Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem
August 25th, 2018
Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.
Bu videonun genel amacı, yetişkin bir cilt dokusundan birincil insan epidermal hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için yeni ve basit bir yöntem tanıtmaktır. Bu gelişmiş yöntem, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için çok sayıda yüksek potansiyelli epidermal hücre üretmek için daha uygundur. Tartmadan önce dokuyu PBS ile yıkayın.
Cilt dokusunu elektronik bir terazi ile tartın. Cilt dokusunu 30 saniye boyunca% 70 etanol ile durulayın. PBS'deki dokuyu her seferinde beş dakika boyunca iki kez antibiyotiklerle inkübe edin.
Dokuyu başka bir steril tabağa aktarın ve neşter bıçakları kullanarak iyice homojenize edin. Dokuyu ıslak tutmak için her beş dakikada bir 200 mikrolitre PBS ekleyin. Homojenize dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Her bir gram cilt dokusu için 10 mililitre enzim karışımı ekleyin. Enzimleri homojenize dokularla iyice karıştırın. Karışımı 37 derecelik bir su banyosunda çalkalayarak inkübe edin.
Bundan sonra,% 0.25 tripsin hacminin 1 / 5'ini ekleyin. 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübasyona devam edin. Karışıma bir ila 100 oranında Dnase I çözeltisi ekleyin.
Sonra beş dakika daha kuluçkaya yatırın. Aynı hacimde nötralizasyon ortamı ekleyerek sindirim işlemini durdurun. Solüsyonu yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Doku kalıntılarını gidermek için ayrışmış hücreleri 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Beş dakika boyunca 200 g'da santrifüjleyin. Tüpün altındaki peleti gözlemleyin.
Süpernatanları çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre nötralizasyon ortamı ile yıkayın. Daha sonra beş dakika boyunca 200 g'da santrifüjleyin. Hücre peletini 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile aşılama ortamında yeniden süspanse edin.
100 milimetrelik bir kültür kabında 10 ila altıncı hücreye iki kez plakalayın. Üç gün sonra, aşılama ortamını serumsuz keratinosit ortamı ile değiştirin. Ortamı iki günde bir değiştirin.
Hücreler yoğunluğun yaklaşık% 80'ine ulaştığında, hücreleri geçin. Hücreleri PBS ile yıkayın. Gerekirse, iki dakika boyunca tripsine edin ve kontamine dermal hücreleri çıkarmak için hücreleri PBS ile yıkayın.
Aynı hacimde nötralizasyon ortamı ekleyin. Beş dakika boyunca 200 g'da santrifüjleyin. Son olarak, süpernatanları çıkarın ve hücre peletini yeniden süspanse edin.
İnsan deri dokularından izole edilen keratinositler iki yöntemle ayrı ayrı inkübe edildi. Geleneksel yöntem, iki günlük bir prosedürü içeren iki aşamalı bir sindirimdir. Buna karşılık, yeni yöntem, gerçekleştirilmesi yaklaşık üç saat süren tek adımlı bir sindirimdir.
Üçüncü günde, yeni yöntemle kültürlenen birçok hücre kümesini kolayca bulabiliriz, ancak bu fenomen geleneksel yöntem kullanıldığında meydana gelmez. Beşinci günde, yeni yöntemin daha fazla miktarda primer hücre ürettiği gözlemlendi. Kültürlenmiş keratinositlerin farklılaşma durumunu test etmek için bazal hücre markörü K5 ve terminal farklılaşma markörü Loricrin'i analiz ettik.
Toplam hücrelerin %90'ının K5 pozitif olduğunu, ancak hücrelerin %10'undan daha azının üçüncü pasajda Loricrin eksprese ettiğini bulduk, bu da onların farklılaşmamış keratinositler olduğunu gösteriyor. İzolasyon sırasında dermal hücrelerin kontaminasyonunu incelemek için dermal fibroblastta eksprese edilen vimentin ekspresyonunu kontrol ettik. Dermal hücrelerin yaklaşık% 3'ünün ilk pasajda ortaya çıktığını, ancak dermal hücrelerin sadece% 0.02'sinin üçüncü pasajda tespit edildiğini bulduk, bu da pasajdan sonra epidermal hücrelerin yüksek saflığını gösterir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, yetişkin deri dokularında birincil insan keratinositlerin izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol sunmaktadır. Yöntem, epidermik hücrelerin dermis hücrelerinden ayrılmasını kolaylaştırmak için ROCK İnhibitörü Y-27632'yi kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Dermatoloji
- Rejeneratif Tıp
Arka Plan
- Birincil insan keratinositler, çeşitli araştırma uygulamaları için gereklidir.
- Geleneksel izolasyon yöntemleri karmaşık ve zaman alıcı olabilir.
- ROCK İnhibitörü Y-27632'nin kullanımı daha verimli bir yaklaşım sunar.
- İzole edilen keratinositler hem laboratuvar hem de klinik ortamlarda kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Epidermik hücrelerin izole edilmesi için daha verimli bir yöntem geliştirmek.
- Yüksek potansiyelli epidermik hücrelerin verimini artırmak.
- Deri hücrelerini içeren araştırma ve klinik uygulamaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Ağırlamadan önce cilt dokusunu PBS ile yıkayın.
- Cilt dokusunu elektronik bir tartı kullanarak tartın.
- Dokusunu 30 saniye boyunca %70 etanol ile durulayın.
- Dokusunu antibiyotikli PBS içinde iki kez beşer dakika inkübe edin.
Ana Sonuçlar
- Protokol birincil keratinositlerin başarılı bir şekilde izole edilmesini sağlar.
- Yüksek verimli canlı epidermik hücreler elde edildi.
- Yöntem tekrarlanabilir ve verimlidir.
- İzole edilen hücreler çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem birincil keratinositlerin izolasyonunu basitleştirir.
- Alandaki araştırmacılar için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
- ROCK İnhibitörünün kullanımı hücre verimini ve canlılığını artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
