Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu
10 Ağustos 2018
Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.
Bu yöntem, gelişimsel kardiyak mekanobiyoloji alanında, bir 4D ışık tabakası mikroskobu kullanılarak çentik sinyalizasyonu yoluyla kardiyak trabekülasyon üzerindeki kayma geriliminin modülasyonu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, numunenin ince bir bölümünü beş mikronluk bir düzlemle aydınlatarak daha az foto ağartma ve foto hasara yol açmasıdır. Ek olarak, hesaplama algoritmamız, 4D atan bir zebra balığı kalbini yeniden oluşturmamıza izin veriyor.
Bu tekniğin etkileri, kardiyak trabekülasyonun erken bir gelişim aşamasında daha sonraki fenotipe kadar invivo ardışık görselleştirilmesine izin verdiği için konjenital kardiyak hastalıkların teşhisine kadar uzanır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan insanlar, zaman içinde üç boyutlu düşünmenin hayal edilmesinin zor olduğunu göreceklerdir. Ek olarak, sistemi oluşturmak ve doğru bir şekilde hizalamak zaman alır.
Başlamak için, bir bölücü kullanarak üreme tanklarındaki erkek ve dişi zebra balıklarını ayırın. Ardından, bölücüyü kaldırın ve erkek ve dişi zebra balığının üremesine izin verin. Zebra balığı embriyolarını toplayın ve trabekülasyonu önlemek için embriyoya morfolino oligo enjekte edin.
Daha sonra, 100 mililitre damıtılmış suya bir gram agaroz ekleyerek yüzde bir agaroz jeli hazırlayın ve agarozun tamamı eriyene kadar ısıtın. Agarozun soğumasını bekleyin ve ardından hazırlanan embriyolardan ve agarozdan biriyle küçük bir plastik tüp yüklemek için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Tüpü mikroskop tablasına sabitleyin ve on x objektifi kullanın.
Embriyonun üst kısmı odakta olacak şekilde düğmeyi kullanarak hedefi ayarlayın. Beş mikronluk hafif bir tabaka kalınlığı kullanarak birden fazla kardiyak atım döngüsü boyunca tüm balık embriyosunun görüntülerini çekin. On milisaniye pozlama süresiyle 500 xy kare toplayın.
Ardından, z erişimindeki aşamayı bir mikron yeni bir katmana taşıyın ve görüntüleme prosedürünü tekrarlayın. Tüm kalp tamamen görüntülenene kadar z düzlemi başına 500 kare hayal etmeye devam edin. Ardından, görüntü işleme yazılımını açın ve görüntüleri 3D olarak istiflemeye başlayın.
Bunu gerçekleştirmek için önce açık veri'ye tıklayın. Burada, 3B olarak istiflenecek tüm görüntüleri seçin ve ardından yükle'yi seçin. Ardından 0,65 x 0,65 x bir mikron voksel boyutunu ekleyin ve tamam'a tıklayın.
Doğru voksel boyutunun girilmesi, 3D görüntülerin doğru analizi için çok önemlidir. Şimdi, çok planlı görünüm kutusuna tıklayın ve 3D görüntüyü görselleştirin. Mavi dilim bir nokta tiff kutusuna sağ tıklayın, görüntüle'yi seçin ve ardından volran'a tıklayın.
Düzen menüsünde seçenekleri belirleyin ve ardından renk haritasını düzenleyin. Kutuları kullanarak rengi ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın. Hala görüntü işleme yazılımındayken dosyaya tıklayın ve zaman serisi verilerini açın.
Yükle'ye tıklayarak yeni yapılmış olan 3D tiff'leri seçin ve daha önce olduğu gibi aynı voksel boyutunu girin. Mavi dilim bir nokta tiff kutusuna sağ tıklayın ve ardından görüntüle'yi ve ardından volran'ı seçin. Şimdi, düzenle'ye tıklayın.
Seçenekleri seçin. Ve sonra renk haritasını düzenle'yi seçin. Kutuları kullanarak rengi ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın.
Ardından, zaman serisi kontrolüne sağ tıklayın, film yapımcısına tıklayın ve filmi izlemek için oynat düğmesine basın. İşlemi tamamlamak için bir dosya adı, çerçeve boyutu, kare hızı, bire eşit kalite ekleyin ve monoskopik girin. Ardından uygula'yı tıklayın.
Son olarak, videoyu dışa aktarın. Hemodinamik kayma gerilmesi gibi biyomekanik kuvvetler, kardiyak morfogenezde yakından rol oynar. Burada, döllenmeden 75 saat sonra ventriküler lümene çıkıntı yapan trabeküler çıkıntıları görselleştirmek için ışık tabakası floresan mikroskobu kullanıldı.
Döllenmeden 100 saat sonra trabeküler bir ağ açıkça görülebilir. Gata1aMO mikroenjeksiyonu ile tedavi edilen bir embriyoda hematopoez ve viskozite yüzde 90 oranında azalır. Bu azalmış viskozite, hemodinamik kesme gerilmesini zayıflattı, bu da gecikmeli bir başlatma ve daha az yoğun bir trabeküler ağ ile sonuçlandı.
Trabeküler ağın bu gecikmesi ve yoğunluğu, çentik ile ilgili gen ekspresyonunun yukarı regüle edilmesi, döllenmeden 75 saat sonra ve döllenmeden 100 saat sonra trabeküler oluşumun kurtarılmasıyla geri kazanılabildi. Böylece, gata1a morfolino oligonükleotidleri, çentik sinyalizasyonunun aşağı regülasyonuna yol açan hemodinamik kuvvetleri azaltırken, Nrg1-mRNA, regüle edilmiş çentik ile ilgili genleri kurtarır ve trabekülasyonu yeniden başlatır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu görüntüleme tekniği uygun şekilde yapılırsa yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kardiyak gelişim alanındaki araştırmacıların, zebra balıklarında trabekülasyonun uygun şekilde oluşumundan sorumlu olan çentik genindeki faktörleri incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, seçici düzlem aydınlatma mikroskobu kullanarak nasıl görüntü elde edeceğinizi ve 4D görüntü dosyalarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Ve bu işlem sırasında her zaman uygun gözlük takmak gibi önlemler alınmalıdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, 4-D ışık tabakalı floresan mikroskobu (LSFM) kullanarak zebra balığında gelişmekte olan kalplerin görselleştirilmesi için bir protokol sunar. Bu yöntem, zaman içinde kardiyak gelişimin yeniden yapılandırılmasına olanak tanır ve bölme gelişimi sırasında endokardial Notch sinyalinin aktivasyonunda kesme gerilimi rolünü ortaya çıkarır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel biyoloji
- Kardiyak mekanobiyoloji
- Görüntüleme teknikleri
Arka Plan
- Kardiyak gelişimi anlamak, konjenital kalp hastalıklarının teşhisi için kritik öneme sahiptir.
- Kesme gerilimi, Notch sinyalinin etkisiyle kardiyak trabekülasyonu etkiler.
- 4-D görüntüleme, dinamik biyolojik süreçlere ilişkin içgörüler sağlar.
- Işık tabakalı mikroskopi, foto ağartmayı ve hasarı en aza indirir.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balığında kardiyak gelişimin gerçek zamanlı görselleştirilmesi.
- Kesme gerilimi ile kardiyak trabekülasyon üzerindeki etkileri araştırmak.
- 4-D kalp yeniden yapılandırması için hesaplamalı bir algoritma geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- 4-D ışık tabakalı floresan mikroskobu (LSFM).
- Hesaplamalı algoritmalar kullanarak atan zebra balıkları kalbinin yeniden yapılandırılması.
- Kardiyak gelişim aşamalarının sıralı görselleştirilmesi.
- Notch sinyalinin kesme gerilimi etkileri üzerinde analiz.
Ana Sonuçlar
- Kesme gerilimi, kalp bölme gelişimi sırasında endokardial Notch sinyalinin aktivasyonunu sağlar.
- 4-D görüntüleme tekniği, kardiyak trabekülasyonun detaylı gözlemlenmesini sağlar.
- Azaltılmış foto ağartma ve hasar, görüntüleme kalitesini artırır.
- Yöntem, konjenital kardiyak hastalık mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.
Sonuçlar
- 4-D LSFM tekniği, kardiyak gelişimi incelemek için güçlü bir araçtır.
- Elde edilen içgörüler, konjenital kalp hastalıkları için daha iyi teşhis yöntemlerine yol açabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, gelişimsel biyolojinin diğer alanlarına uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
