Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Bu yöntem, gelişimsel kardiyak mekanobiyoloji alanında, bir 4D ışık tabakası mikroskobu kullanılarak çentik sinyalizasyonu yoluyla kardiyak trabekülasyon üzerindeki kayma geriliminin modülasyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, numunenin ince bir bölümünü beş mikronluk bir düzlemle aydınlatarak daha az foto ağartma ve foto hasara yol açmasıdır. Ek olarak, hesaplama algoritmamız, 4D atan bir zebra balığı kalbini yeniden oluşturmamıza izin veriyor.

Bu tekniğin etkileri, kardiyak trabekülasyonun erken bir gelişim aşamasında daha sonraki fenotipe kadar invivo ardışık görselleştirilmesine izin verdiği için konjenital kardiyak hastalıkların teşhisine kadar uzanır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan insanlar, zaman içinde üç boyutlu düşünmenin hayal edilmesinin zor olduğunu göreceklerdir. Ek olarak, sistemi oluşturmak ve doğru bir şekilde hizalamak zaman alır.

Başlamak için, bir bölücü kullanarak üreme tanklarındaki erkek ve dişi zebra balıklarını ayırın. Ardından, bölücüyü kaldırın ve erkek ve dişi zebra balığının üremesine izin verin. Zebra balığı embriyolarını toplayın ve trabekülasyonu önlemek için embriyoya morfolino oligo enjekte edin.

Daha sonra, 100 mililitre damıtılmış suya bir gram agaroz ekleyerek yüzde bir agaroz jeli hazırlayın ve agarozun tamamı eriyene kadar ısıtın. Agarozun soğumasını bekleyin ve ardından hazırlanan embriyolardan ve agarozdan biriyle küçük bir plastik tüp yüklemek için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Tüpü mikroskop tablasına sabitleyin ve on x objektifi kullanın.

Embriyonun üst kısmı odakta olacak şekilde düğmeyi kullanarak hedefi ayarlayın. Beş mikronluk hafif bir tabaka kalınlığı kullanarak birden fazla kardiyak atım döngüsü boyunca tüm balık embriyosunun görüntülerini çekin. On milisaniye pozlama süresiyle 500 xy kare toplayın.

Ardından, z erişimindeki aşamayı bir mikron yeni bir katmana taşıyın ve görüntüleme prosedürünü tekrarlayın. Tüm kalp tamamen görüntülenene kadar z düzlemi başına 500 kare hayal etmeye devam edin. Ardından, görüntü işleme yazılımını açın ve görüntüleri 3D olarak istiflemeye başlayın.

Bunu gerçekleştirmek için önce açık veri'ye tıklayın. Burada, 3B olarak istiflenecek tüm görüntüleri seçin ve ardından yükle'yi seçin. Ardından 0,65 x 0,65 x bir mikron voksel boyutunu ekleyin ve tamam'a tıklayın.

Doğru voksel boyutunun girilmesi, 3D görüntülerin doğru analizi için çok önemlidir. Şimdi, çok planlı görünüm kutusuna tıklayın ve 3D görüntüyü görselleştirin. Mavi dilim bir nokta tiff kutusuna sağ tıklayın, görüntüle'yi seçin ve ardından volran'a tıklayın.

Düzen menüsünde seçenekleri belirleyin ve ardından renk haritasını düzenleyin. Kutuları kullanarak rengi ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın. Hala görüntü işleme yazılımındayken dosyaya tıklayın ve zaman serisi verilerini açın.

Yükle'ye tıklayarak yeni yapılmış olan 3D tiff'leri seçin ve daha önce olduğu gibi aynı voksel boyutunu girin. Mavi dilim bir nokta tiff kutusuna sağ tıklayın ve ardından görüntüle'yi ve ardından volran'ı seçin. Şimdi, düzenle'ye tıklayın.

Seçenekleri seçin. Ve sonra renk haritasını düzenle'yi seçin. Kutuları kullanarak rengi ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın.

Ardından, zaman serisi kontrolüne sağ tıklayın, film yapımcısına tıklayın ve filmi izlemek için oynat düğmesine basın. İşlemi tamamlamak için bir dosya adı, çerçeve boyutu, kare hızı, bire eşit kalite ekleyin ve monoskopik girin. Ardından uygula'yı tıklayın.

Son olarak, videoyu dışa aktarın. Hemodinamik kayma gerilmesi gibi biyomekanik kuvvetler, kardiyak morfogenezde yakından rol oynar. Burada, döllenmeden 75 saat sonra ventriküler lümene çıkıntı yapan trabeküler çıkıntıları görselleştirmek için ışık tabakası floresan mikroskobu kullanıldı.

Döllenmeden 100 saat sonra trabeküler bir ağ açıkça görülebilir. Gata1aMO mikroenjeksiyonu ile tedavi edilen bir embriyoda hematopoez ve viskozite yüzde 90 oranında azalır. Bu azalmış viskozite, hemodinamik kesme gerilmesini zayıflattı, bu da gecikmeli bir başlatma ve daha az yoğun bir trabeküler ağ ile sonuçlandı.

Trabeküler ağın bu gecikmesi ve yoğunluğu, çentik ile ilgili gen ekspresyonunun yukarı regüle edilmesi, döllenmeden 75 saat sonra ve döllenmeden 100 saat sonra trabeküler oluşumun kurtarılmasıyla geri kazanılabildi. Böylece, gata1a morfolino oligonükleotidleri, çentik sinyalizasyonunun aşağı regülasyonuna yol açan hemodinamik kuvvetleri azaltırken, Nrg1-mRNA, regüle edilmiş çentik ile ilgili genleri kurtarır ve trabekülasyonu yeniden başlatır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu görüntüleme tekniği uygun şekilde yapılırsa yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kardiyak gelişim alanındaki araştırmacıların, zebra balıklarında trabekülasyonun uygun şekilde oluşumundan sorumlu olan çentik genindeki faktörleri incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, seçici düzlem aydınlatma mikroskobu kullanarak nasıl görüntü elde edeceğinizi ve 4D görüntü dosyalarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Ve bu işlem sırasında her zaman uygun gözlük takmak gibi önlemler alınmalıdır.