Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme
7 Mart 2019
Moleküler görüntüleme matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) ile birden çok analitler eş zamanlı haritalama biyolojik örnekleri sağlar. Burada, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid angiopathy örnekleri maldı-IMS kullanarak beyin dokuları algılama ve görselleştirme amiloid β protein için bir iletişim kuralı mevcut.
Makalemizin ana katkısı, MALDI görüntüleme kitle spektrometresi görüntüleme teknolojisi ile Alzheimer hastalığı beyninin amiloid beta patolojisinin kesin ve ince bir manzarasını incelemiş olmamızdır. Doku slaytlarının formik asit ön tedavisi ile özel bir protokol oluşturarak teknolojik gelişmelere ulaştık. MALDI-IMS'den sonra segmentasyon haritaları oluşturulur ve plak ve subaraknoid vaskülatür ile birlikte lokalize yeni marker proteinleri veya peptidleri keşfetmek için hesaplamalar yapılır.
Ölümden sonra sekiz saat içinde eksi 80 derecede çıkarılan, işlenen ve depolanan beyinlerden IMS için insan kortikal örnekleri alın. AD hastalarının oksipital korteksve yaş uyumlu kontrollerden beyin örneğini alın. Bir kriyostat üzerinde doku bölümleri kesmek için, ilk gıyonluk içinde iletken indiyum tin oksit veya ITO kaplı mikroskop cam slaytlar yerleştirin.
Otopsi beyin örneğini eksi 80 santigrat dereceden kriyostat içinde eksi 22 santigrat dereceye ısıtın. Her deney için kriyostat'a yeni bir tek kullanımlık bıçak takın. Her zaman bıçağın temiz bir parçasını kullanmaya çalışın.
Dondurulmuş otopsi beyinlerini az miktarda optimum kesme sıcaklığı bileşimiyle birlikte sahneye koyun. IMS ve immünohistokimya için, her doku örneğinden beş ila altı bölüm kesti. Bıçak dokuyu kesmeye başladığında, tekerleği çevirin ve tüm doku açığa çıkana kadar bloğa dönün.
Bölümde küçük bir çizgi veya yırtık varsa, sıcaklık ayarı otomatik olarak düzeltene kadar kriyostat'ta bekleyin. Anti-roll'u altında bir doku yla açmadan önce birkaç saniye sayın. Doku dilimini hemen cam kaydıranın İTO kaplı tarafına yerleştirin.
ITO kaplamalı olmayan tarafta ki kaydırağın altına bir parmak koyarak doku dilimini eritin. Doku slayta yapışacak. Hiçbir kırışıklık ları ile doku mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun.
Doku bölümlerini durulamak için, endojen lipidleri ve inorganik tuzları çıkarmak için numuneleri cam boyama kavanozuna 30 saniye boyunca %70 etanol mililitreye batırın. Metin protokolünde listelenen yıkama sırasını kullanarak örnekleri yıkayın. Daha sonra numuneleri 30 dakika vakumla kurulayın.
Şimdi, otopsi beyin dokusundan amiloid beta proteinlerinin daha iyi iyonizasyonu için doku bölümlerini formik asit buharı ile tedavi edin. Bunu yapmak için, 60 santigrat derece fırın ve% 100 formik asit beş mililitre ile bir kuluçka cam çanak hazırlayın. Hava nemini kuluçka cam çanağı doygunluk seviyesinde tutun.
Formik asit daldırma önlemek ve altı dakika tedavi ederken kuluçka cam çanak doku slaytlar yerleştirin. Film tarayıcısı, jel tarayıcı veya dijital mikroskop kullanarak örneklerin optik görüntüsünü alın. Bu adımı oda sıcaklığında gerçekleştirin.
Numune hedefi cihazın içine yerleştirildiğinde numunelerin optik görüntüsünün hizalanması gereklidir. Genellikle, matris tabakasının altındaki doku bölümünü tanımak mümkün olmayacaktır. Optik görüntüleri örneklerle ilişkilendirmek için, hem optik görüntüde hem de kamera optikindeki matris katmanının altında görünen kılavuz işaretleri yapın.
En kolay yolu optik görüntü almadan önce örnek etrafında en az üç düzeltme sıvı sıyrık işaretleri nokta etmektir. Bir ultrasonik püskürtücü ile matris sprey için, desiccator püskürtülür ve odasına yerleştirin doku çıkarın. Dokunun sensör penceresini kaplamadığından emin olun.
Başlat düğmesine basarak hazırlık başlatın. Genellikle hazırlık süresi 90 dakika civarındadır. Hazırlık matris tabakası kalınlığı ve ıslaklık izlenmesi ile otomatik olarak düzenlenir.
Alternatif olarak, matris çözeltisini otomatik püskürtücü ile doku yüzeyine püskürtmek için, matris çözeltisini teslim etmek için dakikada 10 psi ve 0,15 mililitre olarak ayarlanmış bir çözücü pompa sistemi kullanın. Isıtılan kılıf gazının sabit bir akışı matris çözeltisi spreyi ile birlikte teslim edilecektir. MALDI-IMS ile yüksek iş yapma ve yüksek mekansal çözünürlükte görüntüleme deneyleri yapın.
Kütle spektrometresi ölçümü için MALDI kontrol yazılımı ve veri analiz yazılımını kullanarak doku alanlarını tanımlayın. 2, 000-20, 000 ve 20 ve 100 mikron uzamsal çözünürlüğe sahip pozitif doğrusal modda spektrum elde edin. Kalibrasyon standardını sağlamak için, peptit kalibrasyon standardını ve protein kalibrasyon standardını CHCA ve TA30 çözeltisi ile 1-4 oranında çözünve 10 kez seyreltin.
Dört farklı konuma slaytüzerinde kalibrasyon standardı bir mikrolitre yerleştirin. Moleküler histoloji yazılımı kullanarak, senil plaklar ve arteriyel duvarlarda kolokalize farklı amiloid beta peptidler gibi çeşitli sinyallerin mekansal korelasyon bulmak için birden fazla sinyal görüntüleri bindirme. Bu çalışmada üç numaralı hastanın serebral amiloid anjiyopatisi veya CAA fenotipleri en belirgin olarak görüldü.
Bu hastanın beyin dokusunun MALDI-IMS açıkça amiloid beta 1-42 ve amiloid beta 1-43 tercihen serebral parankim de senile plaklar olarak yatırıldı görselleştirilmiş. Buna karşılık, amiloid beta 1-36-1-41 gibi kısa amiloid betalar tercihen leptomeningeal vasküler alanlarda birikti. Patolojik olmayan kontrolde önemli bir sinyal yoktu.
Amiloid beta 1-40 ve amiloid beta 1-42 dağılımları dokuların komşu dondurulmuş bölümleri kullanılarak immünohistokimya ile doğrulandı. Anti-amiloid beta 1-40 antikor CAA etiketli ve ortaya amiloid beta 1-40 tercihen leptomeningeal kan damarlarında yatırılır, hangi senil plaklar olarak serebral parenkim amiloid beta 1-42 dağılımı açık kontrast. Burada gösterilen bir segmentasyon haritası hasta üç numaralı aynı bölüme uygulanan bir bisecting k-ortalama analizi ile elde edilir.
Bu kümeleme yöntemi, subaraknoid alanda parankim ve vasküler yapılarda plak benzeri yapıları başarıyla tanımlayabilmiştir. Bu parankim sadece parankim küçük bir arteriyol etrafında tespit edilir parankim küçük bir dairesel alan bulmak için ilginç yanı sıra subaraknoid alanda. Bu bireysel amiloid beta peptidlerin tek iyon görüntüleri ile doğrulanır.
Belirli antikorlar kullanıyor olsa bile aynı anda amiloid betas geniş bir yelpazede izlemek için bir sınırı vardır. Burada, son teknoloji MALDI görüntüleme kütle spektrometresi yöntemini kullanarak insan beyninde amiloid beta dağılımını gösteriyoruz. Bu rapor insan otopsi beyinlerinde amiloid beta proteinlerinin tam set karakterizasyonu sunuyor, çünkü bu katkı Alzheimer hastalığı araştırma atılım yapar inanıyoruz.
En etkileyici bulgu, amiloid beta proteininin C terminalinde sadece tek bir amino asit değişiminin dağılımlarında köklü bir değişiklik yaptığıdır. Doku hazırlama adımları insan beyin dokusunda toplanan proteinlerin etkili bir iyonizasyon elde etmek için önemlidir. Yüksek duyarlılık ve artifakız görüntüleme için çok önemli matrisler ile analithomojen cocrystallization.
Genel Bakış
Bu çalışma, MALDI-IMS (matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi) kullanarak Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid anjiyopatisi olan beyin dokularında amiloid β proteininin saptanması ve görselleştirilmesi için bir protokol sunmaktadır. Protokol, beyin dokusu örneklerindeki amiloid patolojisinin mekânsal çözünürlüğünü ve tanımlanmasını geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyolojik Görüntüleme
- Alzheimer Hastalığı Araştırmaları
Arka Plan
- Amyloid β patolojisi, Alzheimer hastalığının belirgin bir özelliğidir.
- Çalışma, amyloid β proteinlerinin detaylı haritalaması için MALDI-IMS kullanmaktadır.
- Formik asit ön işlemi, hedef proteinlerin iyonizasyonunu iyileştirir.
Çalışmanın Amacı
- Beyin dokusundaki amiloid β'nın daha iyi görselleştirilmesi için hedefe yönelik bir protokol geliştirmek.
- Amiloid plaklarıyla ilişkili marker proteinleri veya peptidleri tanımlamak.
- Alzheimer patolojisinde amiloid proteinlerin mekansal dağılımını anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kütle spektrometrisi için görüntüleme platformu olarak MALDI-IMS kullanılmıştır.
- Alzheimer hastalarından ve kontrol grubundan insan kortikal örnekleri elde edilmiştir.
- Örnekler, formik asit buharı maruziyeti dahil olmak üzere spesifik ön işlem adımlarından geçirilmiştir.
- Amyloid β'nin mekansal dağılımını analiz etmek için segmentasyon haritaları ve kümeleme yöntemleri kullanılmıştır.
Ana Sonuçlar
- Çalışma, çeşitli amiloid β peptidlerinin farklı birikim modellerini ortaya çıkarmıştır.
- Amiloid β 1-42 ve 1-43, ağırlıklı olarak serebral parenkim içindeki senil plaklarda bulunmuştur.
- Temel bir bulgu, daha kısa amiloid β peptidlerinin kan damarlarının yakınında tercih edilen birikim göstermesidir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, Alzheimer hastalığındaki amiloid patolojisini incelemek için geliştirilmiş metodolojik bir yaklaşım sunmaktadır.
- Elde edilen bilgiler, beyin dokularındaki amiloid β dağılımının mekansal dinamiklerine dair anlayışımızı geliştirmektedir.
- Bu bulgular, nörodejeneratif hastalıklardaki amiloidle ilişkili mekanizmaları hedefleyen gelecek araştırmalar için önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
MALDI-IMS, insan beyin dokusundaki amiloid β izoformlarının yüksek çözünürlüklü uzamsal haritalanmasını sağlayarak, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid anjiyopati patolojisine dair mekanistik içgörüler sunar. Bu yaklaşım, amiloid β peptidlerinin farklı çökelme modellerini ortaya çıkararak hedef doğrulamayı destekler, terapötik hipotez testlerine ve biyobelirteç keşfine veri sağlar. Yöntem, moleküler dağılımı belirli problara ihtiyaç duymadan nöropatolojik fenotiplerle ilişkilendirerek, preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Senil plaklardaki amyloid β 1-42 ve 1-43'ü ve vasküler depolardaki daha kısa izoformları görselleştirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Hastalıkla ilişkili insan dokusunda hedef etkileşiminin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla biyolojik risk azaltmaya olanak tanır.
- öngörücü Değer: Belirgin patolojik lokalizasyona sahip amyloid β türlerini tanımlayarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Formik asit ön işlemi ve MALDI-IMS segmentasyonu aracılığıyla, sonraki iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Otomatik matriks püskürtme ve uzamsal çözünürlük kontrolü ile analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Tarama Hazırlığı: Doku kesitlerinde kantitatif amyloid β profillemesi için ölçeklenebilirliği ve platformun yeniden kullanılabilirliğini vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: AD ve CAA'da amiloid β izoformlarının leptomeningeal damarlar ve serebral parankim ile eşleştirilmesi yoluyla hastalıkla olan ilgisini tartışır.
- Operasyonel Değer: Peptit sinyallerinin uzamsal korelasyonunu kullanarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: İzoforma özgü çökelmenin immünohistokimya ile doğrulanması yoluyla öngörücü risk azaltmaya odaklanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
MALDI-IMS, insan beyin dokusunda hipotez testlerini, yolakların aydınlatılmasını ve biyobelirteç hizalamasını mümkün kılarak, hedef doğrulamadan preklinik çalışmalara kadar uzanan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Hastalıklı ve kontrol dokularındaki amiloid β peptidlerinin uzamsal haritalaması yoluyla hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilir doku hazırlama, matris uygulaması ve 20 µm uzamsal çözünürlüklü görüntüleme ile analiz hazırlığını tanımlar.
- Analitik: Moleküler histoloji yazılımı kullanılarak amiloid β izoformlarının kantitatif ölçümlerini ve kolokalizasyon analizini vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Vasküler ve parenkimal depozisyon paternlerini bitişik immünohistokimya ile doğrulayarak yöntemi preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: MALDI-IMS'yi nörodejeneratif hastalık araştırmalarında çoklu protein haritalama için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak konumlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tahmin güvenilirliği, hedef doğrulaması, amiloid β patolojisindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Doku hazırlama ve görüntüleme iş akışlarının standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: İzoforma özgü hedef içgörüsü yoluyla daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Parankim ile damarlar arasındaki farklı amiloid β birikimine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Kütle spektrometrisi, histoloji ve nöropatoloji alanlarında gerekli bilimsel uzmanlık.
- MALDI sistemi, kriyostat, ultrasonik püskürtücü ve moleküler histoloji yazılımı dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları.
- Doku işleme, formik asit buharı işlemi ve veri analizi protokolleri için ekipler arası standardizasyon gereksinimleri.
- Model sistemler arasındaki adaptasyon hususları, özellikle insan otopsi dokusu ile transgenik modeller arasındaki farklar.
- Pratik kısıtlamalar arasında optimize edilmiş matriks uygulaması gerekliliği ve karmaşık doku ortamlarında potansiyel sinyal örtüşmeleri yer almaktadır.
