Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Bu protokolün amacı, tardigrad adı verilen mikroskobik bir organizmanın genomunu sıralamaktır. Bir tardigrad olan Hypsibius dujardini'nin genomunu, tüm genom uygulaması ile 50 pikogram kadar düşük genomik DNA'ya sahip tek bir örnekten dizilemek için bir yöntem oluşturduk. Tek bir tardigradı izole ettikten sonra, antibiyotik ve görsel inceleme kullanarak bakteriyel kontaminasyonu en aza indiriyoruz.

Ayrıca iki homojenizasyon yöntemi kullandık. Birincisi ve en yaygın olarak C.elegans'ta donma ve çözülme döngüleri kullanılarak kullanılır ve ikincisi, tardigradın bir pipet ucu ile manuel olarak ezilmesi. DNA daha sonra bir dizileme kütüphanesi oluşturmak için kullanılır ve daha sonra bir MiSeq Cihazında dizilenir.

Protokolün genel bir özeti. Tek bir bireyin izolasyonundan sonra, homojenizasyon için üç donma ve çözülme döngüsüne tabi tutulur. Genomik DNA ekstrakte edilir ve saflaştırılır ve sonikasyon ile parçalanır.

Daha sonra bir sıralama kütüphanesi oluşturulur ve kütüphane boyutu dağılımının doğrulanmasından sonra, bir sıralama aracı ile sıralanır. 90 milimetrelik bir plastik kültür kabında çözücü olarak damıtılmış su kullanarak% 2 agaroz jeli ve damıtılmış su ile 10 milimetre% 1 penisilin streptomisin hazırlayın. Jel, 18 dereceye ayarlanmış bir inkübatörde iki ila üç hafta saklanabilir.

Tek bir tardigrad toplayın ve hazırlanan agar plakasına yerleştirin ve kalan parçacıkları çıkarmak için iki ila üç kez damıtılmış su ile yıkayın. Bakteriyel kontaminasyonu gidermek için tek tardigradı penisilin streptomisin antibiyotiklerine iki ila altı saat boyunca yerleştirin ve dekontamine hayvanı bir P10 pipeti kullanarak temiz bir sürgülü cam üzerine yerleştirin. Tardigradı mikroskop altında 500 kat büyütmede gözlemleyin ve bakteri kalmadığını doğrulayın.

En fazla beş mikrolitre sıvı içeren bir P10 pipeti kullanarak bireyi toplayın ve düşük bağlayıcı bir PCR tüpüne yerleştirin ve fazla sıvıyı mümkün olduğunca çıkarın. Homojenizasyon ve DNA ekstraksiyonu. Aşağıdaki yöntemlerden biriyle genomik DNA elde etmek için hayvanı homojenize edin.

Donma ve çözülme döngüleri ile homojenizasyon. Adım 2.5'in hemen ardından, tardigrad içeren PCR tüpüne 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. PCR tüpünü 10 dakika boyunca sıvı nitrojen içine yerleştirin ve 10 dakika boyunca 37 dereceye kadar ısıtın bir ısı bloğuna geçin.

Bu adımı üç kez tekrarlayın. Manuel kırma. Stereo mikroskop altında, hayvanı PCR tüpü duvarına bastırarak bireyi bir P10 pipet ucu ile ezin ve hemen 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.

Lizisin oluşması için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Lizis karışımının tam hacmini temiz, 1.5 mililitrelik düşük bağlayıcı bir mikrotüpe aktarın. Homojenizasyon için kullanılan ve artık boş olan düşük bağlayıcı PCR tüpüne 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.

Pipetlemeden sonra, karışımı 1,5 düşük bağlayıcı mikrotüpe aktarın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Düşük bağlayıcı bir PCR tüpüne 300 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve pipetlemeden sonra karışımı 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı mikrotüpe taşıyın.

Toplama tüpüne yerleştirilen spin kolonuna toplam 600 mikrolitre lizis karışımı ekleyin ve bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Akışı kolona tekrar uygulayın ve bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Bu adım, genomik DNA'nın çoğunun kolona bağlı olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir.

Sıkma kolonuna 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Sıkma kolonunu temiz bir 1,5 mililitrelik mikrotüpe aktarın. Spin kolonuna 20 mikrolitre 10 milimolar ilk ACL uygulayın ve oda sıcaklığında beş dakika bekleyin.

Bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Seyreltme tamponu, laboratuvar preparasyon enzimleriyle etkileşime girdiği için EDTA içermemelidir. Akışı döndürme kolonuna tekrar uygulayın ve oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyondan sonra, 10.000 G'de bir dakika santrifüjleyin.

DNA parçalanması. 15 mikrolitre genomik DNA elutesini DNA parçalanması için 15 mikrolitrelik bir mikrotüpe aktarın ve bir masa üstü santrifüj kullanarak bir dakika santrifüjleyin. Genomik DNA'yı 550 baz çiftine parçalayın.

Pipetlemeden sonra, 10 mikrolitre parçalanmış DNA karışımını temiz, düşük bağlayıcı bir PCR tüpüne aktarın. Deney burada durdurulabilir. DNA'yı dört veya eksi 20 derecede koruyun.

Sıralama kütüphanesi yapımı. Düşük girdili DNA nedeniyle belirtilen kitin aşağıdaki prosedürlerde kullanılması kesinlikle kritiktir. Üreticinin protokolünü izleyerek gerekli reaktifleri hazırlayın ve herhangi bir değişiklik yapmadan sıralama kitaplığını oluşturun.

Kütüphane amplifikasyon karışımını bir kütüphane sentez karışımına uyguladıktan sonra, bir termal döngüleyicide PCR reaksiyonu gerçekleştirin. PCR reaksiyonu gösterildiği gibi gerçekleştirildi. PCR reaksiyonunun saflaştırılması.

50 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve 10 kez pipetleyin ve masa üstü mikro santrifüj ile kısa bir süre santrifüjleyin. Oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Manyetik stand üzerinde beş dakika veya çözelti tamamen berraklaşana kadar inkübe edin ve süpernatanı çıkarın.

Üreticinin protokolünü takip edin. Peletleri rahatsız etmeden süpernatanı yeni, düşük bağlayıcı bir PCR tüpüne aktarın. DNA kalite kontrolü ve miktar tayini ve dizileme.

DNA kütüphanesi boyut dağılımının doğrulanması. Bir mikrolitre sıralama kitaplığı ile üç mikrolitre numune suyu ekleyin ve bir girdap ile bir dakika boyunca iyice karıştırın ve bir masa üstü santrifüj ile kısaca santrifüjleyin. Elektroforez gerçekleştirin ve ilgili yazılımla kitaplık boyutu dağılımını doğrulayın.

Ana parça zirvesi genel olarak yaklaşık 300 ila 1.000 baz çifti arasında olmalıdır. DNA miktar tayini. 796 mikrolitre çözelti tamponu ve dört mikrolitre floresan reaktifi ekleyin ve iyice karıştırın.

Çalışma solüsyonunun 190 mikrolitresini iki tahlil tüpüne ve 197 mikrolitresini bir tahlil tüpüne dağıtın. 190 mikrolitre çalışma çözeltisi içeren her bir tahlil tüpüne bilinen DNA konsantrasyonlarına sahip 10 mikrolitre standart ekleyin ve 197 mikrolitre çalışma çözeltisi içeren tahlil tüpüne hazırlanan kütüphaneden üç mikrolitre ekleyin. Kısa bir süre girdap yapın ve masa üstü santrifüjde santrifüjleyin.

Üç mikrolitre ayarlı bir florometre kullanarak DNA'yı ölçün. DNA kütüphanesinin dizilimi. Sıralama kitaplığını üreticinin protokolüne göre hazırlayın.

Reaktif kasetini ve akış hücresini sıralama cihazına yerleştirin ve üreticinin protokolünü izleyerek sıralama çalıştırma bilgilerini girin. Sıralamayı çalıştırın. Temsil edilen sonuçlar.

Yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonunda kirleticilere maruz kalma, protokolümüzdeki kritik nokta olmaya devam etmektedir. Kirletici olup olmadıklarını görsel olarak incelemek için, tardigradı penisilin ve streptomisin olan antibiyotiklerde inkübe ettik ve ayrıca bireyi 500 kez mikroskop altında inceledik. Burada görüldüğü gibi, tardigradların etrafındaki görünür mikroplar tamamen aydınlatılır.

Verimli homojenizasyon, DNA ekstraksiyonu, parçalanma ve kütüphane hazırlığının ardından. Kitaplığın boyut dağılımı, kalite kontrol için yüksek hassasiyetli bir elektroforez kullanılarak doğrulanır. Mor ve yeşil çizgiler, sırasıyla 1, 500 ve 25 baz çiftinde üst ve alt işaretleri gösterir.

L şeridi bir merdiven işaretleyicisidir, S ve N1'den N4'e kadar olan şeritler, tümü tek bir tardigrad örneğinden başlayarak aynı deneyin beş kopyasıdır. 200 ila 1.000 baz çifti arasındaki geniş üniforma ve dağılımdan görülebileceği gibi, protokolümüz ultra düşük girişle bile oldukça tekrarlanabilir. Tek bir sıralama çalıştırmasından elde edilen senkronize okumalar için hızlı QC'nin sonucu aşağıda verilmiştir.

Okumalar, ileri ve geri okumaların sırasıyla üstte ve altta gösterildiği 300 baz çiftinin yedek uçları olarak elde edilir. Burada gösterilen dağılım, ilk 200 baz çifti için Q30'un üzerinde çok yüksek kaliteli baz çağrısı ile 300 çift uç okumasının tipik bir örneğidir ve yavaş yavaş sona doğru düşer. Dolayısıyla bu yöntem, bir numune için yalnızca tek bir birey kullanır.

Önceki tardigrad genom dizileme projelerinde gerekli olanlar gibi büyük miktarlarda hayvan gereksinimi yoktur. Çoğu tardigrad için kültür yöntemleri henüz belirlenmemiştir. Bu nedenle, doğrudan saha çalışmasından olanlar gibi tek bir bireyden genomik dizilemenin etkinleştirilmesi, tardigrad moleküler biyolojisi ve muhtemelen diğer küçük hayvanlar için büyük bir etkiye sahip olacaktır.

DNA dizileme yöntemlerimiz, nadir yaban otu türleri, nematodlar, su köknarları ve diğer seçenekler gibi henüz dizilenmemiş diğer çok sayıda mikroskobik organizmayı, bölgelerin bir kısmını ve daha geniş bir kamusal alanı birbirine bağlayarak analiz etmeyi mümkün kılar ve çeşitli biyolojik mekanizmaların mümkün olabileceği ortamı ilerletir.