gözenekli CaCO3 microcores floresan boya kapsayan sentezlemek için 2 mL (çoğu polimer bağlı floresan boya FITC-BSA gibi kullanılabilir) SNARF-1-dextran çözeltisi ~ 2 mg/mL konsantrasyonu 0.6 mL ile her biri 1 mol/L çözümleri CaCl2, mix ve Na2CO3 hızlı karıştırma altında. Not: floresan boyalar farklı hassasiyetleri photobleaching için dikkat; bir ışığa duyarlı floresan sonda (gibi SNARF-1) kullandıysanız, işleme ve depolama microparticles ile mümkün olduğunca az ışık olarak gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Sonra 5-10 s ajitasyon, süspansiyon 2 mL microcentrifuge tüpler ve santrifüj 15 transfer 10.000-12.000 CaCO3 microcores cips için g, s.</li>
	<li>Süpernatant atmak, çekirdek ~ 2 mL deiyonize su ile yıkayın ve Pelet sallayarak resuspend.</li>
	<li>Toplamda üç kez Santrifüjü yıkama yordamı yineleyin. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.</li>
	<li>Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya. Dikkat: kulak kulaklık ile korumak unutmayın.</li>
	<li>İlk polimer katman şablonlar yatırmak için ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik poly(allylamine hydrochloride) (PAH) 1 mol/L NaCl içinde çekirdek resuspend.<ol>
<li>Microcores ~ 5 dakika sürekli sallayarak ile çözüm unutmayın.</li>
		<li>15 sonra Santrifüjü, s süpernatant ilişkisiz PAH ile atmak. Kapalı microcores en az 3 kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü ve adımları yıkama deiyonize su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.</li>
		<li>Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya. Not: Uygulamalı floresan boya katyonik ise, poli (sodyum 4-styrenesulfonate) başlatma (PSS) ın 1 mol/L NaCl (bkz. Adım 1.7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.6 ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik (Ayrıca 1 mol/L NaCl içeren) PSS ile ikinci polimer tabaka şablonlar yatırmak için adımları yineleyin.</li>
	<li>12 polimer kat yatırmak için 1,6 ve 1.7 altı kez adımları yineleyin. Not: Bu uzun bir aradan (~ 12 saat veya daha fazla) almak için tavsiye edilmez çünkü CaCO3 microcores kapsama olmadan Li2 eğilimi ~ 3-5 kadar yordamdaki katmanları yatırılan. Not PSS kapsama microcores daha yüksek bir toplama neden olur ve uzun sessizlik (PLL-g-PEG) sadece PAH veya poli-L-lizin Polietilen glikol ile aşılı dıştaki katman olduğunda önerilir.</li>
	<li>Kapalı microcores 2 mg/ml PLL-g-PEG (~ 1 mL microtube başına) en az 2 h için kuluçkaya.<ol>
<li>Microcores sıralı Santrifüjü ve resuspension adımları üzerinden su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İçi boş microcapsules elde etmek için CaCO3 şablonlar 2 mL (pH 7.1 NaOH ile düzeltilmiş) 0,1 mol/L ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltisi ekleyerek kapalı microcores geçiyoruz.<ol>
<li>Microcapsules 45 s ve atma, kuluçka ~ 5 dk sonra santrifüj kapasitesi süpernatant EDTA ile.</li>
		<li>1.10-1.10.1 adımları iki kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microcapsules % 0,9 NaCl üç kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü adımlar içinde 45 ile yıkayın s takip adımlar yıkayarak. Son Santrifüjü adımdan sonra süpernatant atmak. Not: Son microcapsule çözüm enjeksiyon için (örneğin ampisilin, 0.1 mg/mL ekleyerek) steril tutulmalıdır ve medya araştırma (izotonik ortam nötr pH ile) ile biyouyumlu olmalıdır.</li>
	<li>Bir hemasitometre bir floresan mikroskop altında hazırlanan microcapsules konsantrasyonu tahmin ediyoruz. Microcapsules resimleri bir dizi, çapı yüz microcapsules ImageJ9 veya eşdeğer yazılım kullanma hakkında ölçmek ve bir çubuk grafik kullanarak boyutu dağıtım araştırmak.</li>
	<li>Mağaza elde edilen karanlıkta prob kapsüllenir. Not: sonra birkaç yıkama steril % 0,9 NaCl, microcapsules ay 4 ° C'de depolanan Tam microcapsules depolama sırasında kurutma tavsiye edilmez.</li>
</ol>2. Optik Kurulum ve kalibrasyon mikroenkapsüle SNARF-1'in hazırlanması
Not: Kaba pH ölçümleri mikroenkapsüle SNARF-1 ile floresan mikroskop7iki kanallarında görüntüleri kullanılarak yapılabilir, ancak tek kanallı floresan mikroskop fiber spektrometre için bağlı bu protokolü uygulandı.
<ol><li>Floresan filtre uygulanan floresan boya özelliklerine göre floresan mikroskop için gerekli kümesi yerleştirin ve floresan lamba açmak.<ol>
<li>Kolu göz mercekleri için çekin. Uyarı: Aşırı ışık Spektrometre matris zarar verebilir. Böylece, spektrometre kullanılmadığında kolu "mercek" modunda olduğundan emin olun.</li>
		<li>Fiber optik bir ucunu Spektrometre ve bir kolimatör diğer ucunu bağlayın. Bağdaştırıcıları kullanarak, Kolimatör kamera tüpü odak veya floresan mikroskop diğer kullanılabilir bağlantı noktası ekleyin.</li>
		<li>Spektrometre üzerinde açın. Spektrometre denetim programını çalıştırıp Spektrometre ölçümleri için hazırlamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microcapsule toplu kalibrasyonunun ~ 5 µL microcapsule süspansiyon (~ 10 000 microcapsules µL deiyonize su başına), mikroskop slaytta yer ve karanlık bir yere (örneğin, bir termostat 35 ° c) içinde belgili tanımlık damla kuru.<ol>
<li>Microencapsulated SNARF-1 spektral özellikleri ayarlamak için bir dizi arabellekleri ~ 6-9 aralığındaki farklı pH değerleri kullanın. ~ 10 µL SNARF-1-dextran ile kurutulmuş microcapsules üzerine bir arabellek bırak ve bir coverslip ile kaplayın.</li>
		<li>Cam slayt mikroskop sahnesinde yerini. × 40 amacı istimal microcapsules bulun.</li>
		<li>Mikroskop kolu kamera bağlantı noktasına çevirin. Onların Floresans Spektrometre ile kayıt. Göz mercekleri başa kolu çevirin. Not: spektral sinyal çok arka plan düzeyinin sağlayın ve görüş alanı içinde microcapsules bir balonun içinde (daha düşük bir boyuta gerekirse geçiş yaparak) olmadığından emin olun. Aynı microcapsules uzun süreli aydınlatma kaçının. SNARF-1 için photobleaching duyarlıdır.</li>
		<li>2.2.3 farklı microcapsules için 10 - 15 kez yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan en yüksek oranları (örneğin, R veya Scilab kullanarak) hesaplamak için tüm kayıtlı spectra ve medyan oranı (için her arabellek) ve aşağıdaki formülü kullanarak orta pH arasındaki regresyon çizgisini belirler: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> Not: SNARF-1 ile iki doruklarına protonated ve deprotonated boya emisyon için karşılık gelen bir spektrum vardır ve tepeler arasındaki oran orta pH cevap veriyor. Bu çalışmada, 605 ve 660 nm floresan yoğunluğu arasındaki oranı kullanılır. Bu dalga boyu kullanılan filtre kümesini bağlı olarak seçilir. a ve b (örneğin, R kullanarak) doğrusal olmayan regresyon belirlenecek katsayıları vardır. 0,15 ve 1.1 değerlerdir, sırasıyla, minimum ve maksimum değerlerini ben605/i660 kalibrasyon sırasında gözlenen.</li>
	<li>Balık kan yaklaşık 10 µL yaklaşık 5 Yetişkin hayvanlardan toplamak. Yer balık Petri kabına 1 µL/mL ile içine su karanfil yağı anestezi için süspansiyon ve hayvan yan döner ve fin pinch için yanıt vermiyor kadar bekleyin (genellikle ~ 2-3 dk). Balık bir cam slayt üzerinde aktarın. Balık kuyruğu lanset ile kesti ve kuyruk damar yaklaşık 2 µL balık kan toplamak. Not: kan pıhtılaşma önlemek için heparin (5000 U/mL) ile belgili tanımlık kesme tedavi ve heparinized cam kılcal damarlar ve microcentrifuge tüpler kan toplamak için kullanın.<ol>
<li>Yaklaşık 10 µL kan elektrot ucunu üzerine bir pipet ile damla ve pH pH-metre kullanarak belirleyebilirsiniz.</li>
		<li>Kan kurutulmuş microcapsules ile bir slayt üzerine bırakın ve kalibrasyon arabelleklerini (adım 2.2 2.3) açıklandığı gibi floresan yoğunluğu oranı kayıt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eğri (için daha fazla ayrıntı bkz: Borvinskaya ve ark. 20175) balık kanı ölçümlerde maç yapmak için kalibrasyon eğrisi doğrusal katsayısı ayarlayın.</li>
</ol>3. hazırlık enjeksiyon için
<ol><li>Çelik iğne ucu keskin lanset ile plastik kaldırarak insülin kalem (veya şırınga) yayın. Not: Herhangi bir ince iğne (Ø0.33 mm veya daha az) veya cam kılcal (genellikle Ø1 mm) mikroenjeksiyon10,11için hazırlıklı ol.</li>
	<li>İğneyi yarıya kadar cam microcapillary yerleştirin; hızlı ve yavaş bir gaz meşale kullanarak lehim.</li>
	<li>Cam microcapillary için microinjector bağlamak ve üç kez steril su ile yıkayın. Sıvı iğne akar emin olun.</li>
	<li>Sistem distile su ile doldurun. Not: sistemde hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. enjeksiyon
<ol><li>Microcapsules hazırlanan süspansiyon resuspend (steril % 0.9 NaCl veya diğer medya kullanılan 0.5 ila 6 milyon microcapsules microliter başına bir konsantrasyon ile enjeksiyonlar için) için 1 dk ultrasonik banyo kullanarak. Not: microcapsules, aşağıdaki enjeksiyon sırasında çökelti eğilimindedir bu yana şişeyi microcapsules ile mekanik sallamak (bir rotor kullanarak) veya el ile her birkaç dakikada onları resuspend ve onların toplama önlemek için.</li>
	<li>~ 2-3 için bir petri anestezi (0.1 mL/L karanfil yağı suya askıya) ile içine balık yer dk. kadar bekleyin balık yan döner ve fin hafif bir tutam yanıt vermiyor.</li>
	<li>Bir kaşık kullanarak, anestezi çıkmış balık aktarmak ve yavaşça (sağ elini kullanan kişi için) sola doğru veya (sol elli kişi için) sağa doğru kafa ile yanal bir konumda nemli bir sünger üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Sadece enjeksiyon önce 1-2 mm cam kılcal damar içine hava microinjector ile bağlı emmek. O zaman, dağınık microcapsules yaklaşık 2 µL ile yük. Not: enjeksiyon önce microcapsule çözüm hangi balık tutulur sıcaklık ayarlanması gerekir.</li>
	<li>Yavaşça sigara dominant el ile sünger balık gövdesini stabilize etmek.<ol>
<li>Sonradan içini kaplamak balık bulmak. Zihinsel genişleten bir kesimi operculum karın boşluğu sonuna kadar seçer. Bu segmentteki ortasını bulmak. İğne 1 mm daha düşük ventral yönde koymak.</li>
		<li>Kazıma bir hareketi, yavaşça balık bir kenara ölçekler ve bir delik yapmak hareket. Tablo yüzeye 45 ° açılı ve vücuda iğne yerleştirin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde buna karşı aittir kadar iğne omurga doğru itin.</li>
		<li>Microcapsules süspansiyon yaklaşık 1 µL böbrek bırakın ve yavaş yavaş iğne tutar. Not: uygun delik site bulmak için daha kolay, pratik Şekil 2A ve 2B'yigösterildiği gibi bir alt ışık kullanarak balıklar transilluminating tarafından gövde böbrek bulmak için yararlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjeksiyon yerinde dökülmüş herhangi bir microcapsules kaldırmak için su akışı ile kuyruk başından balık durulayın.</li>
</ol>5. içinde Vivo görselleştirme
<ol><li>Balık baştan gill kapağını çıkarın ve balık solungaçları denude için diseksiyon makası kullanın. Solungaçları su ile durulayın.</li>
	<li>Bir kaşık kullanarak, balık mikroskop slayda aktarmak ve floresan mikroskop sahnesinde yerini. Not: balık solungaçları ardışık işlemler sırasında kurumasına olduğunu emin olun. Bunu önlemek için düzenli olarak onları nemlendirin su Pasteur pipet (yaklaşık her 1-2 dk) kullanarak.</li>
	<li>Odayı karartmak ve düşük büyütme (x 10 amaç) kullanarak floresan microcapsules bulmak için solungaçları inceleyin. Not: balık dolaşım sistemi içine bazı floresan parçacıkların giriş için yordam kullanıldığında, solungaçları, birkaç bireylerin enjeksiyonları önce beklenmedik floresan parçacıklar için incelemek için önerilir. Vahşi-türü zebra balığı solungaçları autofluorescence yok ama bazı durumlarda sporadik floresan parçacıklar (gıda parçaları veya tek hücreli simbiont) solungaçları üzerinde mevcut olabilir. Gerekli, bu tür parçacıklar belirli şekilleri göre kabul edilebilir eğer (örneğin, gıda adet düzensiz şekli, küresel microcapsules aksine var) veya floresan spektrum (Yani, renk).<ol>
<li>Objektifin daha yüksek bir büyüklük (× 40 amaç) geçin ve bir microcapsule veya microcapsules bir grup görüş alanı ortasına yerleştirin.</li>
		<li>Yandaki bağlantı noktasına bağlı bir Spektrometre ile açmak. Spektral sinyal kaydedebilir.</li>
		<li>Mercek için geri kolu çevirin.</li>
		<li>Ölçümler için farklı microcapsules birkaç kere tekrar edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Balık akvaryum kurtarma için uygun havalandırma ile aktarın. Not: en az uygulama ile enjeksiyon ve 2-3 dk balık başına yaklaşık bir oranda kayıt sinyal yapmak mümkündür. Ölçüm bir bireysel birkaç kez anestezi tekrarlanan zararsız, düşük doz veya başka bir yöntemi fiksasyon kullanımı ile tekrar edilebilir. Uzun vadeli gözlem için bir sistem ile sürekli anestezi12kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+microparticles+of+polymers+and+polysaccharides+to+administer+fish+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines.</a> Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).</li>
<li>Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+polyelectrolyte+microcapsules+as+a+contrast+agent+for+photoacoustic+imaging+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood.</a> J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+stress+assessment+of+aquatic+animals+with+microencapsulated+biomarkers+for+environmental+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring.</a> Sci. Rep. 6, e36427(2016).</li>
<li>Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+in+vivo+monitoring+of+pH+in+gill+capillaries+and+muscles+of+fishes+using+microencapsulated+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers.</a> Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).</li>
<li>Diep, C. Q., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+cells+directly+into+the+kidney+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).</li>
<li>Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2007/jm/b705419j#!divAbstract">Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors.</a> J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).</li>
<li>Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210020">Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo.</a> Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+-+Version+1.44%22">ImageJ User Guide - Version 1.44</a>. , 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ ">imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ </a> (2012).</li>
<li>Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+brain+microinjection+to+study+molecular+substrates+of+motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior.</a> J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), e960(2008).</li>
<li>Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).</li>
<li>McKee, R. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+renal+pathology%3A+Emerging+models+of+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury.</a> Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hollow+polymer+shells+by+colloid-templated+assembly+of+polyelectrolytes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).</li>
<li>Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S092777570300195X">Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication.</a> Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).</li>
<li>Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl0259333">Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals.</a> Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).</li>
<li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li>
<li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microparticles enjeksiyon zebra balığı böbrek içine göstermek için yarı geçirgen microcapsules bir göstergesi boya ile yüklenen kullanılmıştır. Böylece, iletişim kuralı kullanarak katman katman derleme ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8,15,16,17 microcapsules imalatı için yönergeler içerir ,18 (Şekil ...

Mikro büyüklükteki parçacıklar yönetim hayvan bir organizma içine ilaç ve aşı teslim1, damarlara görselleştirme2, transgenik hücre implantasyonu3ve küçük optik sensör implantasyon gibi alanlarda önemli bir görevdir 4 , 5. ancak, implantasyon yordam microscale parçacıklar halinde küçük Laboratuvar hayvanlarının damar sistemi için özellikle hassas Sucul organizmalar için zordur. Zebra balığı gibi popüler araştırma numuneler için bu tavsiye edilir bu yordamları açıklık video protokollerini kullanarak.
İntrakardiyak ve kapiller microinjections'microobjects dır zebra balığı kana eğitimli personel ve benzersiz mikrocerrahi özellikleri gerektirir. Daha önce bir retro-orbital el ile enjeksiyon3 tüm hücreleri yönetim için kolay ve etkili bir yöntem olarak önerilmiştir. Ancak, deneyim, göz kılcal ağ küçük alanı nedeniyle bu teknik üzerinden istenilen sonucu elde etmek için çok pratik alır.
Burada, biz güçlü ve verimli microparticle implantasyon dolaşım sistemi içine için bir yöntem yetişkin zebra balığı, böbrek dokusunun içine doğrudan el ile enjeksiyonla kılcal damar ve böbrek damarlarının açısından zengin olduğu açıklanmaktadır. Bu teknik zebra balığı böbrek6içine hücre transplantasyonu için video protokolünü dayanır ama travmatik ve zaman alıcı mikrocerrahi adımları elendi. Önerilen yöntem tarafından düşük mortalite ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır.
Hangi enjeksiyon kalite, sayısı bir kaba göreli değerlendirme doğrulanmasına izin verir (floresan veya renkli olmaları durumunda) implant microparticles gill kılcal damarlar içinde görselleştirme önerilen protokol önemli bir parçası olduğunu enjekte parçacıklar ve dolaşımdaki kandan doğrudan fizyolojik ölçümler için spektral sinyal algılama. Açıklanan tekniği olası uygulamaları bir örnek olarak, biz SNARF-1, ilk olarak önerilen Borvinskaya bir microencapsulated floresan sonda kullanarak zebra balığı kan pH vivo ölçümleri için protokol göstermek ve ark. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dekstran, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Floresan probu. Mikrokapsül dolgu maddesi olarak başka herhangi bir uygun polimere bağlı floresan boya</td></tr> kullanılabilir <tr><td>Albümin-floresein izotiyosiyanat konjugatı (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Floresan probu</td></tr><tr><td>Rhodamine B izotiyosiyanat-Dekstran (RITC-dekstran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Floresan probu</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO3 şablon oluşumu</td></tr><tr><td>Sodyum karbonat</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO<alt>3</alt> şablon oluşumu</td></tr><tr><td>Poli(alilamin hidroklorür), MW 50000 (PAH)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Katyonik polimer</td></tr><tr><td>Poli(sodyum 4-stirensülfonat), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Anyonik polimer</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin [20 kDa] polietilen glikol [5 kDa], g = 3.0 ila 4.5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)</td><td>Mikrokapsüllerin biyouyumluluğunu artırmak için nihai polimer</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>Uygulanan polimerleri çözmek için</td></tr><tr><td>Su Arıtma Sistemi</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>Deiyonize su hazırlamak için</td></tr><tr><td>CaCO</td><td>3 şablon oluşumu</td><td></td> için manyetik karıştırıcı Stegler <td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Araştırma&nbsp; artı pipet, 1000 ve mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dozaj çözümleri</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Araştırma&nbsp; artı pipet, 10 & L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dozajlama çözeltileri</td></tr><tr><td>Pipet uçları, hacim aralığı 200 ila 1000 & mikro; L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Dozaj çözeltileri</td></tr><tr><td>Pipet uçları, hacim aralığı 0.1-10&nbsp; &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Dozaj çözümleri</td></tr><tr><td>Mini-santrifüj Microspin 12, Yüksek hızlı</td><td>BioSan</td><td></td><td>Mikrokapsül santrifüjleme-yıkama prosedürü için</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Mikrokapsül sentezi ve depolanması</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı Intelli-karıştırıcı RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>Mikrokapsül agregasyonunu azaltmak için</td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici</td><td></td><td></td><td>Mikrokapsül agregasyonunu azaltmak için</td></tr><tr><td>Kafa telefonları&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Kulakları ultrasondan korumak için</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>CaCO3 şablonlarını çözmek için</td></tr><tr><td>Monosodyum fosfat</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>pH tamponlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Disodyum fosfat</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>pH tamponlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>EDTA çözeltisinin ve tamponlarının pH'ını ayarlamak için</td></tr><tr><td>: Termostat odası</td><td></td><td></td>: <td>Mikrokapsülleri cam slayt üzerinde kurutmak için</td></tr><tr><td>, Hemositometre, kan hücresi sayım odası</td><td></td><td></td>, <td>Hazırlanan mikrokapsüllerin boyut, dağılım ve konsantrasyonunu araştırmak</td></tr><tr><td>için: Floresan mikroskop, Mikmed 2</td>, <td>LOMO</td><td></td><td>Balık kanındaki</td></tr> <tr><td>mikrokapsüllerin in vivo görselleştirilmesiSNARF-1 için floresan filtre seti (mikroskop modeline bağlı olarak seçilmelidir; örnek verilmiştir)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Floresan problarla mikrokapsüllerin görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>Fiber spektrometresi QE Pro</td><td>Okyanus Optiği</td><td></td><td>Mikrokapsüllerin mikroskop altında kalibrasyonu</td></tr><tr><td>Fiber optik QP400-2-VIS NIR, 400 &mu; m, 2 m</td><td>Okyanus Optiği</td><td></td><td>Spektrometreyi mikroskop portuna bağlamak için</td></tr><tr><td>Kolimatör F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Spektrometreyi mikroskop portuna bağlamak için</td></tr><tr><td>Cam mikroskop slaytı</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Mikroskop altında mikrokapsüllerin kalibrasyonu</td></tr><tr><td>Lameller, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Mikrokapsüllerin mikroskop</td></tr> <tr><td>altında kalibrasyonuCam mikro kılcal damarlar Intra MARK, 10 & mikro; L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>Balık kanı toplamak için</td></tr><tr><td>Karanfil yağı</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Balık anestezisi</td></tr><tr><td>Lancet No 11</td><td>Apexmed international BV</td><td>P00588</td><td>Balık kuyruğunu kesmek ve insülin otoenjektörü</td></tr><tr><td>Heparin, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>Balık kanı alımı sırasında balık kanı ile temas eden tüm yüzeyleri tedavi etmek için</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH-metre mikroelektrotlu</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Balık kanı pH'ını belirlemek için</td></tr><tr><td>İnsülin kalemi iğneleri Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>Enjeksiyon işlemi için. Herhangi bir ince iğne (&Oslash; 0,33 mm veya daha az) uygundur</td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co</td><td>9201075</td><td>Enjeksiyon prosedürü için</td></tr><tr><td>Gaz meşalesi</td><td></td><td></td><td>Çelik iğneyi cam kılcal damara lehimlemek</td></tr><tr>için<td>Mikroenjektör IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>Mikrokapsüllerin hassas dozlanması için süspansiyon</td></tr><tr><td>Petri kapları, 60 mm x 15 mm, polistiren</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>Anestezi altında balıklarla yapılan manipülasyonlar için</td></tr><tr><td>Plastik kaşık</td><td></td><td></td><td>Anestezi altında balıklarla yapılan manipülasyonlar için</td></tr><tr><td>Nemli sünger</td><td></td><td></td><td>Anestezi altında balıklarla yapılan manipülasyonlar için</td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>Solungaç kapağını balık kafasından çıkarmak için</td></tr><tr><td>Pasteur pipeti, 3,5 mL</td><td>MARKA</td><td>Z331767</td><td>Balık solungaçlarını nemlendirmek için</td></tr></tbody></table>

basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde microparticles görselleştirme

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Canlı bir organizma içine mikro büyüklükteki parçacıkların yönetim sistemik damarlara görselleştirme, ilaç ve aşı teslim, transgenik hücreleri ve küçük optik sensörler implantasyonu için uygulanabilir. Ancak, biyolojik ve veteriner laboratuvarları çoğunlukla kullanılan, küçük hayvanların içine intravenöz microinjections çok zor ve eğitimli personel gerektirir. Burada, biz balık böbrek içine enjeksiyon tarafından microparticles giriş yetişkin zebra balığı (Danio rerio) dolaşım sistemi içine için sağlam ve verimli bir yöntem göstermek. Damarlara tanıtılan microparticles görselleştirmek için balık solungaçları basit bir intravital görüntüleme tekniği öneriyorum. Vivo zebra balığı kan pH kontrolü başarılı bir enjekte microencapsulated floresan kullanarak sonda, SNARF-1, açıklanan tekniği mümkün uygulamalarından birini göstermek için. Bu makalede pH duyarlı boya encapsulation ayrıntılı bir açıklamasını ve hızlı enjeksiyon prensipleri ve görselleştirme floresan sinyali VIVO içinde kayıt için elde edilen microcapsules gösterir. Enjeksiyon önerilen yöntemi düşük mortalite oranı ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır. Tüm açıklanan yordamları süs balıkları ve medaka gibi diğer küçük balık türleri üzerinde gerçekleştirilebilir.

Elde edilen sonuçları sunulan Protokolü üç ana kategoride birinden gelir: bir floresan boya (Şekil 1), microcapsules daha fazla görselleştirme ile böbrek enjeksiyon encapsulation tarafından floresan microparticles oluşumu Gill kılcal damarlar (Şekil 2 ve 3) ve pH seviyeleri (Şekil 4) kan son olarak, in vivo spektral kayıt SNARF-1 floresans izlemek için.
...

Bu makalede, floresan microparticles hızlı, minimal invaziv enjeksiyon circulatory system küçük balıklar ve balık kan microparticles in vivo görselleştirme içine prensipleri gösterilir.

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Bu prosedürün genel amacı, mikropartiküllerin balık böbreğine enjeksiyon yoluyla yetişkin zebra balığının dolaşım sistemine sokulması için bir teknik göstermektir. Sokulan mikropartiküller, balık solungaçlarında basit bir intravital görüntüleme tekniği ile damar sisteminde daha da görselleştirilir. Bu prosedür, örneğin, pH için mikrokapsüllenmiş floresan probların eklenmesiyle in vivo olarak balık kanı pH'ının tekrarlanan ölçümlerini gerçekleştirmek için kullanılabilir.Bunu yapmak için, ilk aşamada, dekstran ile konjuge edilmiş pH'a duyarlı boya SNARF-1, katman katman yaklaşım kullanılarak yarı geçirgen polielektrolit kabuk içinde kapsüllenir. Floresan boya, gözenekli kalsiyum karbonat mikro çekirdeklerine birlikte çökeltilir ve çekirdekler, çok sayıda zıt yüklü biyolojik olarak parçalanamayan polimer tabakası ile kaplanır ve polietilen glikol içeren biyouyumlu bir polimer ile üst kaplanır. Daha sonra, kalsiyum karbonat çekirdekleri, SNARF-1'i çevreleyen bütün mikrokapsülleri elde etmek için çözülür.Balık anestezisi ve fiksasyonunun ikinci aşamasında, hazırlanan mikrokapsüller, kapsüllenmiş boyayı balık dolaşım sistemine vermek için doğrudan hayvanın böbreğine enjekte edilir. Daha sonra, solungaç örtüsünü çıkarmak ve balık solungaçlarının kılcal damarlarını yok etmek için minimal ameliyat gerekir. Daha sonra, kandaki mikrokapsüllerin görselleştirilmesi ve floresan spektrumunun kaydedilmesi, kan pH'ını izlemek için intravital mikroskopi ile in vivo olarak yapılabilir.Enjeksiyon doğru yapıldığında, işlemden hemen sonra balık solungaçlarında floresan mikrokapsülleri gözlemlemek mümkündür. Kapsüllenmiş probun floresan spektrumu, bir floresan mikroskoba bağlı bir spektrometre kullanılarak kaydedilebilir. SNARF-1'in iki emisyon tepe noktası vardır ve bu tepe noktalarına karşılık gelen iki dalga boyu arasındaki oran pH'ı ölçmek için kullanılabilir.Önerilen prosedür, floresan mikrokapsüllerin balık dolaşım sistemine verilmesine ve balık kanındaki floresansın in vivo olarak uzaktan izlenmesine izin verir. Fizyolojik araştırma durumunda, bu yöntemin temel avantajı, genellikle gerçekleştirilmesi zor olan küçük laboratuvar hayvanlarında kan parametrelerinin tekrarlanan ölçümleridir. Işığa duyarlı bir floresan prob kullanılıyorsa, tüm prosedürün ışığı azaltılmış bir odada yapılması tavsiye edilir.Seçilen polimere bağlı bir floresan boyanın iki mililitre çözeltisini, SNARF-1-dekstran, hızlı karıştırma altında 0.6 mililitre bir molar kalsiyum klorür çözeltisi ve 0.6 mililitre bir molar sodyum karbonat çözeltisi ile karıştırın. Bu adımda, floresan boyayı çevreleyen gözenekli kalsiyum karbonat mikro çekirdekleri sentezlenir. Beş, 10 saniyelik çalkalamadan sonra, süspansiyonu iki mililitre mikrotüpe aktarın ve kalsiyum karbonat mikro çekirdeklerini peletlemek için 15 saniye santrifüjleyin.Süpernatanı atın, çekirdekleri yaklaşık iki mililitre deiyonize su ile yıkayın ve süspansiyonu sallayın. Santrifüjleme ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Mikro çekirdeklerin toplanmasını azaltmak için süspansiyonu ultrasonik bir banyoda bir dakika inkübe edin.Kalsiyum karbonat mikro çekirdeklerini, şablonlar üzerindeki ilk polimerik tabakayı biriktirmek için katyonik polimer PAH'ın mililitre başına dört mikrogramlık bir çözeltisinin yaklaşık iki mililitresinde yeniden süspanse edin. Mikro çekirdekleri sürekli çalkalayarak yaklaşık beş dakika pH çözeltisinde tutun. 15 saniye santrifüjlemeden sonra, süpernatanı bağlanmamış PAH ile atın ve mikro çekirdekleri çoklu santrifüjleme ve yıkama adımlarıyla üç kez suyla yıkayın.İkinci polimerik tabakayı şablonlar üzerinde biriktirmek için aynı prosedürü mililitre başına dört miligram anyonik polimer PSS ile tekrarlayın. Bir sonraki katmanı eklemeden hemen önce, ultrasonik banyoda bir dakikalık inkübasyon uygulanması tavsiye edilir. 12 katmanlı bir mikrokapsül kabuğu elde etmek için katyonik ve anyonik polimerlerin birikmesini altı kez sırayla tekrarlayın.Daha sonra, polietilen glikol aşılı poli-L-lizin içindeki kabukları olan mikro çekirdekleri en az iki saat inkübe edin. Ardından, kapalı mikro çekirdekleri sıralı santrifüjleme ve yeniden süspansiyon ile bir kez suyla yıkayın. Son olarak, içi boş mikrokapsüller elde etmek için kalsiyum karbonat şablonlarını, pH'ı yaklaşık 7.1'e ayarlanmış iki mililitre 0.1 molar EDTA çözeltisi içinde çözün.45 saniyelik santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve EDTA ile yıkamayı iki kez tekrarlayın. 45 saniyelik santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve iki mililitre salin ekleyin. Tuzlu su ile yıkama santrifüjleme adımlarını üç kez tekrarlayın.Hazırlanan mikrokapsüllerin boyutlarını, dağılımını ve konsantrasyonunu bir floresan mikroskobu altında bir hemositometrede araştırın. Parçacıkların boyut analizi için ImageJ veya eşdeğer bir yazılım kullanın. Elde edilen kapsüllenmiş probu karanlıkta saklayın.Optik sistemi hazırlamak için, uygulanan floresan boyanın özelliklerine göre gerekli floresan filtre setini floresan mikroskobuna yerleştirin ve floresan lambayı açın. Kolu göz merceklerine doğru çekin. Optik fiberi bir ucundan spektrometreye ve diğer ucundan bir kolimatöre bağlayın.Adaptörleri kullanarak, kolimatörü kamera tüpünün odağında veya floresan mikroskobun diğer mevcut bağlantı noktasında oynatın. Hazırlanan mikrokapsüllerin kalibrasyonu için, yaklaşık beş mikrolitre mikrokapsül süspansiyonunu bir mikroskop lamına yerleştirin ve damlayı karanlık bir yerde kurutun. Spektrometreyi açın.Spektrometre kontrol programını çalıştırın ve spektrometreyi ölçümler için hazırlayın. Mikrokapsüllenmiş SNARF-1'in spektral özelliklerini kalibre etmek için farklı pH'a sahip bir dizi tampon kullanın. SNARF-1 ile kurutulmuş mikrokapsüllerin üzerine yaklaşık 10 mikrolitre sodyum tamponu damlatın ve üzerini bir lamel ile kapatın.Mikroskop tablasına bir cam slayt yerleştirin. Yaklaşık 400 büyütme kullanarak mikrokapsülleri bulun. Mikroskop kolunu kamera bağlantı noktasına çevirin.Floresansı spektrometre ile kaydedin. Spektral sinyalin arka plan seviyesinin çok ötesinde olduğundan emin olun ve mikrokapsüllerin bir baloncuk içinde olmadığını gözlemleyin. SNARF-1 foto ağartmaya duyarlı olduğu için aynı mikrokapsüllerin uzun süre aydınlatılmasından kaçının.Kolu göz merceklerine geri çevirin. Protonlanmış ve protondan arındırılmış boyanın emisyon tepe noktalarına karşılık gelen dalga boyunda kapsüllenmiş SNARF-1'in floresan yoğunluğunun oranını hesaplayın. Ortamın pH'ına bağlı oranın bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.Ötenazi yapılmış balıklardan yaklaşık 10 mikrolitre kan toplayın. Bir mikroelektrot ile pH metre ile pH'ını belirleyin. Ardından, kurutulmuş mikrokapsüllerle slayta kan damlatın ve kalibrasyon tamponları için tarif edildiği gibi floresan yoğunluğunun oranını kaydedin.Kapsüllenmiş SNARF-1'in okunması üzerinde kan bileşenlerinin etkisini hesaba katmanız gerektiğinden, eğrinin balık kanındaki ölçümlerle eşleşmesini sağlamak için kalibrasyon eğrisinin doğrusal katsayısını ayarlayın. İğneyi enjeksiyona hazırlamak için, plastiği keskin bir neşterle çıkararak insülin şırıngasının ucundan çelik bir iğneyi serbest bırakın. İğneyi cam mikrokılcal damarın yarısına kadar sokun.Bir gaz meşalesi ile hızlı ve nazikçe lehimleyin. Cam mikrokılcal damarı mikroenjektöre bağlayın ve üç kez steril suyla yıkayın. Sıvının iğneden aktığından emin olun.Sistemi suyla doldurun. Sistemde kabarcık olmadığından emin olun. Deney gününde, mikrolitre başına yarım ila altı milyon mikrokapsül içeren steril salin içinde hazırlanan mikrokapsül süspansiyonunu alın.Ultrasonik banyo ile bir dakika boyunca tekrar askıya alın. Aşağıdaki enjeksiyon sırasında, mikrokapsülleri yeniden askıya almak ve toplanmalarını önlemek için şişeyi periyodik olarak çalkalayın. Bir kaşık kullanarak balığı anesteziden çıkarın ve sağ elini kullanıyorsanız sola, solaksanız sağa doğru baş bakacak şekilde yanal konumda nemli bir süngerin üzerine nazikçe yerleştirin.Enjeksiyondan hemen önce, mikroenjektör ile bağlı cam kılcal damara bir ila iki milimetre hava emdirin. Ardından, yaklaşık iki mikrolitre dağınık mikrokapsül ile yükleyin. Balığın vücudunu baskın olmayan elinizle sünger üzerinde nazikçe sabitleyin.Balık yanal çizgisini bulun. İğneyi, lateral çizginin abdominal segmentinin orta noktasının bir mililitre altına yerleştirin. Ardından, bir kazıma hareketi ile balık pulunu bir kenara getirin ve bir delme işlemi yapın.İğneyi masa yüzeyine 45 derecelik bir açıyla gövdeye yerleştirin. İğneyi, omurgaya dikkatlice dayanana kadar omurgaya doğru itin. Ardından, mikrokapsül süspansiyonunun yaklaşık bir mikrolitresini böbreğe yavaşça bırakın ve iğneyi yavaşça geri çekin.Enjeksiyon bölgesinde dökülen mikrokapsülleri çıkarmak için balığı baştan kuyruğa bir su akışı ile durulayın. Solungaç kapağını balık kafasından çıkarmak ve balık solungaçlarını kesmek için diseksiyon makası kullanın. Solungaçları suyla durulayın.Bir kaşık kullanarak, balığı bir mikroskop lamına aktarın ve bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirin. Aşağıdaki prosedürleri uygularken, balığın solungaçlarının kurumamasına dikkat edin. Bunu yapmak için, bir Pasteur pipeti kullanarak periyodik olarak suyla nemlendirin.Odayı karartın ve düşük büyütme kullanarak floresan mikrokapsüller bulmak için solungaçları inceleyin. Bulduğunuzda, lensi daha yüksek bir boyuta getirin ve görüş alanının merkezine yerleştirin. Kolu bağlı bir spektrometre ile bağlantı noktasına çevirin.Spektral sinyali kaydedin. Kolu göz merceklerine geri çevirin. Farklı mikrokapsüller için ölçümleri birkaç kez tekrarlayın.Balıkları geri kazanım için uygun havalandırma ile akvaryuma aktarın. Ölçüm prosedürü, tekrarlanan anestezi veya başka bir fiksasyon yöntemi kullanılarak bir kişi için birkaç kez tekrarlanabilir. Resim, kapsüllenmiş floresan boya SNARF-1 ile zebra balığı kanının ve hiperkapnisinin in vivo ölçümlerinin temsili bir örneğini göstermektedir.Kontrol koşullarında, mikrokapsüllerin enjeksiyonundan sonraki dört saat boyunca kan pH'ı sabit kalırken, yüksek karbondioksit altında beş dakika maruz kalmak balık kanının asitlenmesine neden olur. Prosedürü gerçekleştirirken, taşıma ve ameliyattan kaynaklanan hayvan stresini en aza indirmek önemlidir. Bazı pratiklerle, hem enjeksiyon hem de sinyal kaydı ortalama olarak yaklaşık iki, üç dakika sürer, bu nedenle bu protokol, balık hafif anesteziden uyanmadan önce manipülasyonların tamamlanmasına izin verir.İşlem sırasında balığın solungaçlarının daima nemli olduğundan emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, mikropartiküllerin küçük balıkların dolaşım sistemine basit ve etkili bir şekilde implantasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalısınız. Gösterildiği gibi, bu teknik, bir floresan prob ile doldurulmuş mikrokapsüller kullanılarak yetişkin zebra balıklarında kan pH'ının in vivo kayıtları için çok uygundur.

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon nasıl yapılacağını göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

2 gün sonrası fetilization (dpf) akut böbrek hasarı (AKI) ikna etmek için Zebra balığı larvaları aminoglikozid, gentamisin, microinjecting bir teknik açıklar. Ayrıca bütün montaj immünohistokimya için bir yöntem tarif, plastik gömme ve kesit AKI aracılı hasar görselleştirmek Zebra balığı larvalarının.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

Bu iletişim kuralı yoluyla renal pelvis transgene özellikle böbrek ifadede üretmek için fare böbrek içine plazmid DNA enjekte yöntemi açıklanır.

Hidrodinamik Renal Pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin Non-viral ifade

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Biz böbrek fizyolojisi 2 temel teknikleri birleştirerek farelerde, Bowman'ın idrar alanındaki bir micropipette yerleştirmek için 2-foton mikroskobu kullanımı mevcut. 2-foton mikroskobu kullanılması geleneksel mikroskopi micropuncture böbrek fizyolojisi çalışmaları için kritik sınırlamalar üstesinden gelir.

Micropuncture tarafından 2 foton mikroskobu kolaylaştırdı farelerde Bowman'ın alanı

Bu yöntem, Yetişkin zebrafisinin toraks içine 0.5 − 3 μL solüsyonun enjekte edilmesine dayanır. Prosedür verimli organ zarar vermeden zebra balığı kalbin yakınlığı içine protein ve kimyasal bileşikler sunar. Yaklaşım, kalp çeşitli dokularda eksojen faktörlerin etkilerini test etmek için uygundur.

Yetişkin zebrafish kalp çalışması için intratorasik enjeksiyon

Yetişkin zebra balıklarında yeni bir intraperitoneal (IP) enjeksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Doksorubisin gibi toksik bileşiklerle çalışırken, bu prosedür daha önce bildirilen iki IP yönteminden daha etkilidir. Teknik, zebra balığı modelinde sınırlı deneyime sahip araştırmacılar tarafından kolayca benimsenecek şekilde tasarlanmıştır.

Yetişkin Zebra Balıklarında Vücut Hasarını ve İlişkili Mortaliteyi En Aza İndiren Bir İntraperitoneal Enjeksiyon Tekniği

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

Keşfedin yetişkin Danio rerio dolaşım sistemine mikroparçacık enjeksiyonu ve solungaçlarda canlı görüntüleme tekniği. Bu yöntem, floresan prob kullanarak balık kan pH'ının tekrarlanan ölçümlerini mümkün kılar.

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

Daha fazla video keşfet