Name: Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Öğrenin, yetişkin deri dokusundan primer insan keratinositlerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntemi. ROCK inhibitörü Y-27632 kullanımı epidermal hücrelerin yüksek verimde elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin (2017YFA0104604), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin'in (NSFC, 81772093), Genel Program tarafından desteklenmiştir bilim ve Suzhou teknoloji geliştirme programı (ZXL2015128), Jiangsu Eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20161241) ve Shandong Taishan Scholar Ödülü (tshw201502065).

Bu protokol için kullanılan insan doku kurumun insan Araştırma Etik Komitesi kurallarına göre ele (NO.2015120401, tarihi: 12 Mayıs 2015).
1. hazırlıkları
<ol><li>Plastik cerrahi ile buz gibi Dulbecco 10 mL 50 mL tüp Hastanesi'nde üzerinden atılan toplamak taze yetişkin karın cilt dokularının kartal Orta (DMEM) değiştiren. Örnek, hücre canlılığı önemli ölçüde etkilemeden en fazla 72 saat için 4 ° C'de tutulabilir.</li>
	<li>Reaktifler ve kültür orta aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.<ol>
<li>1 mL penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/L) 50 mL fosfat tamponlu çözeltisi (PBS) yıkama çözüm hazırlamak için ekleyin.</li>
		<li>İki enzim sindirim çözümler kümesi hazırlamak: (1) dispase (DMEM içinde 2.5 mg/mL) 50 mL hazırlamak ve 50 mL tip ı collagenase (2.5 mg/mL DMEM) ayrı ayrı geleneksel yöntemi; ve (2) 50 mL dispase karışımı hazırlamak ve tip ı collagenase (erime 125 mg dispase tozu ve 125 mg tip ı collagenase toz DMEM 50 mL) yeni yöntem için. Not: Tüm enzim çözümler olmalı bir 0,22-µm süzgeç ile filtre ve sürekli at4 ° C.</li>
		<li>Her iki yöntem için sindirim çözümleri hazırlamak: % 0.05 tripsin ve % 0.25 tripsin ticari olarak satın. Bir 10 mg/mL DNaz hazırlamak ben 50 mg 5 mL PBS, toz DNaz eriterek tarafından çözüm 0,22-µm süzgeç ile filtre ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Orta enzimatik sindirim nötralize etmek için 500 mL hazırlamak: DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.</li>
		<li>Aşı Orta (G-Orta olarak adlandırılan büyüme faktörü içeren orta,) 500 mL hazırlamak: içeren % 1 penisilin/streptomisin, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), DMEM/F12 (3:1) orta ve %2 B27 ek.</li>
		<li>100-mm hücre kültürü pretreat yemekleri kaplama matris türünü içeren 2 mL ile ben kollajen, oda sıcaklığında 30 dakika.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. geleneksel Yöntem
<ol><li>
Cilt doku Önarıtma
	<ol>
<li>1,5 cm2 cilt dokusunun almak ve yıkayın 1 x 10 mL PBS; o zaman, 10 mL % 70 etanol için 30 ile durulayın s ve o kuluçkaya 2 x 10 mL, 5 min çözüm (PBS) % 2 penisilin ve streptomisin içeren, yıkama ile. Not: Tüm yıkama 100-mm hücre kültür yemekleri bir laminar akış başlık içinde gerçekleştirilir.</li>
		<li>Deri altı yağ tabakası bir 100-mm hücre kültür çanağı kaldırmak ve sonra (Bu iletişim kuralı 1 g ağırlığıdır) deri dokusu tartmak için steril makasla doku kırpın. Not: Yeterli düzeltme dermis çok epidermis verimli ayrılması için çok önemlidir. Sarımsı yağ katman kolayca görsel olarak ayırt edilebilir.</li>
		<li>Ve aşağı başka bir 100-mm Steril çanak DermIS tarafı ile doku transfer, o zaman, cilt dokusu bir neşter bıçak kullanarak 3 - için 4-mm-geniş şeritler halinde kesin. Not: DermIS yan yağ tabaka ile kolayca görsel olarak kabul edilmektedir.</li>
		<li>100-mm kültür tabağına cilt dokularının 10 mL 2.5 mg/mL dispase çözeltisi ekleyin ve sonra bir gecede 4 ° C'de (en fazla 20 h) çanak kuluçkaya. Not: Dispase çözüm miktarı her gram doku sindirim için 10 mL dispase çözeltisi kullanılarak hesaplanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Epidermis ayrılması deri dokusu
	<ol>
<li>İkinci gün, iyi Cımbız kullanarak dermis epidermis akasındaki. Not: epidermis soyma zorsa, dispase sindirim hangi genellikle yetersiz doku düzeltme nedeniyle olduğunu yeterli değildi. Bu durumda, doku daha uzun bir kuluçka süresi gerekir.</li>
		<li>Hücre kültür ortamının 500 µL ile soyulmuş epidermis neşter bıçakları kullanarak bir doku Bulamaç kıyma; daha sonra 10 mL % 0.25 tripsin bir 50 mL tüp ile resuspend ve 37 ° C'de sallayarak ile bir su banyosu içinde 20 dk kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
	<ol>
<li>Tripsin etkinlik nötralize çözüm (bu Protokolü 10 mL) eşit bir hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin.</li>
		<li>Çözüm yukarı ve aşağı 20 x 10 mL serolojik pipet ile pipetting tarafından epidermal hücrelerin ayırmak ve hücre çözümü herhangi bir kalıntı doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.</li>
		<li>Hücre çözümü 200 x g 5 min için de filtrasyon sonra santrifüj kapasitesi; hücre Pelet nötralizasyon orta yıkama resuspend ve sonra tekrar hücre Pelet elde etmek için 200 x g santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Hücre Pelet düşük kalsiyum, serum-Alerjik keratinosit Orta (SFM) 10 mL resuspend. Bu çözümün Toplam hücresini saymak ve sonra SFM 10 mL içine kaplama matris ile ön işleme 100-mm hücre kültür yemekler ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için 10 µL al (içeren tip ı kollajen). Not: Kaplama geleneksel yöntem için gerekli bir adımdır.</li>
		<li>Kültür orta her 2 d değiştirin. Not: bir mikroskop altında hücre adezyon önce ve kültür orta değiştirdikten sonra kontrol edin.</li>
		<li>Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham. Not: Tüm kültür yemekleri ile kaplama matris ön işleme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yeni yöntemi
<ol><li>
Cilt doku Önarıtma
	<ol>
<li>Doku açıklandığı gibi yukarıdaki (adım 2.1) geleneksel yöntem için toplamak.</li>
		<li>Deri dokusu 1 yıkama x 10 mL PBS ile ve daha sonra tartmak bir steril plastik kap içinde elektronik bir ölçek (ağırlığı ise yaklaşık 1 g bu protokolü) tarafından. Not: kullanılan doku örnek çok küçük ise hücreler yeterli sayıda elde etmek zor olduğundan 0.1 g, doku bu iletişim kuralı için gerekli minimum ağırlık olur. Sonuçta operatör işleme kapasitesine bağlıdır bu iletişim kuralı için doku yok maksimum ağırlık vardır.</li>
		<li>10 mL % 70 etanol için 30 ile deri dokusu durulama için forseps kullanın s.</li>
		<li>Doku 2 kuluçkaya x 10 mL, 5 min için (adım 2.1.1 hazır) çözüm her zaman yıkama ile. Not: yukarıda belirtilen tüm çamaşır adımlar 100-mm hücre kültür yemekleri laminar akış hood (doku kültürü hood) içinde gerçekleştirilir.</li>
		<li>Doku başka bir 100-mm hücre kültür steril yemek için transfer.</li>
		<li>Neşter bıçakları kullanarak, doku iyice bir doku Bulamaç kıyma.</li>
		<li>200 µL her 5 dk PBS, ıslak mendil tutmak için ekleyin. : Dikkat adımları 3.1.5 - 3.1.7 yaklaşık 15 dakikadır. Yukarıdaki tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sindirim cilt dokusunun
	<ol>
<li>Homojenize doku çözüm 50 mL tüp içine aktarın. 10 mL cilt dokusunun her 1 g için enzim karışımı ekleyin. Enzimler homojenize kurcalayarak iyice karıştırın.</li>
		<li>1s için 37 ° C'de bir su banyosunda sallayarak ile karışımı kuluçkaya.</li>
		<li>Başka bir 30 dk 37 ° C'de bir su banyosu içinde sindirim karışımı için % 0.25 tripsin (Bu iletişim kuralı 2.5 mL) 1/5 hacmi ekleyin</li>
		<li>DNaz ekleyin ben çözüm 1: 100 (v/v) oranında (Bu protokolündeki 250 µL) enzim karışımı ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
	<ol>
<li>1:1 oran içinde 12,5 mL nötralizasyon orta ekleyerek sindirim işlemini durdurun. Çözüm yukarı ve aşağı yaklaşık 20 x 10 mL serolojik pipet hücreleri ayırmak için kullanma için pipette.</li>
		<li>Disosiye hücreleri doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Süpernatant 200 x g 5 dk. gözlemlemek Pelet tüpün dibinde de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve nötralizasyon orta ve santrifüj 10 mL ile hücre Pelet tekrar 200 x g hücreleri toplamak 5 min için de yıka.</li>
		<li>Hücre Pelet aşılama Orta (adım 1.2.5 G-Orta) 10 ml Y-27632 10 µM ile resuspend.</li>
		<li>Toplam hücre sayar ve ardından, G-Orta 10 mL 100-mm hücre kültür çanak içine ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için çözüm 10 µL al. Not: Precoating adım yeni yöntemi için gerekli değildir ve hiçbir kaldırma dermal tabakanın da gereklidir.</li>
		<li>3 d sonra aşı orta düşük kalsiyum SFM orta ile değiştirin. Kültür orta her 2 d değiştirin. Not: hücre adezyon önce ve orta değiştirdikten sonra kontrol edin.</li>
		<li>Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham. Not: gerekirse, % 0.05 tripsin 2 min için hücrelerle pretreat ve deri hücreleri epidermal hücrelerin trypsinizing önce kirletici kaldırmak için PBS hücrelerle yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hücre Passaging
<ol><li>Orta kaldırmak, PBS hücrelerle yıkayın ve ardından, 2 mL % 0.05 tripsin (başına her 100-mm çanak) ekleyin.</li>
	<li>5 min için bir kuluçka (37 ° C % 5 CO2) hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>Tüm hücreler kültür çanak ayırdıktan emin olmak için bir mikroskop kullanarak hücreleri denetleyin.</li>
	<li>DMEM 8 mL % 10 ile ekleyin FBS enzimatik reaksiyon etkisiz hale getirmek ve daha sonra bir 15 mL tüp hücreleri toplamak için.</li>
	<li>200 x g hücre Pelet elde etmek 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaş yavaş süpernatant kaldırmak ve, sonra hücre Pelet SFM orta 10 mL ile resuspend ve hücreleri saymak.</li>
	<li>1 x 106 hücre SFM 10 mL her 100-mm hücre çanak içine ile plaka.</li>
	<li>Her 2 d orta değiştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+BIology%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).</li>
<li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal%2C+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li>
<li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+dermatologische+Forschung%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/306307941_A_new_method_to_isolate_human_epidermal_keratinocytes">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cornified+envelope%3A+a+model+of+cell+death+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li>
<li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li>
<li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kültürlü birincil HKCs yaygın olarak fazla üç yıl için klinikler yaraları tedavi etmek için kullanılan ve o zamandan beri her zaman verimli bir şekilde zamanında yeterli sayıda klinik uygulamaları için hücre elde etmek önemli olmuştur. Bu nedenle, uygulamada, dermis epidermis ayrılması gerektirir, geleneksel yalıtım yöntemini hücrelerin ve yetişkin hücreleri geçiş yeteneği düşük düşük verim nedeniyle bu talepleri karşılamak zor olur. Burada, verimli bir şekilde HKCs için laboratuar ve klinik uygulamalar için daha uygun ö...

Amaç birincil insan keratinositler (HKCs)--dan yetişkin dokular, özellikle klinik uygulamalar için yalıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı geliştirmekti. Cilt epidermal kök hücreleri, deri, bazal tabaka içinde lokalize çoğalırlar ve ayırt etmek ve cilt1,2,3, fonksiyonlarını korumak için Lenfositi sağlamak için yüksek bir potansiyele sahip 4. deri dokuları yaygın cilt doku mühendisliği ve yenilenme amacıyla kullanılan, özellikle hasarlı cilt onarım ve gen tedavisi için klinik uygulamaları5,6izole HKCs. Önemli HKC tabanlı uygulamalar için etkili bir şekilde izole ve HKCs çok sayıda yüksek potansiyel vitro7,8ile genişletin konudur. Çeşitli araştırma grupları kök benzeri HKCs kültürleri üretmek için yöntemler geliştirdik, bu yöntemler bazen düşük hücre verimleri ve cilt numune türü tarafından sınırlı olmak gibi diğer kısıtlamalar bulunmaktadır ve gerçekleştirmek karmaşık ve zaman alıcı olmakla birlikte 9kullanılır. Örneğin, HKCs cilt dokularının yalıtmak için geleneksel yöntem iki aşamalı enzimatik sindirim epidermis bir ayırma DermIS6ile karıştırmak. Bu yöntem genellikle de yenidoğan dokular için çalışıyor, ama yetişkin doku hücreleri izole etmek için kullanıldığında çok zor olur.
Y-27632, Rho ilişkili protein kinaz (kaya), bir inhibitörü bildirilmiştir önemli ölçüde epidermal kök hücre izolasyon ve koloni büyüme10,11,12verimliliği artırmak için. Bir önceki çalışmada, keşfettiğimiz Y-27632 epidermal hücrelerin klonal büyümesini kolaylaştıran ama differentially adezyon molekülleri13ifade kontrol ederek deri hücreleri verimini azaltır. Ayrıca büyüme ve verim birincil epidermal hücre destekler G-Orta adı verilen yeni bir şartına aşılama orta kurduk. G-Orta Y-27632 ile birleştirerek, bu roman yöntemi kendiliğinden böylece epidermis-DermIS ayrılık13,14adım kaldırma enzim sindirim sonra epidermal ve dermal hücreleri ayırabilirsiniz. Önceki raporlara dayanarak, biz şimdi detaylı HKCs yetişkin cilt dokusundan ayırmak için bu yeni yöntemin açıklayınız.

<table><tbody><tr><td>Kontes otomatik hücre sayacı</td><td>Invitrogen Inc.&nbsp;</td><td>C10227</td><td>Otomatik hücre sayımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre inkübasyonu için</td> <td>CO2 İnkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Hücre santrifüjü</td></tr><tr><td>Sabit Sıcaklık Çalkalayıcı</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>Su banyosu için</td></tr><tr><td>Elektronik Tartı</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>Doku tartımı için</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Tabağı</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>50ml Santrifüj Tüpü</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Hücre santrifüjü için</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>Corning dahil</td><td>431792</td><td>Hücre filtrasyonu</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu çözelti</td><td>Solarbio Life Science&nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Yıkama solüsyonu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Nötralizasyon ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Tanımlanmış K-SFM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10785-012</td><td>Epidermal hücreler, kültür ortamı</td></tr>, <tr><td>Penisilin Streptomisin</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiyotikler</td></tr>, <tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Biyolojik Endüstrileri</td>, <td>04-001-1AC5</td><td>Nötralizasyon ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>% 0.05 Tripsin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-062</td><td>HKC ayrışması için</td></tr><tr><td>% 0.25 Tripsin ve nbsp;</td><td>Pekin Solarbio Bilim & Teknoloji</td><td>T1350-100</td><td>HKC ayrışması için</td></tr><tr><td>Kaplama Matrisi Kiti</td><td>Yaşam</td><td>Teknolojileri R-011-K</td><td>Kaplama matrisi için</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>HKC izolasyonu için</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip I</td> HKC izolasyonu için <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17100-017</td><td>HKC izolasyonu için</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>F12 için</td></tr><tr><td> Besin Karışımı, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>B27 Bileşeni Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td> G-medium <td></td></tr><tr><td>FGF-2 Milipore</td><td>Merck Biosciences'da</td> büyüme faktörü <td>341595</td><td>G-ortamı</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK inhibitöründe</td></tr> büyüme faktörü <tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>EGF Rekombinant İnsan Proteini</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>için Hazırlık G-medium</td></tr><tr><td>Hücre Sayma Kiti-8'de</td> büyüme faktörü <td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>hücre proliferasyonu ve sitotoksisite testleri</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan Sitokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Geliştirme Şirketi</td><td>MA-20142</td><td>HKC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Tavşan Anti-İnsan Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>HKC'lerin farklılaşma belirtecini kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Fare anti-insan Vimentin</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>3390</td><td>Dermal fibroblastların immünofloresan boyaması için</td></tr><tr><td>Integrin & 6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>HKC'lerin akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>negatif kontrol antikoru &alfa; 6-Entegre&nbsp; Akım sitometri analizinde&nbsp;</td></tr></tbody></table>

birincil insan lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Taze cilt dokularının ve kendi genişleme vitro izole birincil insan Lenfositi yaygın olarak laboratuvar araştırma ve klinik uygulamaları için kullanılmaktadır. İnsan Lenfositi geleneksel yalıtım yöntemi nedeniyle düşük hücre kurtarma hızı ve düşük hücre yetişkin dokulara gelen primer hücre oluşturmak için verimsiz olduğu kanıtlanmış bir iki adım sıralı enzimatik sindirim yordamı içerir canlılığı. Biz son zamanlarda Orta Rho kinaz inhibitörü Y-27632 kullanan insan birincil epidermal progenitör hücrelerin cilt dokularının yalıtmak için gelişmiş bir yöntem bildirdi. Geleneksel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem daha basit, daha kolay ve daha az zaman alıcı ve epitel kök hücre verim artar ve kök hücre özellikleri geliştirir. Ayrıca, yeni metodoloji dermis epidermis ayrılması does değil istemek ve, bu nedenle, farklı türdeki yetişkin doku hücreleri yalıtmak için uygundur. Bu yeni yalıtım yöntemi geleneksel yöntemlerle önemli eksiklikleri üstesinden gelir ve daha yüksek güç için laboratuar ve klinik uygulamalar için ile çok sayıda epidermal hücre üretmek için uygundur. Burada, yeni yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Şematik diyagramları yeni yöntemi (resim 1A) ve geleneksel Yöntem (Şekil 1B) Şekil 1' de sunulmaktadır. 2 günlük yordamı gerektirir bir iki adım sindirim geleneksel yöntemdir. Buna karşılık, en yeni yöntemdir gerçekleştirmek için yaklaşık 3 saat sürer bir tek adımlı sindirim. Önemlisi, tek adımlı Yöntem Y-27632 varlığı aşılama orta bağlıdır aynı anda iki popülasyonun (epidermal ve dermal hücreleri) e...

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Bu videonun genel amacı, yetişkin bir cilt dokusundan birincil insan epidermal hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için yeni ve basit bir yöntem tanıtmaktır. Bu gelişmiş yöntem, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için çok sayıda yüksek potansiyelli epidermal hücre üretmek için daha uygundur. Tartmadan önce dokuyu PBS ile yıkayın.Cilt dokusunu elektronik bir terazi ile tartın. Cilt dokusunu 30 saniye boyunca% 70 etanol ile durulayın. PBS'deki dokuyu her seferinde beş dakika boyunca iki kez antibiyotiklerle inkübe edin.Dokuyu başka bir steril tabağa aktarın ve neşter bıçakları kullanarak iyice homojenize edin. Dokuyu ıslak tutmak için her beş dakikada bir 200 mikrolitre PBS ekleyin. Homojenize dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Her bir gram cilt dokusu için 10 mililitre enzim karışımı ekleyin. Enzimleri homojenize dokularla iyice karıştırın. Karışımı 37 derecelik bir su banyosunda çalkalayarak inkübe edin.Bundan sonra,% 0.25 tripsin hacminin 1 / 5'ini ekleyin. 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübasyona devam edin. Karışıma bir ila 100 oranında Dnase I çözeltisi ekleyin.Sonra beş dakika daha kuluçkaya yatırın. Aynı hacimde nötralizasyon ortamı ekleyerek sin

a-simplified-efficient-method-to-isolate-primary-human-keratinocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu videoda, insan derisinin epidermal tabakasının en belirgin hücreleri olan keratinositlerin, enzimatik sindirim ve mekanik bozma yöntemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak izolasyonu anlatılmaktadır. Bu yöntem, seçici bir büyüme ortamı kullanarak keratinositlerin diğer cilt hücresi tiplerine göre tercihli büyümesine yardımcı olur.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Birincil insan fibroblast ikinci naif multipotent ten türetilmiş öncü (SKP) hücreleri izole etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Biz fibroblast kültürleri elde edilen bu SKPS insan deri biyopsisi doğrudan elde benzeyen kök hücre özelliklerini paylaşmak olduğunu göstermektedir. Bu hücreler, örneğin Oct4 ve Nanog olarak multipotent işaretleri ek olarak nöral tepe işaretleyici, Nestin, ifade eder.

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model...

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

Bu protokolün amacı, moleküler biyoloji, biyokimya, floresan aktif hücre ayrıştırma ve primer in vitro kullanımlar (örneğin, klojenojenik) gibi çeşitli downstream uygulamaları için yetişkin farelerin dorsal deriden epidermal keratinositleri izole etmektir. keratinositler).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Bu protokol, canlı hücre görüntülemede kullanılmak üzere taze elde edilen (pasaj 0) keratinositlerin kültürünü ana hatlarıyla belirtir.

Keratinosit Canlı Hücre Görüntüleme için Primer Kültürlerin Oluşturulması

Öğrenin, yetişkin deri dokusundan primer insan keratinositlerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntemi. ROCK inhibitörü Y-27632 kullanımı epidermal hücrelerin yüksek verimde elde edilmesini sağlar.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Daha fazla video keşfet