Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem
May 31st, 2018
Burada mevcut ve bitki dokularında decellularize için kullanılan kontrast iki protokolleri: deterjan temelli bir yaklaşım ve deterjan-Alerjik bir yaklaşım. Her iki yöntem sonra doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanılabilir hücre dışı matriks kullanılan, bitki dokuların geride.
Bu yöntemler, mükemmel sıvı transfer yeteneklerine sahip, sofistike ultra yapılara ve ölçeklenebilir üretime sahip bir iskelenin geliştirilmesi gibi biyomalzemeler alanındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, özel ekipmana ihtiyaç duymadan kök dokuları için çoğu bitkiye uygulanabilmeleridir. İlk olarak, F.hispida yapraklarının taze veya donmuş örneklerini toplayın.
Kalan taze numuneyi ileride kullanmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. Yaprağın 20 ila 25 santigrat derecede deiyonize suya batırılmış halde kalmasına izin verin. Yaprağı sekiz milimetre çapında diskler halinde kesmek için temiz bir biyopsi zımbası kullanın.
Daha sonra, yaprak örneklerini yıkamak için, deiyonize suya batırılmış olarak beş ila 10 dakika boyunca düşük hızda bir çalkalama plakası üzerinde inkübe edin. Daha sonra deiyonize suda hacimce %10 SDS hazırlayın. SDS çözeltisini hazırladıktan sonra, yaprak örneklerini plastik bir tabağa yerleştirin.
Ardından, numuneleri tamamen kaplayacak şekilde SDS solüsyonunu ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için SDS daldırılmış yaprak numunelerini üstü kapalı olarak bir sallama plakasına yerleştirin. Daha sonra yaprak örneğini oda sıcaklığında beş gün inkübe edin.
Beş günlük inkübasyondan sonra, SDS çözeltisini deiyonize su ile değiştirin. Deiyonize suya batırılmış numuneleri bir sallama plakası üzerinde 10 ila 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, beş mililitre iyonik olmayan yüzey aktif maddeyi 50 mililitre çamaşır suyu ile karıştırın.
Bu karışımı 445 mililitre deiyonize suya ekleyin. Daha sonra numuneleri taze hazırlanmış iyonik olmayan yüzey aktif madde ağartıcı çözeltisine batırın. Numuneler temizlenene kadar iyonik olmayan yüzey aktif madde ağartıcı çözeltisini her 24 saatte bir değiştirmeye devam edin.
Daha sonra temizlenmiş numuneleri deiyonize suya batırılmış halde iki dakika boyunca bir sallama plakasında bırakın. Deterjan içermeyen hücre giderme için, hacimce %3 sodyum bikarbonat çözeltisinde hacimce yüzde beş hacimce ağartıcı hazırlayın. Ardından, çözeltiyi çeker ocak içindeki sıcak bir plaka üzerinde 60 ila 70 santigrat dereceye ısıtın.
Çözelti istenen sıcaklığa ulaşır ulaşmaz yaprak örneklerini ıslatın. Ardından, numunelere zarar vermemek için karıştırma plakasının hızını azaltın ve gözle görülür şekilde temizlenmiş numuneleri arayın ve bunları banyodan dikkatlice aktarın. Son olarak, numuneleri deiyonize suda bir ila iki dakika inkübe edin.
Tüm numuneler özünde farklı olduğundan, numunelerin zarar görmediğinden emin olmak için hücre çözmenin ilerlemesini yaklaşık 15 dakikada bir kontrol etmeniz önerilir. MTM, SAF ve UTS parametreleri ilk olarak hem P.aquatica hem de F.hispida türlerinin benzersiz hücreden arındırılmış iskele özelliklerini araştırmak için incelenmiştir. Aslında, her üç parametre de hem deterjan bazlı hem de deterjan içermeyen hücre giderme yöntemleri kullanılarak benzer mekanik özellikler göstermektedir.
Bununla birlikte, F.hispida'nın UTS mekanik özelliği, hücreden arındırma için ağartıcı yerine SDS kullanıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir ortalama değer gösterir. İncelenen temizlenmiş bitki türlerinin genomik DNA içeriği, hücreden arındırılmamış örneklerle karşılaştırıldığında, hücreden arındırma üzerine önemli ölçüde azalır. Daha sonra, insan dermal tiroblastlarının metabolik aktivitesi, hücreden arındırılmış P.aquatica veya Garcinia iskelelerinin varlığında da ölçülür.
İlginç bir şekilde, deterjan içermeyen iskeleler, hücresel metabolik aktivite üzerinde daha az bir etki ortaya çıkarmıştır, ancak Trishidroklorik tamponu ile yıkama, ardından SDS temizlemesinden sonra serumsuz ortam, tek başına deiyonize su ile yıkamaya kıyasla hücresel metabolik aktivite üzerindeki etkiyi azaltır. Son olarak, F.hispida yaprak yapısının yüzeyinde kalsin ile boyanmış mezenkimal kök hücrelerin büyümesi burada gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikler uygun şekilde uygulandığında yaklaşık yedi günden 15 dakikaya kadar tamamlanabilir.
Bu prosedürleri gerçekleştirirken, numuneler partiden partiye değişebileceğinden, numuneleri hücreden çıkarken izlemeyi unutmamak önemlidir ve bu da farklı temizleme sürelerine neden olabilir. Bu prosedürü takiben, numunelerin ne ölçüde temizlendiği ve numunelerin mekanik olarak başka hangi dokulara benzer olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için miktar giderme veya mekanik test gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların perfüze edilebilir iskeleler üretmesinin önünü açmaya yardımcı oldu.
Bu videoyu izledikten sonra, iskele olarak kullanılmak üzere bitki dokularının nasıl hücrelerden arındırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Deterjanlar ve çamaşır suyu dumanları ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemleri gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu ekipman kullanmak ve çeker ocak kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, bitki dokularını deselülarise etmek için iki protokolü sunar ve karşılaştırır: deterjan bazlı bir yaklaşım ve deterjansız bir yaklaşım. Her iki yöntem de, doku mühendisliği uygulamaları için iskele görevi görebilen hücre dışı matrisi korur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyomalzemeler
- Doku Mühendisliği
- Bitki Biyolojisi
Arka Plan
- Deselülarizasyon teknikleri, iskeleler oluşturmak için kritik öneme sahiptir.
- Iskeleler, sıvı transferi kabiliyetini artırabilir.
- Yöntemler, çeşitli bitki gövde dokularına uygulanabilir.
- Bu teknikler için özel ekipman gerekmez.
Çalışmanın Amacı
- Deterjan bazlı ve deterjansız deselülarizasyon yöntemlerini karşılaştırmak.
- Bitki hücre dışı matrislerinin iskele olarak potansiyelini değerlendirmek.
- Doku mühendisliği için iskele geliştirmedeki zorlukları ele almak.
Kullanılan Yöntemler
- Taze veya dondurulmuş F.hispida yaprak örneklerinin toplanması.
- Örneklerin -20 derece Celsius'ta saklanması.
- Yaprakların 20 ila 25 derece Celsius'ta deiyonizasyon yapılmış suda bekletilmesi.
- Yaprakların biyopsi zımbası kullanılarak sekiz milimetre çapında disklere kesilmesi.
Ana Sonuçlar
- Her iki deselülarizasyon yöntemi, hücre dışı matrisi etkili bir şekilde korur.
- Oluşturulan iskeleler, çeşitli doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabilir.
- Iskelelerin sıvı transfer kabiliyeti artırıldı.
- Yöntemler ölçeklenebilir ve çoğu bitki türü için uygulanabilir.
Sonuçlar
- Deselülarizasyon teknikleri, doku mühendisliği için uygun iskeleler sağlar.
- Her iki yöntemin kendine özgü avantajları vardır ve özel ihtiyaçlara göre seçilebilir.
- Gelecekteki araştırmalar, bitki kaynaklı iskelelerin ek uygulamalarını keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
