Name: Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, mikroenjeksiyon ve görüntüleme için zebra balığı larvalarını mikro yapılı cihazlarda sabitleme yöntemini. Bu teknik, enfeksiyon ve ksenogreft kanser modellerinde yüksek verimli uygulamalar için dokulara erişimi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar David Langenau cömertçe akvaryum yer verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum; Eric Stone, John C. Moore ve Qin Tang için Zebra balığı bakım ve reaktifler ve Anne Robertson ve Elliott Hagedorn burada kullanılan Zebra balığı zorlanma tedarik için Leonard Zon'ın Laboratuarı'ndan yardım. Onlar da Octavio Hurtado photolithographic teknikleri tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. FE Shriner'ın hastaneden Arkadaş grupları tarafından çocuk ve Amerikan Avustralya Derneği için finanse edildi. Bu eser NIH tarafından finanse edildi GM92804 verin.

Larva mikroenjeksiyon Protokolü 2011N000127 altında Massachusetts genel hastane alt Komisyonu araştırma hayvan bakım tarafından kabul edildi.
1. cihaz imalat
Not: Burada açıklanan fotolitografi maskeleri tasarlamak için kullanılan tüm bilgisayar destekli çizim (CAD) dosyaları (şekil 1) elde edilebilir için download. Malzemeler tablo bağlantıları için bkz.
<ol><li>Bir sınıf 1.000 temiz oda standart photolithographic teknikleri7kullanarak ana kalıp gofret imal. Mikroyapı diziler ve kanallar için üreticinin yönergelerine göre sıralı olarak 3 ayrı maskeleri kullanarak 3 kat epoksi esaslı negatif fotorezist desen: 100 µm sığ özellikleri için orta özellikler için 200 µm ve 400 µm derin özellikleri. Görüntü aygıtı için sığ ve derin özellikleri için 600 µm 400 µm kullanarak desen iki katmanlı.</li>
	<li>Tamamlanan gofret 15 cm Petri kabına (Şekil 2) döküm için tabanına kaydet.</li>
</ol>2. Microstructured yüzey diziler - PDMS hazırlanması
<ol><li>Kullanılabilir aygıtlar açmak için ana gofret bir kalıp olarak kullanarak polydimethylsiloxane (PDMS), atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı 5 g ile birleştirin ve plastik bir çatalla yemek ağırlığında bir plastik iyice karıştırın.</li>
	<li>Karışımı dikkatle kalıp dökün.</li>
	<li>Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.</li>
	<li>PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.</li>
	<li>Dikkatle cihazın bir neşter bisturi ucu ve gofret yüzey arasındaki temas korumak emin olmak istedim, kullanarak ana gofret kesti. Forseps kullanarak, gofret ve temiz bir 10 cm Petri dish, (şekil 3) özelliği tarafa aktarmak uzak PDMS yineleme kabuğu.</li>
	<li>Cihazın 35 için bir plazma fırın kullanarak oksijen plazma ile tedavi hydrophobicity azaltmak için s.</li>
	<li>168 mg/L etil 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5) içeren Zebra balığı embriyo ile orta (E3) kapsar. Herhangi bir kabarcıklar akan tarafından daha derin özelliklerinden bir transfer pipet kullanarak aygıt yüzey üzerinde su kaldır.</li>
</ol>3. Microstructured yüzey diziler - özel hazırlanması
<ol><li>Bir negatif PDMS kalıp yapmak, oksijen plazma PDMS cihazla tedavi.</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane buharı8inert bir yüzey oluşturmak için PDMS cihazla tedavi. Kısaca:
	<ol>
<li>Bir duman başlık içinde bir vakum odasında özelliği-yan-up tedavi olmak için PDMS yerleştirin.</li>
		<li>PDMS yanındaki küçük bir açık cam veya alüminyum çanak yerleştirin ve dikkatle PFDTS 200 µL pipet (%98 silane) çanak içine. Dikkat: PFDTS silane son derece kırılgandır, şiddetle su ile reaksiyona girer, yanıcı ve kişinin üzerine şiddetli deri ve göz hasara neden olur. Okuma MSDS ayrıntılı kullanmadan önce.</li>
		<li>Vakum odası kapatır ve vakum 15-30 dakika, ya da PFDTS silane tamamen buharlaşıp kadar uygular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cihazın bir Petri ve 2.1 2.3 adımda anlatıldığı gibi hazırlanan taze PDMS için bir kalıp olarak kullanın.</li>
	<li>En az 3 h için 65 ° C'de pişirin sonra tedavi aygıttan taze PDMS tüm katmanın soyma ve taze kabında yerleştirin. Bu o zaman olumsuz bir kalıp olarak özel oyuncular için kullanılabilir.</li>
	<li>Özel hazırlamak için özel tamamen eriyene kadar düşük jelleşme sıcaklık özel E3 içinde mikrodalga bir de %2 çözümünün kaynatın.</li>
	<li>Sıcak özel PDMS negatif kalıp dökün ve aygıt üzerinde bir aktarma pipet ile özellikleri tarafından akan sıcak özel kapsayan özel herhangi bir kabarcıklar kaldırmak.</li>
	<li>Kabarcıklar kaldırılır sonra 4 ° C özel ayarlamak için buzdolabında bekletin.</li>
	<li>El ile üzerinden PDMS altında bozulmayı tarafından olumsuz PDMS kalıp özel blok kaldırmak için bir yeni Petri kabına ve MS-222 içeren ıslak E3 ile özel blok aktarmak.</li>
</ol>4. görüntü aygıtları PDMS hazırlanması
<ol><li>Kullanılabilir aygıtlar açmak için PDMS ana gofret bir kalıp olarak kullanarak, atıldı. 50 g PDMS monomer başlatıcı (2.1 adımda kullanılan ile aynı) ve karışımı iyice bir plastik plastik Çatalla yemek ağırlığında 5 g ile birleştirir.</li>
	<li>Karışımı dikkatle kalıp dökün.</li>
	<li>Degas, 16-25 inHg (54-85 kPa) 1 h için bir vakum desiccator içinde.</li>
	<li>PDMS iyileştirmek için en az 3 h için 65 ° C'de pişirin. PDMS için sert ama esnek sağlam bir tedavi.</li>
	<li>Aygıtların Master gofret kesme ve 1.5 mm yumruk kullanarak bağlantı noktaları yumruk.</li>
	<li>Tedavi de aygıtlar ve bir 6-şey cam-alt plaka ile oksijen plazma için 35 s, 2.6. adımda açıklandığı gibi.</li>
	<li>Bir aygıt özelliği yan-aşağı her cam coverslip 6-şey plaka için 10 dk 85 ° C ocağın üzerine yerleştirerek bond. Not: başarılı bağ onaylamak için gümrüklü aygıtı forseps kullanarak bir yana firma basınç uygulayın. Cihazın cam coverslip bağlı kalmalıdır.</li>
</ol>5. Zebra balığı kültür
<ol><li>Kültür Zebra balığı embriyolar için 2 dpf standart teknikleri3kullanarak.</li>
	<li>Dechorionate embriyo forseps veya 1 mg/mL proteaz kullanarak (bkz: malzemeler tablo)3 yükleme üzerine cihaz, onları düzeltmek izin vermek için önce en az 30-60 dakika karıştırın.</li>
	<li>E3 (168 mg/1 mL 25 X ekleyerek M) MS-222 (pH 7.5) hisse senedi çözüm kendi kabında kullanarak embriyo uyuşturan.</li>
</ol>6. yönünü Microstructured yüzeyde - Divot diziler Zebra balığı
<ol><li>Öyle ki bu embriyoların daha kolay manipülasyon sağlar E3 ince (1-2 mm) tabakası ile kaplıdır, Petri kabına 2.7 (şekil 3A) adımda PDMS bloğundan hazırlayın.</li>
	<li>Embriyo (genellikle koşul başına 10-20) gerekli sayıda transfer pipet kullanarak PDMS blok yüzey aktarın.</li>
	<li>Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyo microstructured efendim (şekil 3A) itin. Efendim kullanımı dorsal ve ventral yönler için özellikle uygundur. Not: Efendim ile sıkı bir için (dorsal ve ventral) uygun, blok paralel olarak divot yüzeyinde embriyo konumlandırma ve sonra onları bir saç döngüsü kullanarak pozisyona haddeleme deneyin. Divot daha derin iterek onları istikrarlı tutmaya yardımcı olacaktır.</li>
</ol>7. yönünü Microstructured yüzeyde - Zebra balığı Microstructured kanalları
<ol><li>E3 E3 düzeyi sokağın kenarına düşüyor ama rezervuar ve kanalları ve PDMS üzerinde ince bir tabaka hala mevcuttur kadar transfer pipet kullanarak microstructured kanalları (şekil 3B) desenli PDMS bloktan çizin.</li>
	<li>10 embriyo 5.3 adımından kenar taşması değil dikkatli olmak bir transfer pipet kullanarak rezervuar aktarın.</li>
	<li>Saç döngüsü kullanarak, uygun kanalının girişinde huni içine her embriyo işlemek ve embriyo başkanı doğru kanal ve kanal girerken embriyonun uygun yönlendirmeyi vardır öyle ki yönlendirmek.</li>
	<li>Her embriyo yerde tutmak için yardımcı kanal duvarlarında hikayedir microfeatures ulaşıncaya kadar bir saç döngüsü kullanarak kanal aşağı kaydırın. Microstructured kanalları kullanılması özellikle yanal yönlendirme için tavsiye edilir. Not: mikroenjeksiyon sırasında kayma embriyo azaltmak için rezervuar E3 çizerek yüzey gerilimi miktarını ayarlamayı deneyin.</li>
</ol>8. mikroenjeksiyon Zebra balığı
<ol><li>
Mikroenjeksiyon iğne hazırlayın.
	<ol>
<li>Micropipette çektirme yukarıda açıklanan4kullanan borosilikat cam microcapillary iğne yapmak. Elde edilen iğneler yaklaşık 10 mm Konik uzunluğu ile bir ucunda bir noktaya konik.</li>
		<li>Bu durumda 100 nM chemoattractant enjekte edilir çözüm hazırlamak (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanin (fMLP) veya Leukotriene B4 (LTB4)) ve 100 70 kDa rodamine dextran izleyici PBS nM.</li>
		<li>Çözüm 5 µL ince konik bir pipet kullanarak iğne yük ipucu (malzeme tabloya bakın).</li>
		<li>İğne manyetik bir stand üzerine monte ve bir picopump microinjector bağlı bir micromanipulator içine monte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>45 ° açıyla iğne ucu konik ucunu Forseps ile pinching tarafından kır.</li>
	<li>Enjeksiyon bolus boyutu 1 ayarlaması nL picopump denetleyicisi enjeksiyon zamanında ayarlayarak.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon iğne açısını ayarlayın. Bir iğne 45 °'in Embriyolardan denetleyicisinde genellikle embriyo uzunluğu paralel iğne ile iyi bir başlangıç noktası açısıdır. Bir dik açı embriyo yanal hareketi mikroenjeksiyon sırasında en aza indirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>İğneyi yakın Petri kabına sol el ile ve hakkı olan iğne micromanipulator kontrol, mikroenjeksiyon, bu durumda ve vezikül hedef siteye mümkün olduğunca getir. Not: Ve vezikül dikdörtgen organ iki küçük ayrı karanlık dikdörtgen yapı (otoliths) içeren göz posterior olarak tespit edilebilir.</li>
	<li>Embriyolardan denetleyicisi kullanarak, iğne ucu vezikül içinde öyle ki (Bu durumda ve vezikül) hedef doku nüfuz ve picopump ayak pedalı anahtarı kullanarak önceden oluşturulmuş hacim enjekte. Not: doku penetrasyonu direnir, Embriyolardan denetleyicisi topuzu hafifçe dokunarak deneyin.</li>
	<li>Embriyo serbest bırakmak için bir transfer pipet kullanarak yukarıdan aşağıya doğru veya öyle ki embriyo çevreleyen E3 yayımlanan çanak dönen yüzey üzerinde E3 akışı.</li>
	<li>Embriyo transferi pipet kullanarak MS-222 E3 kurtarma yemek için aktarın.</li>
</ol>9. embriyo görüntüleme cihazı PDMS kullanarak tarama
<ol><li>Adım 4.7, akan E3 (+ MS-222) aygıttan bağlantı noktası üzerinden Başbakan. Bu yapılabilir bir 1000 µL pipet ya da dar uçlu transfer pipet kullanarak.</li>
	<li>Cihazın kaplı kadar iyi E3 + MS-222 ile doldurun.</li>
	<li>4 enjekte embriyo transferi pipet de her kullanarak adım 8.7 sunmak. Embriyo (Adım 5.3) yükleme öncesinde 1-2 min için E3 + MS-222 kuluçka tarafından istenirse önceden imzalat olabilir.</li>
	<li>Embriyolardan aracını kullanarak (saç döngüsü veya benzer), embriyoların istenen yönde (kuyruk-ilk veya kafa ilk, kullanılan aygıt bağlı olarak) görüntüleme kanal girişlerinde yönlendirmek ve bunları kısmen cihazın (şekil 4A) içine itin. Bu cihazın içine eşit çizerken yardımcı olacaktır.</li>
	<li>E3 embriyo kanalları (şekil 4B) görüntüleme için doğru yönde içine çizilmiş kadar 1.000 µL pipet veya transfer pipet kullanarak bağlantı noktası aygıtı aracılığıyla çizmek. Not: embriyo yakalama noktası geçmiş değil emmek için dikkatli olun, bu embriyolar zarar ve yönelimleri alter.</li>
	<li>İyi-plaka (şekil 4 c) görüntüleme için mikroskop aktarın.</li>
	<li>
Ters bir floresan mikroskop kullanarak görüntü.
	<ol>
<li>Büyütme uygun lens seçerek ayarlayın. 10 X genellikle Zebra balığı nötrofil geçiş görüntüleme için yararlı bir büyütme'dur.</li>
		<li>NET, ama değil doymuş her sinyal ışık kaynağı yoğunluğu ve pozlama süresi her kanal için ayarlanır.</li>
		<li>Esir alma imge her kanal için. Burada, biz yeşil flüoresan protein kullanılır (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas kırmızı (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) ve kanalları aktarılır. Çok kanallı görüntüler sonrası işleme sırasında kombine edilebilir (şekil 4B-ı).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon. (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li>
<li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+%28ZEBRA%29+device%3A+a+low-cost%2C+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924424712000581">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li>
<li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li>
<li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhagoSight%3A+an+open-source+MATLAB%C2%AE+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636(2013).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016943321201094X">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li>
<li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li>
<li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish-on-a-chip%3A+microfluidics+for+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li>
<li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li>
<li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+on+a+chip%3A+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792(2014).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping%2C+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630(2012).</li>
<li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400512012154">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li>
<li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Burada, nasıl kullanılacağını açıklar biz son zamanlarda 2 dpf Zebra balığı mikroenjeksiyon5kolaylaştırmak ve basit özel ücretsiz montaj aygıt için uygun görüntüleme embriyo tanıtmak için geliştirdiler. Bu araçlar imalat Zebra balığı teknikleri için yararlı aygıt için photolithographic teknikleri yardımcı programı vurgulayın.
MSA aygıtları özellikle yararlı için hücreleri veya parçacıklar enjeksiyon eğilimli toplama mikroenjeksiyon iğne mantar conidia veya teslimi için ...

Zebra balığı biyolojinin temel gelişimsel büyük ölçekli için genetik çalışmalar birçok alanları için güçlü bir model olarak ortaya çıktı ve1,2kimyasal ekranlarında. Basit, kolay kullanımı, geliştirilmesi için ticari olarak açmıştır tek hücreli zigot içine genetik materyal mikroenjeksiyon gen overexpression, nakavt, CRISPR/Cas9 mutagenesis ve transgenesis gibi rutin genetik manipülasyon itimat Yönlendirme ve yumurta enjeksiyon3için sabitleme için araçlar. Nakli ve enfeksiyon, gibi diğer yaklaşımlar genellikle mikroenjeksiyon sonraki sahne embriyo ve daha büyük ölçüm kapiller iğneler4kullanarak larva gerektirir. Ancak, hedef doku iterek veya embriyo haddeleme olmadan nüfuz daha zor olduğu gibi daha büyük gauge iğne kullanımı önemli teknik sorunlar, sunar. Bu koşullar altında işlem sırasında kurutma kaçınmak zor olsa embriyo stabilize etmek için gereken uygun su gerginlik ve embriyo elde etmek hedef doku içine enjeksiyon için ideal odaklı olabilir.
Mikroenjeksiyon, enjekte embriyo başarıyla enjekte seçin ve başlangıç zaman noktası görüntülerini yakalamak için ekran yararlıdır. Bu sorunları ele almak üzere, çeşitli yönleriyle mikroenjeksiyon5için hem hızlı görüntü tabanlı tarama sonrası enjeksiyon için 2 dpf embriyo dengelemeye yardımcı microstructured cihazları bir dizi geliştirdi.
Bu cihazlar içinde yeterli yapısal kararlılık elde etmek için photolithographic teknikleri kullanılmıştır. Mikroelektronik sanayi ve daha yakın zamanda yaygınlaştırılması mikrosıvısal imalat için yaygın olarak kullanılan, bu yaklaşımlardan 1-1000 µm, Zebra balığı embriyo ve larva manipülasyon için uygun bir ölçek uzanan dikey yapıları elde edebilirsiniz. Tüm aygıtlar kullanarak ucuz, fiziksel olarak sağlam, biyolojik olarak inert ve şeffaf olan polydimethylsiloxane (PDMS), fabrikasyon.
Microstructured yüzey diziler (MSAs) PDMS taşları desenli bir üst yüzeyi olarak biçimlendirilmiş, benzer şekilde özel bloklar halinde basit kanalları daha yaygın olarak kullanılan yumurta mikroenjeksiyon için. Sonrası enjeksiyon tarama için 6 görüntüleme aygıtları bir standart cam popolu 6-şey tabak içinde dizilmiş. Bu cihazlar embriyo kolay yükleme için tasarlanmış, kaldırma yordamı uygun görüntü tabanlı kurtarma kolaylaştırmak belirli embriyo izin verirken bu aygıtları daha daha kullanıcı dostu bir şekilde yaklaşımlar eleme daha önce tarafından geliştirilen Beebe laboratuvar6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polidimetilsiloksan (PDMS)</td> <td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG</td><td>Cihazları dökmek için. Kit, PDMS monomer ve Başlatıcı içerir</td></tr><tr><td>Düşük jelleşme sıcaklığı agaroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Agaroz cihazlarının dökümü için</td></tr><tr><td>PFDTS silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>Negatif PDMS kalıplarının dökümü için</td></tr><tr><td>Trikain (MS-222)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Zebra balığını uyuşturmak için</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70.000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>Mikroenjeksiyonları izlemek için</td></tr><tr><td>Lökotrien B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Nötrofil kemoatraktan</td></tr><tr><td>N-Formilmetiyonin-lösil-fenilalanin (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Nötrofil kemoatraktan</td></tr><tr><td>15 cm Petri kabı</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>Ana gofretten Döküm için</td></tr><tr><td>Cam tabanlı 6 oyuklu plakalar</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>Görüntüleme cihazları için</td></tr><tr><td>Borosilikat cam mikrokılcal damarlar</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>Mikroenjeksiyon iğneleri için</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>Zebra balığı embriyolarını aktarmak için</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>Mikroenjeksiyon iğnelerini yüklemek için</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1,5 mm zımba</td><td>Ted Pella A.Ş.</td><td>15111-15</td><td>PDMS görüntüleme cihazlarında bağlantı noktalarını delmek için</td></tr><tr><td>No. 11 Neşter</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10011-00</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>Dumont'u kesmek için No. 5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-10</td><td>Embriyoları dekoryonlamak ve mikroenjeksiyon iğne uçlarını kırmak için</td></tr><tr><td>Marzhauser Mikromanipülatör</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>Mikroenjeksiyon iğnesini manipüle etmek için</td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>Mikromanipülatörü</td></tr><tr><td>MPPI-3 monte etmek için Picopump kontrol cihazı</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>Mikroenjeksiyon hacmini ve zamanlamasını kontrol etmek için</td></tr><tr><td>EVOS ters floresan mikroskobu</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>Enjekte edilen embriyoları görüntülemek için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Mikroinjecion AutoCAD</td></tr><tr><td>yazılımı Autodesk</td> için <td></td><td></td><td>AutoCAD dosyalarını şuradan indirin: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 ve ZFIN topluluk protokolleri wiki sayfasından: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve zebra balığı larva görüntüleme

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebra balığı ortaya çıkmıştır geniş çeşitli insan hastalıkları ve deneysel çalışmalar, artan bir dizi için yararlı bir araç güçlü bir model olarak büyük ölçekli kimyasal ve genetik ekranlar aracılığıyla temel gelişim biyolojisi kapsayan. Ancak, birçok deney, özellikle enfeksiyon ve xenograft modelleri, ilgili mikroenjeksiyon ve görüntüleme embriyo ve beceri ve uzmanlık gerektiren zahmetli tekniklerdir larva güveniyor. Hassas ve geçerli mikroenjeksiyon teknikleri-den geçerek artırmak için biz bir dizi yönlendirmek ve 2 gün sonrası döllenme (dpf), Zebra balığı embriyolar dengelemek için microstructured aygıtları önce menfez, dorsal veya yanal yönde geliştirdi yordam. Embriyo görüntülemede yardım için de paralel bir cam kapak notu karşı yanal olarak 4 Zebra balığı şark kanalları ile basit bir aygıt tasarlanmış. Birlikte, burada mevcut araçları Zebra balığı teknikleri optimizasyonu için yararlı aygıt oluşturmak için photolithographic yaklaşımlar etkinliğini göstermektedir.

Burada açıklanan yaklaşım geliştirme (şekil 1) ve photolithographic (Şekil 2) ve yumuşak tekniğinde (şekil 3) teknikleri kullanarak 2 dpf Zebra balığı ile kullanılacak cihazların üretim gösteriyor. Bu yöntem birçok tasarım yineleme ve değişiklikler hızlı test sağlar ve değişiklikler ve Mikroyapı boyutları diğer gelişim aşamasında Zebra balığı ile kullanılacak duruma getirilmesi onların uygulama uzata...

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Bu metodolojinin genel amacı, zerbrafish larvalarının mikroenjeksiyonunu daha kolay ve daha doğru hale getirmektir. Bu yöntem, zebra balığı model sistemlerini kullanan araştırmacıların, zebra balığı larvalarını büyük diziler halinde belirli yönelimlerde hareketsiz hale getirmelerine yardımcı olur. Teknik, mikroenjeksiyon ve görüntüleme için belirli dokulara daha kolay erişim sağlar ve enfeksiyon veya ksenogreft kanseri modelleri gibi uygulamalar için çok sayıda larva gerektiğinde çok etkilidir.Zebra balığı modellerindeki üretim stratejilerim son derece tamamlayıcıdır. Biri insan yapımı ve basit. Diğeri canlı ve karmaşıktır.Her ikisi de aynı boyut ölçeğini paylaşır. İkisi de şeffaftır. Ve her ikisi de tek hücre çözünürlüğünde gözlemleri mümkün kılar.Burada gösterdiğiniz gibi, kolayca birleştirilebilirler ve hemen hemen her büyük hastalığın incelenmesi için uygulamaları olabilir. Metin protokolüne göre ince bir E-3 filmi ile kaplı bir Petri kabında bir PDMS bloğu hazırladıktan sonra, gerekli sayıda embriyoyu PDMS bloğunun yüzeyine aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. Bir saç halkası veya benzeri bir alet kullanarak, embriyoları, özellikle dorsal ve ventral yönelimler için mikr

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Bu yazıda, morfolino antisens oligonükleotidler kullanılarak yetişkin zebrabalıkları telencephalon ventriküler hücrelerde gen ifadesinin manipülasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz, yetişkin omurgalı beynin fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir hızlı ve verimli protokolü olarak bu yöntem sunuyoruz.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve büyüme ve görüntüleme için tuzak aygıt), şark ve Zebra balığı larva dizginlemek için tasarlanmış bir compartmentalized alet olduğu. Tasarım kuyruk transeksiyon ve yara iyileşmesi ve rejenerasyon yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi görüntüleri uzun vadeli koleksiyonu izin verir.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Polietilen tereftalat (PET) laminasyonu kullanarak mikroakışkan cihazlar üretmek için yenilikçi bir yöntem, birden fazla canlı zebra balığı embriyosunu yakalamanın ve görüntülemenin maliyetini ve karmaşıklığını önemli ölçüde azaltır.

Çoğullanmış Zebra Balığı Görüntüleme için Düşük Maliyetli Polietilen Tereftalat Laminasyon Mikroakışkan Tasarımları

Öğrenin, mikroenjeksiyon ve görüntüleme için zebra balığı larvalarını mikro yapılı cihazlarda sabitleme yöntemini. Bu teknik, enfeksiyon ve ksenogreft kanser modellerinde yüksek verimli uygulamalar için dokulara erişimi kolaylaştırır.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Daha fazla video keşfet