Decellularization ve Recellularization metodoloji insan safen damarlar için

Bu yöntem, safen ven dokusu mühendisliği için ayrıntılı bir prosedürü açıklar. Ayrıca basit aparatlar kullanarak hücreden arındırma kurulumlarının ve yeniden hücrelendirme için biyoreaktörün hazırlanmasını da gösteriyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, yeniden hücrelendirme için basit bir kan örneğine ihtiyaç duyulması, böylece ağrılı kemik iliği toplanması ve zaman alıcı hücre kültürü prosedürlerinin ortadan kaldırılmasıdır.

Triton-X 100 perfüzyon ve yıkama için hücre giderme kurulumunu hazırlayın. İki litrelik bir hazneye, üç tüp parçasını da bantlayın A. Bir tüpü, deterjanın girişi için kenarın haznenin dibine değdiği duvara bantlayın. Diğer iki tüpü, damarın uzunluğuna bağlı olarak, aralarında beş ila 10 santimetre mesafe olacak şekilde karşı duvara bantlayın.

Bu tüplerin en az beş santimetresi de odanın zeminine bantlanmalıdır. Erkek ve dişi yem konektörlerini kullanarak deterjanın giriş borusunu B borusuna bağlayın. Daha sonra B tüpünü F tüpüne ve F tüpünü C tüpüne bağlayın.

Şimdi, F tüpünü peristaltik pompanın kasetine yerleştirin. Başka bir tüp C alın ve bir ucunu damarın çıkışına bağlayın. Diğer ucunu, alt hortum çıkışı ile donatılmış ve haznenin 45 santimetre yukarısına yerleştirilmiş bir cam kavanoza yerleştirin ve sabitlemek için bantlayın.

Bu, deterjan çıkışı görevi görür. Ardından, G tüpünün bir ucunu cam kavanozun hortum çıkışına itin ve diğer ucunu damar haznesine yerleştirin. Ardından, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi TnBP perfüzyonu için hücre çözme kurulumu iki hazırlayın.

Ayrıca, metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi DNA'nın perfüzyonu için hücre giderme kurulumu üç hazırlayın ve 37 santigrat dereceye yerleştirin. Yeniden hücreselleştirme biyoreaktörünü hazırlamak için, tüp H'yi damarın çıkışı olarak işlev görmesi için dört portlu bir kapağın bir portuna yerleştirin. İkinci bağlantı noktasına, medya girişi olarak işlev görmesi için tüp I'i yerleştirin.

Ve üçüncü porta, damarın girişi için J tüpünü yerleştirin. Ardından, medya çıkışı olarak hizmet etmesi için H tüpünün diğer ucunu dördüncü bağlantı noktasına takın. İndirgeyici konektörleri H ve J tüplerinin iç uçlarına bağlayın. J tüpünün diğer ucunu U şeklinde bükün ve bir dikişle bağlayın.

Şimdi, 250 mililitrelik bir bardağa düz tabanlı 60 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Ardından, tüp K'nin bir ucunu damar girişine bağlayın ve diğer ucunu tüp E'ye bağlayın. Daha sonra hazırlanan kapak kurulumunu şişede bulunan tüpe yerleştirin.

Son olarak, biyoreaktörü otoklavlama ile sterilize edin. Makasla iki milimetre uzunluğunda bir biyopsiyi kesmeden önce metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir insan safen damarı üzerinde iki donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin. Biyopsiyi oda sıcaklığında 24 ila 48 saat formaldehit içinde sabitleyin.

Damarın her iki ucunu bir dikişle bir erkek ve dişi yem konektörünün dikenlerine bağlayın. Damarı hücreden arındırma kurulumuna bağlayın, birinci kurulum yapın ve odayı bir litre çözelti iki ile doldurun. Şimdi, dakikada 35 mililitre hızında 15 dakika perfüze edin ve kurulumun içeriğini boşaltın.

Daha sonra, bir litre çözelti dört ekleyin ve dakikada 35 mililitre olarak dört saat boyunca perfüze edin. İçeriği boşaltın, 500 mililitre çözelti iki ekleyin, beş dakika perfüze edin ve içeriği tekrar boşaltın. Damarı perfüzyon kurulumu bir'den ayırın ve perfüzyon kurulumu ikisine bağlayın.

Daha sonra, bir litre çözelti beş ekleyin, karıştırıcıyı açın ve dakikada 35 mililitre olarak dört saat boyunca perfüze edin. Damarı ikinci perfüzyon ayarından ayırın ve damarın dışını iki kez 20 mililitre ultra saf su ile yıkayın. Daha sonra damarın içini iki kez 20 mililitre ultra saf su ile beş ila 10 dakika yıkamak için bir şırınga kullanın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi perfüzyon kurulumu üç ile perfüzden sonra, damarı perfüzyon kurulumu bir'e bağlayın. Bir litre çözelti iki'yi doldurun ve gece boyunca dakikada 35 mililitre perfüze edin. Nükleer materyalin tamamen uzaklaştırılması için perfüzyon işlemini dört kez tekrarlayın.

Perfüzyonu takiben, kurulumu boşaltın, bir litre çözelti ikisini doldurun ve dakikada 35 mililitre ile 24 saat boyunca perfüze edin. 24 saat sonra kurulumu tekrar boşaltın ve bir litre ultra saf su ile doldurun. Dakikada 35 mililitre ile 24 saat daha perfüz

Son olarak, aynı koşulları kullanarak, ancak yedinci çözelti ile perfüzyonu tekrarlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücre çözmenin doğrulanmasından sonra, damarı 50 mililitre çözelti sekiz içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirerek sterilize edin. 37 santigrat derecede bir saat boyunca bir çalkalayıcıda dakikada 80 dönüşte çalkalayın.

Steriliteyi korumak için laminer bir akış kabininde çalışmak, şimdi steril damarı 50 mililitre steril çözelti yedi içeren ve 500 mikrolitre anti anti içeren yeni bir 50 mililitre tüpe aktarmak için steril forseps kullanın. Damarı daha önce olduğu gibi 12 saat boyunca çalkalayın, aralarında en az iki kez çözelti yedi'yi değiştirin. Steril forseps kullanarak, damarı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın, 50 mililitre endotel ortamı ekleyin ve 11 saat boyunca çalkalayın.

Şimdi damarı steril sütür ve forseps ile biyoreaktörün damar giriş ve çıkışına bağlayarak bağlayın ve kapak kurulumunu 250 mililitrelik şişeye kadar sıkın. Biyoreaktörü aynı endotel ortamı ile doldurun. Mililitre başına 50 birim heparin ekleyin ve inkübatörde dakikada iki mililitre olarak bir saat perfüze edin.

Donörden 15 ila 25 mililitre taze kanı heparin kaplı vakutainer tüplerde toplayın ve steen solüsyonu ile bire bir seyreltin. Daha sonra endokrin bezinden türetilmiş vasküler endotelyal büyüme faktörü, bazik fibro blast büyüme faktörü ve ince bir salisilik asit ekleyin. Endotel ortamını biyoreaktörden boşalttıktan sonra, içine kanı ekleyin ve yüzde beş karbondioksit içeren 37 santigrat derece inkübatörde dakikada iki mililitre hızında 48 saat boyunca perfüze edin.

Yaklaşık 12 saat sonra, biyoreaktörden bir damla kanı çıkarmak için laminer akış kabininde çalışın ve bir kan şekeri izleme cihazı kullanarak glikozu ölçün. Seviye litre başına üç milimolden azsa, litre başına yedi ila dokuz milimol aralığına getirmek için glikoz ekleyin. İnkübatöre geri döndükten 48 saat sonra, laminer akış kabinindeki biyoreaktörden kanı boşaltın.

30 mililitre steril çözelti yedi ekleyin, beş dakika perfüze edin ve çözeltiyi boşaltın. Kan kırmızısı renk kaybolana kadar bu işlemi tekrarlayın. Son olarak, 30 ila 45 mililitre endotel ortamı ekleyin ve inkübatörde dakikada iki mililitre hızında 96 saat boyunca perfüs yapın.

Hücreli damarı laminer akış kabinindeki biyoreaktörden ayırın, damarın beş milimetre kenarını makas kullanarak kesin ve atın. Daha önce olduğu gibi bir biyopsi alın, formaldehite yerleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi yeniden hücreselleşmenin doğrulamasını gerçekleştirin. Normal bir damarın brüt morfolojisi parlak kırmızı renkte görünür.

Kırmızı renk, ilerleyici hücreden arındırma döngülerinde kaybolur ve beş tedavi döngüsünden sonra soluk ve beyaz görünür. Periferik kan ve endotel ortamının perfüzyonu ile yeniden hücrelenen ven tekrar parlak kırmızı renkte görünüyordu. Burada, birçok mavi çekirdeğin varlığını gösteren normal damarın temsili bir Hemotoksilin ve Eozin boyama görüntüsü gösterilmektedir.

Bununla birlikte, deselüler venin Hemotoksilin ve Eozin boyamasında mavi çekirdekler görülmedi. Kan ve endotel ortamı ile perfüze edilen reselüler vende, Hemotoksilin ve Eozin boyaması lümende hücre bağlanmasının varlığını gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, safen venin deterjanlarla hücreden arındırılması ve periferik kan ve endotel ortamı ile yeniden hücreselleştirilmesinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Triton-X 100, TnBP ve DNA'ların basınç altında perfüzyonunu kullanan bu hücre giderme tekniği, insan safen damarlarından çekirdeklerin çıkarılmasında başarılı ve tekrarlanabilirdi. Bu tekniğin tamamlanması 20 gün sürse de, hücreden arındırılmış damarın raf sonrası ürün olarak saklanması işlem süresini sekiz güne indirecektir. Alıcının periferik kanını kullanarak damarların yeniden hücreselleştirilmesi klinik olarak anlamlı olarak kabul edilebilir.

Benzer protokol ile reselüler hale getirilen venler, operasyon sonrası fonksiyonel bir kanlanma sağlayarak klinik transplantasyonda umut vaat etmiştir. Küçük değişikliklerle, bu protokol herhangi bir damar tipi için ve tüm vasküler ameliyatlar için kliniklerde kişiselleştirilmiş bir greft olarak kullanılabilir.