Name: Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Keşfedin, MALDI-IMS ile insan beyninde amiloid β birikimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi yöntemini. Formik asit ön işleme protokolü, plak ve damar yapılarındaki farklı peptit dağılımlarını ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser kısmen yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir (beyin Protein eskime ve demans denetim 26117004; M.I. ve m.). Bu araştırma kısmen stratejik araştırma programı tarafından beyin Bilimleri Japonya ajansı için tıbbi araştırma ve geliştirme (AMED) için desteklenen bir durumdu. Tüm deneyler varış yönergelere uygun olarak yapılmıştır.

Burada, doku örnekleri Japonya'da yaşlı nüfus için topluma dayalı sağlık hizmetleri sağlayan Tokyo Metropolitan geriatrik Hastanesi toplanmıştır. Çalışmada kullanılan beyin otopsi örnekleri beyin bankaya ölenin yakınları Onam ile yaşlanma araştırma (BBAR) için kaydedildi. BBAR Tokyo Metropolitan Hastanesi Geriatri ve Gerontoloji Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Beyin bankada kayıtlı tüm beyin hastaları veya aileleri yazılı bilgilendirilmiş izinlerin kullanımları için tıbbi araştırma için aldığınız. Hastaların beyin öldükten sonra değişiklikleri azaltmak için ölümünden sonra 2 saat içinde soğuk (4 ° C) Oda yerleştirildi. Burada açıklanan tüm yöntemleri yaşlanma araştırma, Tokyo Metropolitan Hastanesi Geriatri ve Gerontoloji Enstitüsü için Doshisha Üniversitesi ve beyin banka tarafından onaylanmıştır.
1. IMS için hazırlık doku bölümleri
<ol><li>İnsan autopsied beyin doku numune işleme Not: emin olun örnek hazırlama adım IMS için doku özgün durumunu korur. Kirlenme ve öldükten sonra değişikliklerinden sakınınız. Aşağıdaki adım çok önemlidir.<ol>
<li>İnsan kortikal örnekleri IMS için kaldırıldı, işlenen ve 8 h öldükten sonra içinde-80 ° C'de depolanan beyin ile alın. Oksipital korteksi reklam hasta ve yaş eşlemeli denetimleri21üzerinden beyin numune al.</li>
	</ol></li>
	<li>Donmuş doku bölümleri hazırlanması
	<ol>
<li>Bir cryostat doku bölümlerde kesti. İletken mikroskop ITO kaplı cam slaytlar cryostat21içine yerleştirin.</li>
		<li>Otopsi beyin numune-80 ° C'den-22 ° c cryostat içinde sıcak.</li>
		<li>Her deneme için cryostat yeni bir tek kullanımlık bıçak iliştirin. Her zaman bıçak temiz bir parçası kullanmayı deneyin.</li>
		<li>OCT bileşik küçük bir miktar ile birlikte sahnede donmuş otopsi beyin koymak (orijinaliyle merkezi alanı kapsayacak şekilde yeterli Malzemeler tablobakın).</li>
		<li>İnce kesit için koşulları seçin. IMS için 10-12 mikron kalınlığında insan beyin bölümleri için kullanın. IMS ve IHC için 5-6 bölümleri her doku örneği kesti.</li>
		<li>Bıçak sadece doku kesmeye başlatırken, tekerlek ve "yüz" blok tüm doku maruz kadar açın. Bir küçük çizgi veya varsa gözyaşı bölüm, sıcaklık ayarı otomatik olarak giderir biraz daha cryostat içinde bekleyin. Anti-roll altında bir doku ile açmadan önce birkaç saniye sayısı.</li>
		<li>Hemen doku dilim cam slayt ITO kaplı tarafına yerleştirmek. Doku dilim bir parmak altında slayt ITO kaplı yan üzerinde koyarak çözülme. Doku slayt için sopa olacak; doku yok kırışıklıklar ile mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Oda sıcaklığında bu adımı gerçekleştirin. Not: insan örnekleri Biyolojik kirleticiler içerebilir çünkü eldiven, maske ve laboratuvar elbisesi giymek. Tüm bölümler için gün yapıldığında, cryostat, fırçalar ve chucks laboratuvar mendil ile ve 200 mL % 100 etanol temiz.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku bölümleri durulama
	<ol>
<li>40-100 mL % 70 etanol için 30 örneklerinde bırakın s endojen lipidler ve inorganik tuzları kaldırmak için. Bir cam kavanoz boyama kullanın.</li>
		<li>40-100 mL % 100 etanol için 30 örnekleriyle yıkama s, 40-100 mL Carnoy'nın çözüm için 3 dk, 40-100 mL % 100 etanol için 30 s, 40-100 mL %0,1 trifluoroacetic asit (TFA) 1 dk. için ve % 100 etanol 30 s. kullanmak bir cam için 40-100 mL kavanoz boyama. Not: Carnoy'nın altı parçaları etanol, üç bölümden Asetik asit ve bir kısım kloroform oluşan bir sabitleştirici çözümdür.</li>
		<li>Kuru bir vakum 30 dk için.</li>
	</ol></li>
	<li>Tedavi için daha iyi bir iyonizasyon otopsi beyin dokuları üzerinden Aβ proteinlerin formik asit buharı ile doku bölümlerin
	<ol>
<li>%100 formik asit ile 5 mL sonraki buharlaşma için kullanılacak fırın ve kuluçka cam slayt hazırlamak. Tatmin edici bir asit tedavi elde etmek için bu adımı boyunca doygunluk düzeyinde kuluçka cam tabak içinde hava nemi tutmak ve sıcaklık 60 ° C'de devam Formik asit batma kaçınırken kuluçka cam tabakta doku slaytlar yerleştirin ve 6 min için tedavi.</li>
		<li>Kullanarak bir film tarayıcı, jel tarayıcı örnekleri optik görüntüsünü almak veya bir dijital mikroskop, vb oda sıcaklığında bu adımı gerçekleştirin. Örnek hedef araç yerleştirildiğinde örnekleri optik görüntü hizalamasını gereklidir. Genellikle, bu matris katmanının altında doku bölümü tanımak mümkün değil. Not: Bir optik görüntü almak için en uygun yol bir office tarayıcısını kullanmaktır. Görüntü görüntüleme veri depolama klasörüne kaydetmek için iyi bir fikirdir.</li>
		<li>Optik görüntü örnekleri ile ilişkilendirmek için optik görüntü ve kamera Optik matris katmanının altında görülebilir Kılavuzu işaretleri olun. Optik görüntü çekmeden önce örnek nokta en az üç düzeltme sıvı alın için en kolay yolu olduğunu.</li>
	</ol></li>
	<li>Matris uygulama
	<ol>
<li>
Matris çözüm hazırlanması
		<ol>
<li>Bir organik solvent dayanıklı microtube 10 mg/mL % 50 Asetonitril (ACN) ve % 0.1 SA çözüm hazırlamak TFA. İyice vortexing veya kullanım kadar kısa sonication için 10 dk. mağaza oda sıcaklığında çözüm tarafından bileşik SA geçiyoruz. Not: Matris püskürtme için üç farklı seçenek vardır: airbrush, ultrasonik bir püskürtme veya otomatik bir püskürtücü kullanarak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Matrix Pistole ile püskürtme
		<ol>
<li>Bir sabit Oda sıcaklığı (20-23 ° C) ve nem oranı (% 40-%60) işlemi gerçekleştirin. En uygun İlaçlama için ayarlamak için parametreler damlacık boyutu, sis, açı ve sprey başlığı ve doku bölümü ve laboratuvar sıcaklık ve nem arasındaki mesafe miktarı içerir. Bu koşullar mikroskobu sonuçları kontrol ederek ayarlayın. Not: Kristal boyutu ve matris kapsama polimerlerin ve istenmeyen geçiş/Difüzyon analitler ve sınırlayıcı faktörler gibi daha küçük damla boyutu için iyidir. Homojenliği de denetim noktasıdır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Matrix ultrasonik bir püskürtücü ile püskürtme
		<ol>
<li>Desiccator püskürtülür ve odasında yeri dokuyu. Doku sensör pencere kapsayan değil emin olun.</li>
			<li>Hazırlık başlatmak düğmesine basarak Başlat; genellikle, hazırlama süresi yaklaşık 90 dakika var. Hazırlık otomatik olarak matris tabakası kalınlığı ve ıslaklık izleme yoluyla düzenlenmiş olması. Hazırlık tamamlandıktan sonra slayt çıkarın ve maldı enstrüman okumadan önce desiccator 15 dakika içinde saklayın.</li>
			<li>Püskürtme ile 2-3 mL sprey kafa görünene kadar MeOH temiz % 100 temiz. Not: Matris damlacıkları ince bir sis dokusu içine batmaya yerçekimi tabakasıyla izin verilir. Bir ortalama damlacık boyutu 20 mikron oluşturulur; Tüm damlacık çapı 50'den az mikron sağlamaktadır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Matrix otomatik bir püskürtücü ile püskürtme
		<ol>
<li>Sprey otomatik bir püskürtücü ile doku yüzeyindeki matris çözüm. Isıtmalı kılıf gaz (N2, 10 PSI, gerekse 75 ° C) sabit bir ﬂow getirebileceği matris çözüm sprey ile teslim edilecektir. Bir çözücü pompa sistemi (10 PSI ve 0,15 mL/dk olarak ayarlamak) matris çözümü sunmak için kullanın. Not: En önemlisi, bir emanet matris aerosoller hiçbir soluma önlemek için kabin altında çalışırlar. Oda sıcaklığına ve nem homojen matris kristalizasyon çoğaltmak denetler.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. MALDI-IMS
<ol><li>
Ultra-High-Speed kütle spektrometresi gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Yüksek performans ve yüksek Uzaysal çözünürlük görüntüleme deneyler maldı-IMS 10 kHz ND: YAG ile donatılmış ile gerçekleştirmek (355 nm) lazer.</li>
		<li>Kütle spektrometresi ölçülerini maldı kontrol yazılımı ve veri analiz yazılımı kullanarak doku alanlarını tanımlayın.</li>
		<li>Spectra m/z 2.000-20.000 kitlesel bir dizi ile olumlu doğrusal modunda ve 20 ve 100 µm uzamsal çözünürlük elde etmek.</li>
		<li>Peptid kalibrasyon standart ve 1:4 TA30 çözüm olarak Alfa-Cyano-4-hidroksil-Sinanamik asit (CHCA) ile bir oranı ile standart protein kalibrasyon kalibrasyon standart yapmak için çözmek (ACN:0.1% TFA 30:70 =) ve ardından seyreltik 10 x. Kalibrasyon 1 μL standart slayt dört farklı yerlerde yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Moleküler Histoloji yazılımını kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), yer paylaşımı farklı Aβ peptidler SPs ve Arteryel duvarlarda colocalizing gibi çeşitli sinyallerini kayma korelasyon bulmak için birden çok tek görüntüleri.</li>
</ol>3. veri işleme
<ol><li>Spektral hizalama için tüm spectra seçili m/z listesine bir önceki yayın21kimden hizalayın.</li>
	<li>İstatistiksel analiz yazılımı maldı-IMS veri kümesi alma ( Tablo malzemelerigörmek) ile temel çıkarma.</li>
	<li>
Histolojik bilgiye dayalı faiz (ROIs) bölgelerinde iz.
	<ol>
<li>Tekdeğişirli çözümlemesi için ortalama yoğunluklarını, standart sapma, m/z değerleri colocalized discriminative m/z-işaretleri (ROC analizi), Hipotez testleri ve keşfi açığa çıkarmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir bölümleme Haritası oluşturun.
	<ol>
<li>Denetimsiz bir çok değişkenli analiz büyük veri kümeleri ve bileşen analizi temel eğilimleri çıkarım için uzamsal ayrılmasını gerçekleştirir.</li>
		<li>Anatomik ROIs parankimi ve subaraknoid boşluk gibi histolojik özelliklerine dayanarak seçin.</li>
		<li>Yapıları bireysel ROIs olarak atamak ve onları ile işlenmiş MS veri bölge görüntü ayrılmasını izin ilişkili peptidler tanımlamak için aralarındaki ilişkileri belirlemektir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kovacs, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathological+Classification+of+Neurodegenerative+Diseases%3A+Turning+towards+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17, E189(2016).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+genes%2C+proteins%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy.</a> Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).</li>
<li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).</li>
<li>Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+Alzheimer+disease-associated+neurofibrillary+pathology+using+paraffin+sections+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry.</a> Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).</li>
<li>Bateman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominantly+Inherited+Alzheimer+Network.+Clinical+and+biomarker+changes+in+dominantly+inherited+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).</li>
<li>Iwatsubo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+A+beta+42%2843%29+and+A+beta+40+in+senile+plaques+with+end-specific+A+beta+monoclonals%3A+evidence+that+an+initially+deposited+species+is+Abeta+42%2843%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43).</a> Neuron. 13, 45-53 (1994).</li>
<li>Reinert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+of+C-terminally+truncated+A%CE%B2+species+A%CE%B237+and+A%CE%B239+in+Alzheimer%27s+disease+and+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 24(2016).</li>
<li>Saido, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+and+differential+deposition+of+distinct+beta-amyloid+peptide+species%2C+A+beta+N3%28pE%29%2C+in+senile+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques.</a> Neuron. 14, 457-466 (1995).</li>
<li>Harigaya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+protein+starting+pyroglutamate+at+position+3+is+a+major+component+of+the+amyloid+deposits+in+the+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).</li>
<li>Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+amyloid+angiopathy.+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral amyloid angiopathy. A critical review.</a> Stroke. 18, 311-324 (1987).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+amyloidogenicity+and+pathogenicity+of+A%CE%B243%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43.</a> Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer%27s+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+tissue+content+of+soluble+beta+1-40+is+linked+to+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy.</a> The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).</li>
<li>Miyasaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+newly+deposited+tau+in+neurofibrillary+tangles+and+neuropil+threads%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+%26+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads.</a> Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).</li>
<li>Portelius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+brain+amyloid+beta+isoform+signatures+in+familial+and+sporadic+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).</li>
<li>Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+In-Source+Decay+Applied+to+the+Determination+of+Amyloid-Beta+in+Alzheimer%27s+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains.</a> ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).</li>
<li>Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+amyloid+beta+peptides+in+mouse+brain+sections+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).</li>
<li>Stoeckli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+MS+imaging+of+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">MALDI MS imaging of amyloid.</a> Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).</li>
<li>Kakuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+deposition+of+amyloid-%CE%B2+species+in+brains+with+Alzheimer%E2%80%99s+disease+pathology+visualized+with+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 73(2017).</li>
<li>Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+drainage+of+the+brain+and+the+pathophysiology+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease.</a> Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).</li>
<li>Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvasculature+changes+and+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer%27s+disease+and+their+potential+impact+on+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy.</a> Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).</li>
<li>Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+drainage+of+amyloid-beta+peptides+from+the+brain+and+its+failure+in+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).</li>
<li>Morris, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+basement+membranes+as+pathways+for+the+passage+of+fluid+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain.</a> Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).</li>
<li>Hawkes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+drainage+of+solutes+is+impaired+in+the+ageing+mouse+brain+and+in+the+presence+of+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy.</a> Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).</li>
<li>Kakuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).</li>
<li>Matsumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-Secretase+associated+with+lipid+rafts%3A+multiple+interactive+pathways+in+the+stepwise+processing+of+%CE%B2-carboxyl-terminal+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).</li>
<li>Morishima-Kawashima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+apolipoprotein+E+allele+epsilon4+on+the+initial+phase+of+amyloid+beta-protein+accumulation+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain.</a> The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).</li>
<li>Takami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-Secretase%3A+Successive+tripeptide+and+tetrapeptide+release+from+the+transmembrane+domain+of+%CE%B2-carboxyl+terminal+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).</li>
<li>Kakuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+%CE%B3-secretase+activity+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).</li>
<li>Carlred, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+amyloid-b+pathology+in+transgenic+Alzheimer%E2%80%99s+disease+%28tgArcSwe%29+mice+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada biz Aβ ve onun izoformlarının görselleştirme sonuçlarını ve detaylı bir iletişim kuralı üzerinden reklam ile birkaç autopsied beyin gösterdi ve CAA maldı-IMS ile. Aβs ifade profil büyük ölçüde N ve C-terminal çeşitleri Aβ1-42 değiştirildi. Aβ1-41 ilk tespit ve geçerli protokol ile insan beynindeki görüntülenir ve daha fazla IHC21ile doğrulandı. IMS tarafından yatırılan Aβ morfolojisi yüksek çözünürlüklü analiz (20 mikron) IHC ile iyi anlaşma olması gerektiğini düşünüyor, IMS ve IHC eşit Aβ mevduat onların konumu ve protein içeriği, yanı sıra onların morfolojisi ayırt için katkıda bulunur. Burada açıklanan tüm oksipital korteksi yapılan gibi farklı beta-amiloid türlerin yerelleştirme tüm beyin bölgeleri arasında eğitim gelecekteki deneyler geçerli iletişim kuralını kullanarak Genelleştirilmiş.
Kritik protokol içinde insan beyin dokularında toplanan proteinlerin etkili bir iyonizasyon elde etmek için doku hazırlık adımları adımlardır. Bir matris tabaka lazer enerjisini absorbe ederek, desorpsiyon ve analitler iyonlaşma ikna etmek için gereklidir. Bu süreçte, bir tüm doku bölümü homojen küçük kristallerle kaplı. Analit matrix ile homojen cocrystallization yüksek-duyarlı ve yapı içermeyen görüntüleme için önemlidir. Üç sprey yöntemlerin her biri kendi avantajları vardır. El ile sprey kaplama en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Pistole uygundur; Ancak, usta işlem gerektirir. Hassas ve tekrarlanabilir deneysel teknik gerekli olduğu gibi ultrasonik bir püskürtücü ve/veya otomatik bir püskürtücü geçerli iletişim kuralları'nda açıklandığı gibi kullanılması önerilir. Bir odanın içine püskürtülür çünkü ultrasonik bir püskürtücü ile ilgili olarak bu nem ve sıcaklık Oda tarafından etkilenir değil. Bu arada, otomatik bir püskürtücü ile iyi tekrarlanabilirlik ile nispeten korunmuş Uzaysal çözünürlük elde edilir. Genel olarak, üç yöntem artarak 1) airbrush, 2) otomatik cihaz ve 3) ultrasonik püskürtme sırasına göre elde edilen Uzaysal çözünürlük.
En önemlisi, bu protokolü ilk olarak algılayıp Aβs insan beyninin bakılırsa örneklerinde görselleştirmek için oluşturuldu. İnsan APP İsveç tipi mutasyon dayalı reklam hayvan bir model olarak oluşturulan görselleştirme maldı-IMS ile Aβs için APP23 fareler, daha önce başkaları tarafından bir varolan yöntem18,19ile bildirilmiştir. Ancak, APP23 için uygulanan eski protokol onun yanal çözünürlük ve hassasiyet Aβ görselleştirmek için yeterli değildi. Önceki işleri yüksek Aβ konsantrasyonlarda doku sınır dışında açıkça APP23 ile onların iletişim kuralı18,19görüntüleme aktarımında açıklanmıştır. Yani sözde 'gerçek SPs ve IMS arasında matris ayıklama adım nedeniyle görüntü Bulanıklığı' maldı-tipi görüntüleme ile kaçınılmazdı. Ancak, geçerli protokolündeki görüntü kayboldu ve her spektrum beyin parankimi tek her SP temsil.
Burada gösterildiği gibi biz reklam ilk kez Aβ1-41 izleyebilirsiniz ve CAA beyin maldı-IMS yanı sıra IHC, spesifik bir antikor kendi üretimi21tarafından. Aβ1-41 Aβ1-45 türeyen γ-secretase kademeli bölünme27,28,29,30',31 iken Aβ işleme modeline göre Aβ1-45 ile Aβ1-42, Aβ1-38 türer . Bu geçerli protokol bu model desteklediği anlamına gelir. Bu teknik sınırlamalar gelince, biz insan otopsi beyin örneklerinden heterojen göz önünde bulundurulmalıdır. Bir anlamda, en kritik adım nitelikli otopsi beyin dokusu ile etik kanıt değerlendirmek etmektir. Tam otopsi beyin dokuların geçerli protokol ile maldı-IMS ayrı ayrı birden çok değişiklikler yanı sıra henüz olacaksın düzenleyen reklam, patogenezi bilinmeyen factor(s) sahip karmaşık molekülleri tüm dağıtım izleyebilirsiniz tanımlı. Ayrıca, yaşlı insan beynindeki çeşitli nevropatoloji genel patogenezinde anlamakta, nörolojik hastalıklar, genetik, klinik ve patolojik gözlemleri ile standart bir yaklaşım olarak maldı-IMS benimsemeye uygun olmalı .
Başka bir kritik maldı-IMS elde edilen veri kümesinden veri madenciliği işlemi her zaman zaman alıcı olduğu adımdır. El ile veri madenciliği her tepe dağıtım her görüntüyü tıklatın ve analiz örnek morfolojisi ilişkilendirmek dağıtımları arayın açmasını gerektirir. Otomatik uzamsal ayrılmasını madencilik, veri kümesinin bir özetini sağlar ve belirgin özellikleri hızlı algılama sağlayan veri ilk adımı olarak kullanılabilir. Bu yaklaşım, belirli bir bölge spectra arasındaki benzerlikler istatistiksel olarak belirlenir ve benzer spectra bir küme gruplandırılmıştır. Tüm pikseller onların küme atama (şekil 5) göre renk kodlu. Reklam/CAA çalışmanın, ilgi alanı Aβ işlemimiz parenkima plak ve subaraknoid ve parenkimal vasküler yapılar alanıdır. Daha fazla IHC ile doğrulanmış iki farklı zirveleri Aβ1-40 ve Aβ1-4221m/z değerleri vardı. Böylece, colocalized m/z Aβ1-40 ve N C terminali için ek açıklama eklenen kesilmiş Aβ yanı sıra daha fazla çözümleme için bilinmeyen peptidler zaten Aβ1-42 ile bulmak kolaydır.
Weller ve meslektaşları Aβ çevresinde21damarları daha fazla arterler etrafında damar duvarlarında birikir bildirdin. İnterstisyel sıvı (ISF) lenf nodu yolu ile için bir Perivasküler drenaj yolu22,23,24,25 beyin parankimi atılır Aβs içerir önerilmiştir Ayrıca, ,26. CAA için reklam21 ' önemli ölçüde katkıda Perivasküler drenaj yolları (şekil 5), beynin olası varlığı 20 µm çözünürlükte maldı-IMS veri kümesini temel alan bir bölümleme harita oluşturmak için geçerli protokolü destekler , 32. Ayrıca, plak ve subaraknoid damarlara ile korelasyon her m/z değerlerini hesaplayarak colocalized işaretçisi proteinler keşfedebilirsiniz. Yaşlı insan beynindeki çeşitli nevropatoloji genel patogenezinde anlamakta, klinik, genetik kurulan IHC veri ile birlikte güçlü bir yaklaşım olarak maldı-IMS ve nörolojik olarak patolojik gözlemlere benimsemeye uygun olmalıdır hastalıklar.

Tanı yapmak için ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anlamak için hassas moleküler patolojik mevduat gerekli1tanımlamasıdır. Reklam sırasında Aβ SPs beyin parankimi yapmak için üretilen ve damarlarının yatırılır çok önce hastalık başlangıcından2,3,4,5,6. Aβ1-42 AD beyin SP baskın peptid olmakla birlikte, N-terminal veya C-terminal gibi diğer Aβ türevleri kesildi veya Aβs değiştirilmiş, aynı zamanda etkilenen reklam beyin7,8,9'tespit, 10. Tam bir resim insan beynindeki geniş Aβ dizi türlerin özellikle reklam ve serebral amiloid angiopathy (CAA)11, yardımcı olacaktır Aβ üretim, metabolizma ve ifade anlamak bilim adamları.
Nevropatoloji klasik yaklaşım, immünhistokimya (IHC) beyin dokuları12,13,14,15Aβs konumunu belirlemek için en kesin yöntem olmuştur. Genel olarak, ne zaman aynı anda çeşitli epitopları arada IHC molekülleri ayırt edemez. Buna karşılık, ortaya çıkan bir kütle spektrometresi tabanlı proteomik analiz özellikle Aβ türler antikorlar16,17ile ayrıştırılan beyin dokularında çeşitli analiz etmek için değerli bir yaklaşımdır. Beyin lysates ve immün çöktürülmüş örnekleri geleneksel kütle spektrometresi tabanlı analizi küçük Aβ peptidler algılamak başarısız olur ve Aβ dağıtım bilgileri beyin dokusu içinde kaybeder.
Önceki eserlerinde Aβ mevduat fare beynindeki görselleştirme reklam, APP23 gibi bir transgenik hayvan modelini kullanma başarılı olmuştur. Ancak, bu işlem hala teknik gelişmeler ile ilgili olarak çözünürlük ve hassasiyet18,19,20IMS ve IHC karşılaştırmak gerekir. Reklam nevropatoloji insan beyin eğitimi aldı ve biz maldı-IMS teknoloji insan otopsi beyin dokuları üzerinde kapsamlı protein eşleme21elde etmek için kullanılır. Bu amaçla, biz onun hız, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik avantajları vardır kütle spektrometresi gelişmiş bir tür için bir iletişim kuralı geliştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>İndiyum kalay oksit (ITO) kaplı mikroskop cam slayt</td><td>Bruker Daltonics</td> <td># 237001</td><td></td></tr><tr><td>Blade (tek kullanımlık)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td> <td># 117394</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Bileşik</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td>FSC 22 Mavi</td><td></td></tr><tr><td>Tarayıcı</td><td>EPSON</td><td>GT-980</td><td></td></tr><tr><td>Hava Fırçası</td><td>GSI Creos</td><td>PS274</td><td></td></tr><tr><td>Kompresör</td><td>MRHOBBY</td><td>Mr.Linear kompresör L5</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik püskürtücü</td><td>Bruker Daltonics</td><td>ImagePrep</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik püskürtücü</td><td>HTX Technologies</td><td>TM Püskürtücü</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Ultra yüksek hızlı MALDI cihazı</td><td>Bruker Daltonics</td><td>rapifleX MALDI Tissuetyper</td><td></td></tr><tr><td>MALDI kontrol yazılımı</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexControl 3.8</td><td></td></tr><tr><td>Veri analiz yazılımı</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexImaging 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler histoloji yazılımı</td><td>SCiLS, Bremen, Almanya</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>İstatistiksel yazılım</td><td>SCiLS, Bremen, Almanya</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Sinapinik asit (SA)</td> <td>Nacalai tesque</td><td>30494-91</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-Siyano-4-hidroksil-sinnamik asit (CHCA)</td> <td>Wako</td><td>037-19261</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrasyon standardı</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş anti-fare IgG antikorları</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile anti-tavşan IgG antikorları</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin ve biyotinile HRP kompleksi.</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kiti</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidin (DAB)</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kiti</td><td></td></tr></tbody></table>

amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi imaging ile insan beynindeki görselleştirme

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Alzheimer hastalığı (Ah) nevropatoloji birikimi ve amiloid β (Aβ) peptidler toplama içine beyin hücre dışı plaklar ile karakterizedir. 40 amino asitleri, oluşan Aβ peptidler amiloid habercisi proteinler (APP) β - ve γ-secretases tarafından oluşturulur. Aβ sadece beyin parankimi zamanda leptomeningeal ve serebral damar duvarları, serebral amiloid angiopathy (CAA) bilinen yatırılır. Aβ peptidler çeşitli tespit edildi iken, detaylı üretimini ve dağıtımını bireysel Aβ peptidler reklam patolojik dokularda ve CAA değil tam olarak ele. Burada, bir protokol matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) kapsamlı protein eşleme elde etmek için insan otopsi beyin dokuları üzerinde geliştirmek. Bu amaçla, insan kortikal numuneler Tokyo Metropolitan Gerontoloji Enstitüsü, beyin bankadan elde edilmiştir. Donmuş cryosections kes ve indiyum-teneke-oksit (ITO) transfer-kaplı cam slaytlar. Spectra elde maldı sistemini kullanarak uzamsal çözünürlük ile ilâ 20 µm. Sinapinic asit (SA) düzgün yatırılır ya otomatik ya da el ile bir püskürtme kullanarak slayt üzerinde. MALDI-IMS geçerli teknik avantajları ile çeşitli Aβ tür aynı bölümleri içinde insan beyni bakılırsa tipik bir veri kümesi belirli probları elde edilebilir. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü (20 µm) görüntüleme bir reklam beyin ve şiddetli CAA örnek açıkça gösterir iken Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak (SP) tevdi tevdi Aβ1-36 Aβ1-41 leptomeningeal damarlarının. Reklam, CAA, patoloji anlamada, genetik, klinik ve patolojik gözlemleri ile birlikte standart bir yaklaşım olarak maldı-IMS benimsemeye uygun ve diğer nörolojik hastalıklar üzerinde mevcut strateji tabanlı.

CAA olan sporadik reklam hastalar (n = 5; Yani yaş 83.2 = y) ve Senil plak ücretsiz (SP O) ve CAA olan bireylerde yaşlı (n = 5; Yani yaş 77.2 = y) idi (Tablo 1) analiz. CAA fenotipleri hastanın #3 Bu çalışmada en önemli. Aβ1-40 ve Aβ1-42 mevduat #3 hastadan beyin dokusunda dağıtımları maldı-IMS ile (şekil 1) görüntülenir. Şekil 1' de gösterildiği gibi (#9 ve #10 hasta) nonpathological denetim beyinlerinde hiçbir önemli sinyaller vardı. Burada, maldı-IMS açıkça Aβ1-42 tercihen beyin parankimi SPs yatırılır görüntülenir. Buna karşılık, Aβ1-36 1-41, gibi daha kısa Aβs tercihen leptomeningeal vasküler alanları (şekil 1) tevdi.
Dağılımları, Aβ40 ve Aβ42 daha fazla dokuları bitişik donmuş bölümleri kullanarak IHC ile doğrulanmış. Anti-Aβ40 antikor için dağıtım Aβ42 beyin parankimi, SPs olarak açık aksine olan CAA şekil2B (oklar), etiketli. Aβ1-41, insan beyni bu parçayı bulmak için ilk sırada ve Aβ41 Aβ40 andAβ4221ayırt belirli antikor oluşturmuş.
MALDI-IMS Uzaysal çözünürlük genellikle üzerine geliştirilmiş için en önemli faktördür. Şekil 1 ve Şekil 2 maldı-IMS 100 µm pitch çözünürlük ile göstermek ve bir genel dağıtım profili için nispeten geniş alan21elde edilir. Tam olarak subaraknoid alanı damar yapısı dahil olmak üzere, amiloid birikimi tanımlamak zordur. İnce doku yapıları subaraknoid gemilerin ve korteks yüzeyine canlandıracak yüksek çözünürlüklü maldı görüntüleme (40 µm: şekil 3; 20 µm: şekil 4 ve şekil 5) gerçekleştirildi. Sonuç olarak, maldı-IMS IHC ile karşılaştırılabilir olduğu gibi Aβ1-36 1-41, daha kısa Aβs arterler, duvarlarda dağıtılır sergilenmez.
MALDI-IMS gösterdi Aβx-40 ve Aβx-42 detaylı Dağılımları (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 11pE) reklam orta CAA beyin ile eşlik etti. Aβx-40 tür Aβ1-40'a benzer bir dağıtım profili gösterdi, örneğin, Aβ1-4221farklı dağıtım desenle Aβx-42 türler gösterdi. Geçerli iletişim kuralı tarafından bireysel Aβ peptidler maldı-IMS ile gözlenen görüntülerini tek iyon Aβ türler için atanır. Buna karşılık, görüntü veri denetimsiz çok değişkenli istatistik kullanarak görüntü segmentasyonu tanımsız proteinlerin daha fazla çözümleme için ilgi anatomik bölgelerin elde etmek için soruşturma olması satın aldı. Bir bölümleme harita aynı bölüme hasta #321uygulanan bisecting bir k-anlamına gelir analizi ile elde edilen şekil 5 gösterir. Bu kümeleme yöntem başarıyla parankimi ( şekil 5Ciçinde mavi) plak benzeri yapılar ve subaraknoid boşluk ( şekil 5Ciçinde yeşil) vasküler yapılar tespit edilmiştir. Sadece küçük bir arteriyol parankimi yanı sıra subaraknoid boşluk ( şekil 5Ciçinde mor) etrafında algılanan parankimi küçük dairesel bir alan bulmak ilginçtir. Bu rakam 5 dbu bireysel Aβ peptidler görüntülerini tek iyon tarafından doğrulanır-5F.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig1.jpg"> Şekil 1: maldı-IMS donmuş bir AD/CAA, beyin bölümü. Çeşitli C-terminal kesildi Aβ peptidler şiddetli CAA (hasta #3) eşlik eden reklam görselleştirildiği denetimleri (hasta #9 hasta #10 tüm görüntüleri sol ve sağ) ve sol kapı aynası sağ panelde. #3, denetim hastalarda sinyal yok iken (durumlarda #9 ve #10) beyin diye Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak yatırılan iken Aβ1-36 Aβ1-41 tercihen leptomeningeal kan damarlarının yatırılır. Çözünürlük = 100 mikron. Ölçek çubuğu 5 mm =. Bu rakam, Kakuda ve ark.21izinle değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig2.jpg"> Şekil 2: maldı-IMS donmuş reklam/CAA, beyin bölümleri ve oksipital korteksi reklam beyin üzerinden bitişik bölümlerinin. (A - C) dondurulmuş reklam/CAA beyin bölümleri ve oksipital korteksi reklam beyin üzerinden bitişik bölümlerinin (D ve E) bağışıklık lekeli ve arteriyol ve Aβ40 karşı antikor kullanarak beyin parankimi odaklı (D: BA27) veya Aβ42 (E: anti-Aβ42 poliklonal). Her iki analizleri Aβ40 tercihen leptomeningeal kan damarları (oklar panelinde D)ve arteriyoller subaraknoid boşluk ve CAA oluşturan beyin parankimi yatırılır gösterdi. Buna ek olarak, Aβ42 esas olarak SPs içinde yatırılır. IMS, çözünürlük için 100 mikron =. Ölçek çubuğu 5 mm (A, Bve C) = 5 mm, 500 (D ve E) =. Bu rakam, Kakuda ve ark.21izinle değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig3.jpg"> Şekil 3: MALD-IMS donmuş reklam/CAA, beyin bölümleri (hasta #3) 40 µm çözünürlükte. Çeşitli C-terminal ve N-terminal kesildi ve şiddetli CAA (hasta #3) eşlik eden reklam Aβ peptidler değiştirilebilir. Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak yatırılan iken Aβ1-36 Aβ1-41 tercihen leptomeningeal kan damarlarının yatırılır. Ölçek çubukları = 1 mm (A-B), 2 mm (sol üst). Çözünürlük = 40 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig4.jpg"> Şekil 4: maldı-IMS donmuş reklam/CAA, beyin bölümleri (hasta #3) 20 µm çözünürlükte. Bu panel çeşitli C-terminal ve N-terminal kesildi ve şiddetli CAA (hasta #3) eşlik eden reklam Aβ peptidler değişiklik gösterir. Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak yatırılan iken Aβ1-36 Aβ1-41 tercihen leptomeningeal kan damarlarının yatırılır. Ölçek çubukları 200 mikron (a, b, c), = 1 mm (sol üst). Çözünürlük = 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig5.jpg"> Şekil 5: maldı-IMS donmuş bir reklam beyin bölümü tarafından elde edilen bölümleme harita ortaya koymaktadır sözde Senil plak, büyük subaraknoid damar yapıları ve küçük parenkima arteriyoller. (A)bölümleme harita elde maldı-IMS verileri bir çok değişkenli görüntü analizi. (B) Bisecting k-tabanlı kümeleme analizi plak benzeri ve gemi benzeri yapıları Oksipital kortekste tanımlanan anlamına gelir. Kümeleri ve kümelendirilebilir ve ilişkilerini düğümleri olarak (e.g.,1-0-0) gösterilir. (C) farklı Aβ peptid yerelleştirme desenleri andıran plaklar (mavi), subaraknoid gemiler (yeşil) ve arteriyol (kırmızı) yapıları. Not bir kaç kırmızı kümeleri subaraknoid boşluğa da dağıtılır. Bu bu bireysel Aβ peptidler 20 µm çözünürlükte görüntülerini tek iyon tarafından doğrulanır: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41 ve (F) Aβ 1-42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dava</td>
			<td>Cinsiyet</td>
			<td>Ölüm yaş</td>
			<td>Braak SP</td>
			<td>CAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>M</td>
			<td>88</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>C</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>EY</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>EY</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>M</td>
			<td>70</td>
			<td>EY</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>M</td>
			<td>73</td>
			<td>EY</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>M</td>
			<td>81</td>
			<td>EY</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: reklam klinik ve patolojik veri CAA durumları ve yaşlı SP O konular ile. İnsan kortikal örnekleri IMS ve IHC Tokyo Metropolitan Enstitüsü Gerontoloji beyin bankada elde. Her beyin numune beş reklam hasta ve beş yaş eşlemeli denetimlerin korteks oksipital çekildi. Aβ Monoklonal antikor tarafından gösterildiği gibi amiloid birikimi ölçüde Braak SP (amiloid) aşamaları tarafından tanımlanmıştır. O aşamada isocortex boyunca Senil plak hemen hemen yok orada. C aşamada hemen hemen tüm isocortical alanlar etkilenir. Reklam beyin C. aşamada değişmez Bu tablo izni Kakuda vd21ile değiştirildi.

Moleküler görüntüleme matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) ile birden çok analitler eş zamanlı haritalama biyolojik örnekleri sağlar. Burada, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid angiopathy örnekleri maldı-IMS kullanarak beyin dokuları algılama ve görselleştirme amiloid β protein için bir iletişim kuralı mevcut.

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Makalemizin ana katkısı, MALDI görüntüleme kitle spektrometresi görüntüleme teknolojisi ile Alzheimer hastalığı beyninin amiloid beta patolojisinin kesin ve ince bir manzarasını incelemiş olmamızdır. Doku slaytlarının formik asit ön tedavisi ile özel bir protokol oluşturarak teknolojik gelişmelere ulaştık. MALDI-IMS'den sonra segmentasyon haritaları oluşturulur ve plak ve subaraknoid vaskülatür ile birlikte lokalize yeni marker proteinleri veya peptidleri keşfetmek için hesaplamalar yapılır.Ölümden sonra sekiz saat içinde eksi 80 derecede çıkarılan, işlenen ve depolanan beyinlerden IMS için insan kortikal örnekleri alın. AD hastalarının oksipital korteksve yaş uyumlu kontrollerden beyin örneğini alın. Bir kriyostat üzerinde doku bölümleri kesmek için, ilk gıyonluk içinde iletken indiyum tin oksit veya ITO kaplı mikroskop cam slaytlar yerleştirin.Otopsi beyin örneğini eksi 80 santigrat dereceden kriyostat içinde eksi 22 santigrat dereceye ısıtın. Her deney için kriyostat'a yeni bir tek kullanımlık bıçak takın. Her zaman bıçağın temiz bir parçasını kullanmaya çalışın.Dondurulmuş otopsi beyinlerini az miktarda optimum kesme sıcaklığı bileşimiyle birlikte sahneye koyun. IMS ve immünohistokimya için, her doku örneğinden beş ila altı bölüm kesti. Bıçak dokuyu kesmeye başladığında, tekerleği çevirin ve tüm doku açığa çıkana kadar bloğa dönün.Bölümde küçük bir çizgi veya yırtık varsa, sıcaklık ayarı otomatik olarak düzeltene kadar kriyostat'ta bekleyin. Anti-roll'u altında bir doku yla açmadan önce birkaç saniye sayın. Doku dilimini hemen cam kaydıranın İTO kaplı tarafına yerleştirin.ITO kaplamalı olmayan tarafta ki kaydırağın altına bir parmak koyarak doku dilimini eritin. Doku slayta yapışacak. Hiçbir kırışıklık ları ile doku mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun.Doku bölümlerini durulamak için, endojen lipidleri ve inorganik tuzları çıkarmak için numuneleri cam boyama kavanozuna 30 saniye boyunca %70 etanol mililitreye batırın. Metin protokolünde listelenen yıkama sırasını kullanarak örnekleri yıkayın. Daha sonra numuneleri 30 dakika vakumla kurulayın.Şimdi, otopsi beyin dokusundan amiloid beta proteinlerinin daha iyi iyonizasyonu için doku bölümlerini formik asit buharı ile tedavi edin. Bunu yapmak için, 60 santigrat derece fırın ve% 100 formik asit beş mililitre ile bir kuluçka cam çanak hazırlayın. Hava nemini kuluçka cam çanağı doygunluk seviyesinde tutun.Formik asit daldırma önlemek ve altı dakika tedavi ederken kuluçka cam çanak doku slaytlar yerleştirin. Film tarayıcısı, jel tarayıcı veya dijital mikroskop kullanarak örneklerin optik görüntüsünü alın. Bu adımı oda sıcaklığında gerçekleştirin.Numune hedefi cihazın içine yerleştirildiğinde numunelerin optik görüntüsünün hizalanması gereklidir. Genellikle, matris tabakasının altındaki doku bölümünü tanımak mümkün olmayacaktır. Optik görüntüleri örneklerle ilişkilendirmek için, hem optik görüntüde hem de kamera optikindeki matris katmanının altında görünen kılavuz işaretleri yapın.En kolay yolu optik görüntü almadan önce örnek etrafında en az üç düzeltme sıvı sıyrık işaretleri nokta etmektir. Bir ultrasonik püskürtücü ile matris sprey için, desiccator püskürtülür ve odasına yerleştirin doku çıkarın. Dokunun sensör penceresini kaplamadığından emin olun.Başlat düğmesine basarak hazırlık başlatın. Genellikle hazırlık süresi 90 dakika civarındadır. Hazırlık matris tabakası kalınlığı ve ıslaklık izlenmesi ile otomatik olarak düzenlenir.Alternatif olarak, matris çözeltisini otomatik püskürtücü ile doku yüzeyine püskürtmek için, matris çözeltisini teslim etmek için dakikada 10 psi ve 0,15 mililitre olarak ayarlanmış bir çözücü pompa sistemi kullanın. Isıtılan kılıf gazının sabit bir akışı matris çözeltisi spreyi ile birlikte teslim edilecektir. MALDI-IMS ile yüksek iş yapma ve yüksek mekansal çözünürlükte görüntüleme deneyleri yapın.Kütle spektrometresi ölçümü için MALDI kontrol yazılımı ve veri analiz yazılımını kullanarak doku alanlarını tanımlayın. 2, 000-20, 000 ve 20 ve 100 mikron uzamsal çözünürlüğe sahip pozitif doğrusal modda spektrum elde edin. Kalibrasyon standardını sağlamak için, peptit kalibrasyon standardını ve protein kalibrasyon standardını CHCA ve TA30 çözeltisi ile 1-4 oranında çözünve 10 kez seyreltin.Dört farklı konuma slaytüzerinde kalibrasyon standardı bir mikrolitre yerleştirin. Moleküler histoloji yazılımı kullanarak, senil plaklar ve arteriyel duvarlarda kolokalize farklı amiloid beta peptidler gibi çeşitli sinyallerin mekansal korelasyon bulmak için birden fazla sinyal görüntüleri bindirme. Bu çalışmada üç numaralı hastanın serebral amiloid anjiyopatisi veya CAA fenotipleri en belirgin olarak görüldü.Bu hastanın beyin dokusunun MALDI-IMS açıkça amiloid beta 1-42 ve amiloid beta 1-43 tercihen serebral parankim de senile plaklar olarak yatırıldı görselleştirilmiş. Buna karşılık, amiloid beta 1-36-1-41 gibi kısa amiloid betalar tercihen leptomeningeal vasküler alanlarda birikti. Patolojik olmayan kontrolde önemli bir sinyal yoktu.Amiloid beta 1-40 ve amiloid beta 1-42 dağılımları dokuların komşu dondurulmuş bölümleri kullanılarak immünohistokimya ile doğrulandı. Anti-amiloid beta 1-40 antikor CAA etiketli ve ortaya amiloid beta 1-40 tercihen leptomeningeal kan damarlarında yatırılır, hangi senil plaklar olarak serebral parenkim amiloid beta 1-42 dağılımı açık kontrast. Burada gösterilen bir segmentasyon haritası hasta üç numaralı aynı bölüme uygulanan bir bisecting k-ortalama analizi ile elde edilir.Bu kümeleme yöntemi, subaraknoid alanda parankim ve vasküler yapılarda plak benzeri yapıları başarıyla tanımlayabilmiştir. Bu parankim sadece parankim küçük bir arteriyol etrafında tespit edilir parankim küçük bir dairesel alan bulmak için ilginç yanı sıra subaraknoid alanda. Bu bireysel amiloid beta peptidlerin tek iyon görüntüleri ile doğrulanır.Belirli antikorlar kullanıyor olsa bile aynı anda amiloid betas geniş bir yelpazede izlemek için bir sınırı vardır. Burada, son teknoloji MALDI görüntüleme kütle spektrometresi yöntemini kullanarak insan beyninde amiloid beta dağılımını gösteriyoruz. Bu rapor insan otopsi beyinlerinde amiloid beta proteinlerinin tam set karakterizasyonu sunuyor, çünkü bu katkı Alzheimer hastalığı araştırma atılım yapar inanıyoruz.En etkileyici bulgu, amiloid beta proteininin C terminalinde sadece tek bir amino asit değişiminin dağılımlarında köklü bir değişiklik yaptığıdır. Doku hazırlama adımları insan beyin dokusunda toplanan proteinlerin etkili bir iyonizasyon elde etmek için önemlidir. Yüksek duyarlılık ve artifakız görüntüleme için çok önemli matrisler ile analithomojen cocrystallization.

visualization-amyloid-deposits-human-brain-with-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nanoparçacıkların hücre biodistribution değerlendirmek için kullanılan bio-görüntüleme yöntemleri, nanoformulated bileşikler tedavi ve teşhis izleme için geçerlidir. Burada açıklanan yöntemler, histolojik coregistration tarafından değerlendirilir, hassas ve özeldir. Metodolojileri kemirgen insan uygulamaları bir translasyonel yol sağlar.

Teşhis ve Tedavi İzleme Nanomalzemelerin Kayıtlı bio

Dopamin değiştirme farmakoterapi L-DOPA ile Parkinson hastalığının en yaygın olarak kullanılan semptomatik tedavi, anormal istemsiz hareketleri olarak adlandırılan diskinezi dahil olmak üzere, yan etkileri ile...

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

Video, Matris destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Görüntüleme Kütle Spektrometresi (MALDI-IMS) kullanılarak amiloid-beta (Aβ) peptitlerinin birikimini analiz etmek için Alzheimer hastalığı hastalarından insan kortikal beyin dilimlerinin hazırlanmasına yönelik bir prosedürü göstermektedir. Adımlar, slaytların hazırlanmasını, iyonlaşmayı arttırmak için dokunun işlenmesini ve amiloid-beta peptitlerin uzamsal dağılımının analiz edilmesini içerir.

İnsan Kortikal Beyin Dilimlerinde Amiloid-Beta Peptitlerin Görselleştirilmesi

Kaynak: Bisht, K., et. al. β-Amiloid Plaklarla Mikroglial Etkileşimleri İncelemek için İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu. J. Vis. Uzm.  (2016) Bu video, Alzheimer hastalığı fare beynindeki Metoksi-X04 etiketli amiloid plaklarının görselleştirilmesini ve haritalanmasını göstermektedir. Alzheimer patolojisini incelemek için plakların anatomik yapılarla hassas korelasyonunu sağlayan floresan ve parlak alan mikroskobu kullanan bölümler.

Alzheimer Hastalığı Fare Beyni Bölümünde Metoksi-X04 İşaretli Amiloid Plaklarının Görselleştirilmesi ve Haritalanması

Bu yazının uzunlamasına iki foton mikroskopi kullanılarak in vivo amiloid plak birikimi sırasında cerebrovasculature bir biçimlenme izlemek için bir yordam açıklanır. Incelmiş kafatası preparat, Alzheimer hastalığının bir fare modelinde serebrovasküler hasara ilerlemesini değerlendirmek için floresan boyalar görselleştirme sağlar.

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi kullanılarak gangliosidlerin tespiti için DAN matrisinin sıçan beyin dokusu üzerine süblimleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Amiloid birikimi farklı hastalıklar özelliğidir ve birçok farklı organları afflicts. Bu kağıt Işıksaçan konjuge oligothiophene floresan Floresans mikroskobu teknikleri ile birlikte boyama uygulaması açıklanır. Bu boyama yöntemi algılama ve klinik ve bilimsel kurulumları protein toplamları keşfi için güçlü bir araç temsil eder.

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Bu protokol, beyin bağışı programı ve beyinlerin doğru karakterizasyonu yoluyla bireysel beyin yaşlanma yörüngelerini izlemek için bir yöntem açıklar. Beyin bağışçıları seri çok boyutlu değerlendirmeler de dahil olmak üzere uzun vadeli bir uzunlamasına çalışmada yer almaktadır. Protokol beyin işleme ve doğru bir tanı metodolojisi ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Abbiategrasso Beyin Bankası Toplama, İşleme ve Yaşlanma Beyinleri Karakterize için Protokol

Beyin organoidlerinin kütle spektrometresi görüntülemesi (MSI) için bu modeller içindeki metabolit dağılımlarının haritalanmasına izin veren gelişmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Bu teknoloji, erken gelişim sırasında ve hastalıkta beyin metabolik yolları ve metabolit imzaları hakkında bilgi sunarak insan beyninin işlevinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını vaat ediyor.

İnsan Beyni Organoidlerinin Kütle Spektrometresi Kullanılarak Moleküler Görüntülenmesi 

Bu protokol, floresan kılavuzlu, tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometresi için mikroMS kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve birincil sıçan nöronal hücrelerinin gelişmiş moleküler profilini çıkarmayı sağlar.

Bireysel Sıçan Nöral Hücrelerinin Lazer Kaynaklı Postiyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Floresan Kılavuzluğunda Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon

Bu protokol, kütle spektrometrisi görüntüleme kullanılarak hem glikojen hem de N-bağlantılı glikanların titiz ve tekrarlanabilir ölçümünü mümkün kılan temel adımları detaylandırır.

Glycome'in Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Mekânsal Moleküler Görüntülemesi

Keşfedin, MALDI-IMS ile insan beyninde amiloid β birikimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi yöntemini. Formik asit ön işleme protokolü, plak ve damar yapılarındaki farklı peptit dağılımlarını ortaya koyar.

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

Daha fazla video keşfet