Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, mikropartiküllerin balık böbreğine enjeksiyon yoluyla yetişkin zebra balığının dolaşım sistemine sokulması için bir teknik göstermektir. Sokulan mikropartiküller, balık solungaçlarında basit bir intravital görüntüleme tekniği ile damar sisteminde daha da görselleştirilir. Bu prosedür, örneğin, pH için mikrokapsüllenmiş floresan probların eklenmesiyle in vivo olarak balık kanı pH'ının tekrarlanan ölçümlerini gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Bunu yapmak için, ilk aşamada, dekstran ile konjuge edilmiş pH'a duyarlı boya SNARF-1, katman katman yaklaşım kullanılarak yarı geçirgen polielektrolit kabuk içinde kapsüllenir. Floresan boya, gözenekli kalsiyum karbonat mikro çekirdeklerine birlikte çökeltilir ve çekirdekler, çok sayıda zıt yüklü biyolojik olarak parçalanamayan polimer tabakası ile kaplanır ve polietilen glikol içeren biyouyumlu bir polimer ile üst kaplanır. Daha sonra, kalsiyum karbonat çekirdekleri, SNARF-1'i çevreleyen bütün mikrokapsülleri elde etmek için çözülür.

Balık anestezisi ve fiksasyonunun ikinci aşamasında, hazırlanan mikrokapsüller, kapsüllenmiş boyayı balık dolaşım sistemine vermek için doğrudan hayvanın böbreğine enjekte edilir. Daha sonra, solungaç örtüsünü çıkarmak ve balık solungaçlarının kılcal damarlarını yok etmek için minimal ameliyat gerekir. Daha sonra, kandaki mikrokapsüllerin görselleştirilmesi ve floresan spektrumunun kaydedilmesi, kan pH'ını izlemek için intravital mikroskopi ile in vivo olarak yapılabilir.

Enjeksiyon doğru yapıldığında, işlemden hemen sonra balık solungaçlarında floresan mikrokapsülleri gözlemlemek mümkündür. Kapsüllenmiş probun floresan spektrumu, bir floresan mikroskoba bağlı bir spektrometre kullanılarak kaydedilebilir. SNARF-1'in iki emisyon tepe noktası vardır ve bu tepe noktalarına karşılık gelen iki dalga boyu arasındaki oran pH'ı ölçmek için kullanılabilir.

Önerilen prosedür, floresan mikrokapsüllerin balık dolaşım sistemine verilmesine ve balık kanındaki floresansın in vivo olarak uzaktan izlenmesine izin verir. Fizyolojik araştırma durumunda, bu yöntemin temel avantajı, genellikle gerçekleştirilmesi zor olan küçük laboratuvar hayvanlarında kan parametrelerinin tekrarlanan ölçümleridir. Işığa duyarlı bir floresan prob kullanılıyorsa, tüm prosedürün ışığı azaltılmış bir odada yapılması tavsiye edilir.

Seçilen polimere bağlı bir floresan boyanın iki mililitre çözeltisini, SNARF-1-dekstran, hızlı karıştırma altında 0.6 mililitre bir molar kalsiyum klorür çözeltisi ve 0.6 mililitre bir molar sodyum karbonat çözeltisi ile karıştırın. Bu adımda, floresan boyayı çevreleyen gözenekli kalsiyum karbonat mikro çekirdekleri sentezlenir. Beş, 10 saniyelik çalkalamadan sonra, süspansiyonu iki mililitre mikrotüpe aktarın ve kalsiyum karbonat mikro çekirdeklerini peletlemek için 15 saniye santrifüjleyin.

Süpernatanı atın, çekirdekleri yaklaşık iki mililitre deiyonize su ile yıkayın ve süspansiyonu sallayın. Santrifüjleme ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Mikro çekirdeklerin toplanmasını azaltmak için süspansiyonu ultrasonik bir banyoda bir dakika inkübe edin.

Kalsiyum karbonat mikro çekirdeklerini, şablonlar üzerindeki ilk polimerik tabakayı biriktirmek için katyonik polimer PAH'ın mililitre başına dört mikrogramlık bir çözeltisinin yaklaşık iki mililitresinde yeniden süspanse edin. Mikro çekirdekleri sürekli çalkalayarak yaklaşık beş dakika pH çözeltisinde tutun. 15 saniye santrifüjlemeden sonra, süpernatanı bağlanmamış PAH ile atın ve mikro çekirdekleri çoklu santrifüjleme ve yıkama adımlarıyla üç kez suyla yıkayın.

İkinci polimerik tabakayı şablonlar üzerinde biriktirmek için aynı prosedürü mililitre başına dört miligram anyonik polimer PSS ile tekrarlayın. Bir sonraki katmanı eklemeden hemen önce, ultrasonik banyoda bir dakikalık inkübasyon uygulanması tavsiye edilir. 12 katmanlı bir mikrokapsül kabuğu elde etmek için katyonik ve anyonik polimerlerin birikmesini altı kez sırayla tekrarlayın.

Daha sonra, polietilen glikol aşılı poli-L-lizin içindeki kabukları olan mikro çekirdekleri en az iki saat inkübe edin. Ardından, kapalı mikro çekirdekleri sıralı santrifüjleme ve yeniden süspansiyon ile bir kez suyla yıkayın. Son olarak, içi boş mikrokapsüller elde etmek için kalsiyum karbonat şablonlarını, pH'ı yaklaşık 7.1'e ayarlanmış iki mililitre 0.1 molar EDTA çözeltisi içinde çözün.

45 saniyelik santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve EDTA ile yıkamayı iki kez tekrarlayın. 45 saniyelik santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve iki mililitre salin ekleyin. Tuzlu su ile yıkama santrifüjleme adımlarını üç kez tekrarlayın.

Hazırlanan mikrokapsüllerin boyutlarını, dağılımını ve konsantrasyonunu bir floresan mikroskobu altında bir hemositometrede araştırın. Parçacıkların boyut analizi için ImageJ veya eşdeğer bir yazılım kullanın. Elde edilen kapsüllenmiş probu karanlıkta saklayın.

Optik sistemi hazırlamak için, uygulanan floresan boyanın özelliklerine göre gerekli floresan filtre setini floresan mikroskobuna yerleştirin ve floresan lambayı açın. Kolu göz merceklerine doğru çekin. Optik fiberi bir ucundan spektrometreye ve diğer ucundan bir kolimatöre bağlayın.

Adaptörleri kullanarak, kolimatörü kamera tüpünün odağında veya floresan mikroskobun diğer mevcut bağlantı noktasında oynatın. Hazırlanan mikrokapsüllerin kalibrasyonu için, yaklaşık beş mikrolitre mikrokapsül süspansiyonunu bir mikroskop lamına yerleştirin ve damlayı karanlık bir yerde kurutun. Spektrometreyi açın.

Spektrometre kontrol programını çalıştırın ve spektrometreyi ölçümler için hazırlayın. Mikrokapsüllenmiş SNARF-1'in spektral özelliklerini kalibre etmek için farklı pH'a sahip bir dizi tampon kullanın. SNARF-1 ile kurutulmuş mikrokapsüllerin üzerine yaklaşık 10 mikrolitre sodyum tamponu damlatın ve üzerini bir lamel ile kapatın.

Mikroskop tablasına bir cam slayt yerleştirin. Yaklaşık 400 büyütme kullanarak mikrokapsülleri bulun. Mikroskop kolunu kamera bağlantı noktasına çevirin.

Floresansı spektrometre ile kaydedin. Spektral sinyalin arka plan seviyesinin çok ötesinde olduğundan emin olun ve mikrokapsüllerin bir baloncuk içinde olmadığını gözlemleyin. SNARF-1 foto ağartmaya duyarlı olduğu için aynı mikrokapsüllerin uzun süre aydınlatılmasından kaçının.

Kolu göz merceklerine geri çevirin. Protonlanmış ve protondan arındırılmış boyanın emisyon tepe noktalarına karşılık gelen dalga boyunda kapsüllenmiş SNARF-1'in floresan yoğunluğunun oranını hesaplayın. Ortamın pH'ına bağlı oranın bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.

Ötenazi yapılmış balıklardan yaklaşık 10 mikrolitre kan toplayın. Bir mikroelektrot ile pH metre ile pH'ını belirleyin. Ardından, kurutulmuş mikrokapsüllerle slayta kan damlatın ve kalibrasyon tamponları için tarif edildiği gibi floresan yoğunluğunun oranını kaydedin.

Kapsüllenmiş SNARF-1'in okunması üzerinde kan bileşenlerinin etkisini hesaba katmanız gerektiğinden, eğrinin balık kanındaki ölçümlerle eşleşmesini sağlamak için kalibrasyon eğrisinin doğrusal katsayısını ayarlayın. İğneyi enjeksiyona hazırlamak için, plastiği keskin bir neşterle çıkararak insülin şırıngasının ucundan çelik bir iğneyi serbest bırakın. İğneyi cam mikrokılcal damarın yarısına kadar sokun.

Bir gaz meşalesi ile hızlı ve nazikçe lehimleyin. Cam mikrokılcal damarı mikroenjektöre bağlayın ve üç kez steril suyla yıkayın. Sıvının iğneden aktığından emin olun.

Sistemi suyla doldurun. Sistemde kabarcık olmadığından emin olun. Deney gününde, mikrolitre başına yarım ila altı milyon mikrokapsül içeren steril salin içinde hazırlanan mikrokapsül süspansiyonunu alın.

Ultrasonik banyo ile bir dakika boyunca tekrar askıya alın. Aşağıdaki enjeksiyon sırasında, mikrokapsülleri yeniden askıya almak ve toplanmalarını önlemek için şişeyi periyodik olarak çalkalayın. Bir kaşık kullanarak balığı anesteziden çıkarın ve sağ elini kullanıyorsanız sola, solaksanız sağa doğru baş bakacak şekilde yanal konumda nemli bir süngerin üzerine nazikçe yerleştirin.

Enjeksiyondan hemen önce, mikroenjektör ile bağlı cam kılcal damara bir ila iki milimetre hava emdirin. Ardından, yaklaşık iki mikrolitre dağınık mikrokapsül ile yükleyin. Balığın vücudunu baskın olmayan elinizle sünger üzerinde nazikçe sabitleyin.

Balık yanal çizgisini bulun. İğneyi, lateral çizginin abdominal segmentinin orta noktasının bir mililitre altına yerleştirin. Ardından, bir kazıma hareketi ile balık pulunu bir kenara getirin ve bir delme işlemi yapın.

İğneyi masa yüzeyine 45 derecelik bir açıyla gövdeye yerleştirin. İğneyi, omurgaya dikkatlice dayanana kadar omurgaya doğru itin. Ardından, mikrokapsül süspansiyonunun yaklaşık bir mikrolitresini böbreğe yavaşça bırakın ve iğneyi yavaşça geri çekin.

Enjeksiyon bölgesinde dökülen mikrokapsülleri çıkarmak için balığı baştan kuyruğa bir su akışı ile durulayın. Solungaç kapağını balık kafasından çıkarmak ve balık solungaçlarını kesmek için diseksiyon makası kullanın. Solungaçları suyla durulayın.

Bir kaşık kullanarak, balığı bir mikroskop lamına aktarın ve bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirin. Aşağıdaki prosedürleri uygularken, balığın solungaçlarının kurumamasına dikkat edin. Bunu yapmak için, bir Pasteur pipeti kullanarak periyodik olarak suyla nemlendirin.

Odayı karartın ve düşük büyütme kullanarak floresan mikrokapsüller bulmak için solungaçları inceleyin. Bulduğunuzda, lensi daha yüksek bir boyuta getirin ve görüş alanının merkezine yerleştirin. Kolu bağlı bir spektrometre ile bağlantı noktasına çevirin.

Spektral sinyali kaydedin. Kolu göz merceklerine geri çevirin. Farklı mikrokapsüller için ölçümleri birkaç kez tekrarlayın.

Balıkları geri kazanım için uygun havalandırma ile akvaryuma aktarın. Ölçüm prosedürü, tekrarlanan anestezi veya başka bir fiksasyon yöntemi kullanılarak bir kişi için birkaç kez tekrarlanabilir. Resim, kapsüllenmiş floresan boya SNARF-1 ile zebra balığı kanının ve hiperkapnisinin in vivo ölçümlerinin temsili bir örneğini göstermektedir.

Kontrol koşullarında, mikrokapsüllerin enjeksiyonundan sonraki dört saat boyunca kan pH'ı sabit kalırken, yüksek karbondioksit altında beş dakika maruz kalmak balık kanının asitlenmesine neden olur. Prosedürü gerçekleştirirken, taşıma ve ameliyattan kaynaklanan hayvan stresini en aza indirmek önemlidir. Bazı pratiklerle, hem enjeksiyon hem de sinyal kaydı ortalama olarak yaklaşık iki, üç dakika sürer, bu nedenle bu protokol, balık hafif anesteziden uyanmadan önce manipülasyonların tamamlanmasına izin verir.

İşlem sırasında balığın solungaçlarının daima nemli olduğundan emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, mikropartiküllerin küçük balıkların dolaşım sistemine basit ve etkili bir şekilde implantasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalısınız. Gösterildiği gibi, bu teknik, bir floresan prob ile doldurulmuş mikrokapsüller kullanılarak yetişkin zebra balıklarında kan pH'ının in vivo kayıtları için çok uygundur.