MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Bu süblimasyon protokolünün genel amacı, MALDI görüntüleme kütle spektrometresi deneylerinde gangliosidlerin tespiti için ayrıntılı, takip etmesi kolay bir numune hazırlama süreci sağlamaktır. Bu yöntem, hem sağlıklı beyinde hem de beyin patolojisinde gangliosidlerin anatomik dağılımı ve işlevi de dahil olmak üzere nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, protokolde çok az değişiklik yapılarak birçok lipid türünün yüksek kaliteli görüntülenmesi için uyarlanabilmesidir.

Bu prosedüre başlamak için, sıçandan beyin dokusunu çıkarın ve metin protokolünde açıklandığı gibi kriyostata hazırlanın. Ardından dokuyu kriyostata yerleştirin. Dokuyu istenen anatomik konuma kadar bölümlere ayırın.

Kesme kalınlığının sekiz ila 12 mikron arasında olduğundan emin olun. Kriyostat viraj denge çubuğunu kullanarak, düzleştirilmiş doku bölümünü yavaşça bölümlere ayırın. Takla çubuğu yerleşimi yanlışsa veya bıçak körelmişse doku üzerinde delikler veya işaretler oluşabilir.

Temiz boya fırçaları kullanarak dokuyu dilimleme platformunun ortasına taşıyın. Dokuyu haritalamak için, iletken slaytları veya metal plakaları dilimleme sırasında kriyostata yerleştirerek dondurun. Slayt tamamen donduğunda, temiz boya fırçaları kullanarak kesit dokusunu dikkatlice slaydın iletken servisine taşıyın.

Tüm doku bölümü slayt üzerinde doğru bir şekilde yerleştirildikten sonra, dokunun karşısındaki sürgünün altına bir parmağınızı yerleştirin ve bölüm çözülene kadar bastırın. Daha sonra slaytları doku ile beş ila 10 dakika boyunca bir kurutucuya yerleştirin. Alternatif olarak, ılık bir slayt kullanın ve iletken tarafı aşağı bakacak şekilde düzleştirilmiş doku bölümlerine doğru hafifçe bastırın.

Çeker ocakta çalışırken, alüminyum bir kap içinde bir kum banyosunu bir ocak gözü üzerine yerleştirin. Ocak gözü, uygun yüzey alanına sahip metal bir makaslı platform üzerinde olmalıdır. Ocak gözünü açın ve sıcaklığı 140 santigrat dereceye ayarlayın.

Deney boyunca kum sıcaklığını izlemek ve sıcaklık tutarlılığını sağlamak için sıcaklık geri besleme probunu kullanın. Ardından, süblimasyon aparatının alt yüzeyine 300 miligram DAN matrisi yerleştirin. Matrisi, aparatın ortasındaki düz bir tabaka halinde, süblime edilen sürgünün yaklaşık genişliğine ve uzunluğuna kadar yayın.

Cihazın iç yüzeyine, plaka kondansatörün tabanı ile doğrudan temas edecek şekilde metal bir plaka yerleştirin. Boş bir test slaytını, sürgünün dış kenarlarına yerleştirilmiş bir bantla metal plakanın yüzeyini çapraz olarak geçecek şekilde bantlayın. Tam sızdırmazlığı sağlamak için cihazın üst ve alt kısımlarını ortada kauçuk bir O-ring ile bağlayın.

Cihazın ortasına metal bir U-mafsal yerleştirin ve aparatın üst ve alt yarısı birbirine sıkıca kapatılana kadar mengeneleri sıkın. Ardından cihazı kum banyosu ile ilgili metal O-ringe yerleştirin. Ardından, kondansatöre bir avuç kırılmış buz koyun.

Buz sulu karı oluşturmak için kondansatörün dörtte biri ila yarısı kadar soğuk suyla doldurun. Buz rüşvet, aparatın içindeki metal plakayı soğutacak ve ardından sürgü üzerine yapışacaktır. Sıcaklığın sabit bir duruma ulaşması için en az beş dakika bekleyin.

Daha sonra soğuk tuzak kabına 300 mL metanol dökün ve cam eşyaları kabın içine yerleştirin. Kauçuk boru kullanarak vakum pompasını soğuk tuzak çıkışına bağlayın. Soğuk tuzak girişini süblimasyon aparatına bağlamak için başka bir lastik boru parçası kullanın.

Borunun metal kelepçeler kullanılarak sıkıca sabitlendiğinden emin olun. 30 ila 50 militorr'luk bir vakum sağlamak için vakum pompasını kullanın. Basınç dengelemesi için pompaların en az beş dakika çalışmasına izin verin.

Soğuk tuzak kabının dibindeki etanolün içine iki ila üç küçük kuru buz parçası bırakın. Soğuk tuzak, matris parçacıklarının vakum pompasında birikmesini önlemeye yardımcı olur. Süblimasyon aparatının U halkasındaki mengenelerin, aparattaki basıncın azalması nedeniyle vakum pompası açıldıktan sonra sıkılması gerekebilir.

Kum banyosu sıcaklığının 140 santigrat derecede sabitlendiğinden emin olun. Ayrıca vakumun açık olduğunu ve cihazın, tüm borular bağlı olarak kum banyosunun üzerindeki metal O-ringe sabitlendiğini kontrol edin. Zamanlayıcıyı yedi dakikaya ayarlayın ancak zamanlayıcıyı başlatmayın.

Süblimatörün U-eklemi metal O-ringin oldukça üzerine gelene kadar makas kaldırıcıyı ve kum banyosunu süblimasyon aparatına kadar yavaşça kaldırın. Bu ekstra alan, aparatın kum üzerinde ayarlanmasına izin verir. Cihazın kum üzerinde eşit şekilde oturduğundan emin olmak için süblimatörü kum yüzeyine hızlıca bastırın.

Ve sonra, hemen zamanlayıcıyı başlatın. Zamanlayıcı çaldığında, vakum pompasını kapatın ve süblimatör artık kum banyosuna dokunmayana ve metal O-ringe güvenli bir şekilde oturana kadar makaslı kaldırıcıyı dikkatlice indirin. Cihazdaki basıncı boşaltmak için mikro havalandırma valfini yavaşça gevşetin.

Süblimasyon aparatının kauçuk borusunun etrafındaki metal kelepçeyi gevşetin ve boruyu yavaşça gevşetmeye başlayın. Kauçuk boru hafifçe gevşetildikten sonra, kalan basıncın kaçmasına izin vermek için boruyu bir tarafa bükün. Ortam basıncı geri döndüğünde, kauçuk boruyu süblimasyon aparatından dikkatlice çıkarın.

Ardından, aparatın U eklemindeki mengeneleri gevşetin ve çıkarın. Süblimasyon aparatının iki yarısını dikkatlice ayırın ve sürgüyü iç cam eşyanın üstünden çekin. Eşit matris dağılımını doğrulamak için slaydı inceleyin.

Süblimleştirilen matrisin dağılımı ve miktarı yeterliyse, süblimatörün içine doku içeren yeni bir slayt bantlayın ve süblimasyon işlemini tekrarlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi görüntüleme ve analiz yapmaya devam edin. Kütle spektrumu, 1000 ila 2000 kütle aralığında iyonik anolit bolluğunu gösterir.

Majör A serisi gangliositler spektrum boyunca etiketlenmiştir. Burada gösterilen, sıçan beynindeki gangliyozitlerin karşılık gelen moleküler görüntüsüdür. Moleküler görüntü, ImageJ yazılımı kullanılarak üst üste bindirilmiş ve sözde renklendirilmiş renk kodlaması yoluyla birkaç gangliosit türünün anatomik dağılımını göstermektedir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, numune hazırlama sürecinde IMS sonuçlarının kalitesini etkileyebilecek ve genellikle rapor edilen protokollerin dışında bırakılan birçok değişken olduğundan, mücadele edebilir. Bu prosedürü denerken, her deneyden sonra süblimleştirilen matris miktarını izlemeyi ve süblimasyon zamanını slayta göre değiştirmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, araştırmacıların beyin hasarı, ner-jone hastalığı ve doğal yaşlanma sürecinden sonra gangliosidler gibi zar lipidlerinin rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu yöntem beyindeki lipitlerin bolluğu ve anatomik dağılımı hakkında fikir verebilir, ayrıca beyin dışındaki dokular ve hatta bitki ve böcek modelleri de dahil olmak üzere diğer sistemlere de uygulanabilir. Hasarlı köklerle çalışmak son derece tehlikeli olabilir ve bu işlem yapılırken her zaman eldiven, maske ve göz koruması gibi önlemler alınmalıdır.