Name: Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Keşfedin tek adımlı iyon değişim kromatografisi ile TET2 protein arıtma ve LC-MS/MS tabanlı aktivite analizi yöntemini. Bu protokol epigenetik araştırmalarında normal ve klinik TET2 mutasyonlarının incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma ABD Savunma Bakanlığı bir fikir Ödülü (W81XWH-13-1-0174), aplastik anemi ve MDS Vakfı Hibe şeklinde tarafından finanse edildi ve UMRB grant mm yazarlara teşekkür Mohit Jaiswal ve Subhradeep Bhar ilk TET2 pDEST14 vektörde klonlama için.

1. klonlama ve etiketsiz insan TET2 Dioxygenase arıtma
<ol><li>İnsan TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) yukarıda açıklanan22siteye özgü rekombinasyon teknikle pDEST14 hedef vektör içine kopyalayın. Not: Önceki çalışmalarda C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) etki alanı en az catalytically etkin etki alanı21,23olduğunu göstermiştir. PDONR221 vektör kullanarak etiketsiz TET2 dioxygenase etki alanı hızlı için Parlatıcı Dalgarno ve Kozak diziler PCR (Tablo 1) sırasında ileri astar dahil edilmiştir.</li>
	<li>Etiketsiz insan TET2 (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) 100 µL kimyasal olarak yetkili E. coli için dioxygenase içeren rekombinant pDEST14 ifade vektör 1 µL bakteriyel dönüşümü için ekleyin BL21 1.7 mL tüp hücrelerde (DE3). Isı şok 30 42 ° C'de ardından en az 15 dakika boyunca karışımı buz tutmak bir su banyosu içinde s.<ol>
<li>Hemen sonra ısı şok, hücreler için en az 2 dk buzda tutmak. Bunu, catabolite baskı (S.O.C medya) ile süper en iyi suyu 250 µL hücrelere ekleme. Bir shaker 37 ° C'de 1 h için bakteri hücreleri kuluçkaya.</li>
		<li>Kuluçka sonra tüp 9000 x g 1 dk. atma % 70 süpernatant için de pipetting tarafından centrifuging tarafından hücreleri aşağı spin ve sol Pelet medya üzerinden geçiyoruz.</li>
		<li>Hücre süspansiyon 100 µg/mL ampisilin içeren bir tabakta Luria suyu (LB) agar yayıldı. 16 h 37 ° C'de plaka kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir izole koloni seçin ve 10 mL LB-ampisilin medya bir 50 mL tüp içine aşılamak. Bir shaker 37 ° C'de tüp gece için kuluçkaya. Bunu, 100 mL LB-ampisilin medya aşılamak için kültür 50 mL tüp 100 µL kullanın. Bir shaker 180 RPM olarak 37 ° C'de şişeye kuluçkaya ve birincil kültür olarak kullanabilirsiniz. Ertesi gün, birincil kültür her 6 mL 15 şişeler, her içeren 600 mL LB-ampisilin medya aşılamak için kullanın. Şimdi, bir shaker 180 RPM olarak 37 ° C'de 15 şişeler kuluçkaya. Not: dönüştürülmüş klonlar doğrulamak için izole plazmid DNA ile DNA sıralama veya kısıtlama sindirim gerçekleştirin.</li>
	<li>Bakteriyel kültür yoğunluğunu kontrol etmek için bir spektrofotometre kullanarak onun OD600 ölçmek. Kültür bir yoğunluk 0,8 OD600ulaştıktan sonra TET2 protein ifadesi ile 1 M (600 ml 0.5 mM son konsantrasyonu) IPTG her şişesi içinde 300 µL teşvik ve kültür için 16 h 17 ° C'de büyütmeyi</li>
	<li>16 h sonra santrifüj şişeler için bakteri kültürü aktarmak. TET2 enzim 5,250 x g 45 dk. kullanım için de ifade bakteri kültürü TET2 arıtma bakteriyel Pelet santrifüj kapasitesi. Not: buz üzerinde veya 4 ° C'de tüm geri kalan protein saflaştırma adımları gerçekleştirin</li>
	<li>Bakteriyel Pelet 100 mL 50 mM MES resuspend (2-(N-morpholino) ethanesulfonic asit) tampon, pH 6 ve 5 × 30 s güç 20 ile 60 s soğutma aralıkları için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Lysate 45 dakika süreyle 5,250 x g de çözünen TET2 enzim içeren süpernatant toplamak ve 0.45-µm geçmek spin bir FPLC sistemde yüklemeden önce filtre uygular. Not: Bu deneylerde TET2 enzim çok kararlı, ama bir proteaz inhibitörü kokteyl içeren 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl florür (PMSF) ve 0,5 mM 1,10 -ogerekirse - pH lysate için hücreye eklenebilir TET2 enzim bozulma önlemek. Bunlar aşağıdaki katyon değişim kromatografi ile girişime neden olabilir gibi EDTA veya EGTA inhibitörü kokteyl kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Paket 30 mL güçlü katyon değişim reçine FPLC sütun. Yıkama arabelleği (50 mM MES tampon, pH 6) 0.3 mL/dk FPLC sistemini kullanarak sürekli akış hızında 10 yatak birimlerle sütun equilibrate.</li>
	<li>Açıklanan yük üstüne belgili tanımlık önceden dengelenmiş sütun ve yıkama ∼10 yatak birimleri aracılığıyla akış açık hale gelinceye kadar yıkama arabelleği ile lysate.</li>
	<li>TET2 elute 0-100 kullanarak yıkama arabellek üzerinden % gradyan elüsyon arabellekte (50 mM MES tampon, pH 6, 1 M NaCl) 15 yatak birimleri'holding % 100 elüsyon arabellek İki Yataklı birimler için de izledi. Not: cep lysate önce ve sonra sütun elüsyon kesirler ile birlikte yükleme (100 µL her) örnekleri toplamak ve % 10 SDS-sayfa çözme çözümleyebilirsiniz.</li>
	<li>TET2 protein içeren kesirleri havuz, Kuru dondurmak, enzim palet 10 mL su ve-80 ° C'de store dağıtılması</li>
</ol>2. 5mC oksidasyon TET2 Dioxygenase tarafından
<ol><li>Tüm demethylation reaksiyonlar ile 3 µg substrate (25-mer çift iplikçikli DNA, Tablo 2) nüsha gerçekleştirin.<ol>
<li>Saf TET2 enzim 100 µg 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG içeren toplam reaksiyon arabellek 50 µL içinde eklemek (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate) ve 2 mM askorbat ve 1 h2137 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>500 mM EDTA ile 5 µL katalize TET2 oksidasyon reaksiyonları gidermek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TET2 reaksiyonlar Şoklama sonra örnekleri TET2 reaksiyon karışımı oligo arıtma sütunları kullanarak DNA ayırarak LC-MS/MS analiz için hazırlayın.<ol>
<li>100 µL oligo bağlama arabellek yüzeyi tepki 55 µL için ekleyin.</li>
		<li>Bunu, 400 µL % 100 etanol karışıma ekleyin. Bu karışımı bir oligo bağlama sütunu boyunca geçmek.</li>
		<li>750 µL yıkama arabelleği ile ilişkili DNA yıkama ve 20 µL suda elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNaz 2 ünite ile izole DNA sindirmek ben ve S1 nükleaz 12 h için 37 ° C'de 60 adet bireysel nükleozit monophosphates üretmek için.</li>
	<li>Sindirim, 2 adet buzağı bağırsak alkalen fosfataz (CIAP) örnekleri eklemek ve ek 12 h 37 ° C'de nükleozit-monophosphates nükleozit elde etmek için fosfat grupları kaldırmak için kuluçkaya.</li>
	<li>Tüm nükleozit, aşağıda açıklanan LC-MS/MS yöntemiyle özellikle değiştirilmiş cytosines ölçmek.</li>
</ol>3. nicel tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme
<ol><li>Tüm değiştirilmiş sitozin nükleozitler [5-metil-2-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2 '-deoxycytidine (5fdC) ve 5-carboxy-2 '-deoxycytidine (5cadC)] 100 µM stok çözeltisi hazırlamak ve normal DNA (adenin, temelleri timin, sitozin ve guanin) LC-MS/MS yöntem geliştirilmesi için HPLC sınıf suda.</li>
	<li>Hisse senedi çözümler, tek tek beslerken tarafından nükleozit bağımlı MS/MS parametrelerini optimize, EMS 10 µL/min akış hızında kütle spektrometre Tarama kipi. Parametreler optimize etmek: her DNA nükleozit kullanarak otomatik nicel optimizasyonu için potansiyel (DP), giriş potansiyel (EP), çarpışma hücre giriş potansiyel (CEP), çarpışma enerji (CE) ve çarpışma hücre çıkış potansiyel (CXP) Declustering yazılım özelliği.</li>
	<li>Kaynak bağımlı MS/MS parametreleri enjekte ederek 10 µL % 25 çözücü B 0.3 mL/dk çözücü A 10 mM amonyum asetat (pH 4.0) ve solvent B 10 mM amonyum asetat (pH 4.0) ile % 20 Asetonitril olduğu yerde bir akış hızında bir degrade kullanarak hisse senedi çözüm tarafından en iyi duruma getirme. Parametreler optimize: perde gaz (CUR): 10-50, sıcaklık: 0-600 ° C, gaz akışı 1 (GS1): 0-50, gaz akışı 2 (GS2): 0-50, Collisionally aktive ayrılma (CAD): düşük-orta-yüksek, iyon sprey voltaj (IS): 4000-5500 manuel kullanarak her DNA nükleozit için FIA (akış enjeksiyon Analizi) modunda yazılım nicel en iyi duruma getirme özelliği.</li>
	<li>Bütün sekiz DNA nükleozitler ayırmak için sıvı kromatografi aşağıdaki degradenin kullanarak gerçekleştirmek: %0 çözücü B (0-2 dk), 0-%20 çözücü B (2-5 dk), 20-%60 çözücü B (5-9 dk), 60-%0 çözücü B (9-10 dk) ve solvent A 0.3 akış hızında 5 min için ile equilibrate mL/dk C18 sütun (partikül büyüklüğü: 5 mikron, gözenek boyutu: 120 Å).</li>
	<li>(Adım 3.4), yukarıda sözü edilen sıvı kromatografi gradyan ile birleştiğinde optimum MS/MS parametrelerini (Adım 3.2 ve 3.3) kullanarak yanıt doğrusallık, sınırı algılama (LOD olarak) ve miktar (LLOQ) kullanarak alt limiti belirler bir iki kat seri seyreltme tüm sekiz nükleozitler içeren bir 100 µM standart karışımı. Bütün sekiz DNA nükleozitler için standart eğriler çizmek.</li>
	<li>Algılamak ve tüm nükleozit, özellikle değiştirilmiş cytosines, LC-MS/MS yöntemi ve standart eğrileri kullanarak Adım 2.4'te üretilen ölçmek.</li>
</ol>

<ol><li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+landscapes%3A+provocative+insights+from+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905(2013).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26030523">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li>
<li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21030644">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li>
<li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li>
<li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li>
<li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron%28II%29%2Falpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li>
<li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins%2C+but+indicates+no+definite+prognostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li>
<li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-Eleven-Translocation+2+%28TET2%29+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li>
<li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+expression%2C+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+expression+and+purification%22%5BJournal%5D)">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li>
<li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li>
<li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2001/cc/b101039p#!divAbstract">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li>
<li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li>
<li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28813683">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için mali hiçbir ilgi alanlarına sahip.

TET2 gen mutasyonlar çeşitli hematopoetik maligniteler olan hastalarda en sık saptanan genetik değişiklikler vardır. Mutasyonların saçma, çerçeve-shift ve missense mutasyonlar içeren farklı TET2, bugüne kadar yüzlerce hastalar12tespit edilmiştir. TET2 mutasyonlar hastalarda kemik iliği wt-TET214olanlarla karşılaştırıldığında genomik 5hmC seviyesinin düşük gösterir. Mutant TET2 çakma deneyler Bu mutasyonlar 5hmC düzeyleri,14-transfec...

C5 sitozin üsleri KSY dinucleotides içinde (5mCpG) baskın metilasyonu sitedeki memeli genleri1konumudur. Buna ek olarak, son çalışmalar bir dizi sigara CpG siteler kapsamlı C5 sitozin metilasyonu (5mC) ortaya (5mCpH, nerede H = A, C veya T)2,3. 5mC değişiklik endojen retrotransposons ve gen Rehberleri3,4,5, transkripsiyon bir susturucu olarak hizmet vermektedir. DNA metilasyonu 5mC, aynı zamanda X kromozomu inactivation, gen sürecinden, nükleer yeniden programlama ve doku özel gen ifade5,6,7önemli rol oynar. C5 konumundaki sitozin metilasyonu DNA methyltransferases tarafından yürütülen ve önemli gelişimsel kusurlar8bu enzimler mutasyonların neden. 5mC işaretleri kaldırılması TET1-3 5mC oxidases9,10tarafından başlatılan. Bu TET-aile dioxygenases 5mC değiştirmek içine 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxylcytosine (5caC) tarafından sıralı oksidasyon adımları11,12,13. Son olarak, timin-DNA glycosylase 5 fC veya değiştirilmemiş sitozin baz eksizyon tamir yol11kullanarak için 5caC yerini alır.
İnsan TET2 gen myelodisplastik sendrom (MDS)14,15,16, MDS miyoproliferatif neoplazmlar () de dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik maligniteler sık mutasyona uğramış bir gen olarak tespit edildi MDS-MPN) ve MDS ve MDS-MPN16kaynaklanan akut miyeloid lösemi (AML). Vahşi türü (wt) olanlar karşılaştırıldığında TET2 mutasyonları ile kemik iliği DNA 5hmC değişiklik düzeyde hastalarda alt-TET214. Grup sayısı normal hematopoiesis ve myeloid dönüştürme17,18,19,20rolünü aydınlatmak için TET2-nakavt fare modelleri geliştirdi. Bu fareler TET2 gen mutasyonları ile başlangıçta normal ve uygun, ama onlar kendi erken ölümüne neden olan yaşlı gibi çeşitli hematopoetik maligniteler ortaya. Bu çalışmalar normal hematopoetik ayrımında wt TET2 oynadığı önemli roller gösterdi. Bu fare modelleri, heterozigoz hematopoetik kök hücre (TET2+ / HSCs) ve homozigoz TET2- / - HSCs hematopoetik soy kullanıma her iki TET2+/- içinde homozigoz wt-TET2 HSCs rekabet avantajı vardı ve TET2- / - HSCs çeşitli hematopoetik maligniteler17,18. Bu çalışmalar dioxygenase HSCs gelişimi değiştirir ve hematopoetik maligniteler sonuç TET2 bu haploinsufficiency göstermektedir.
Benzer şekilde TET2 gen mutasyonları ile fareler, çoğu lösemi hasta haploinsufficiency TET2 dioxygenase faaliyet gösterecektir. Bu çoğunlukla Heterozigoz somatik mutasyon TET2 gen vücut çoğu missense mutasyon süre boyunca dağınık çerçeve-shift ve anlamsız mutasyon dahil dioxygenase etki alanı12' kümelenmiş. Bugüne kadar küçük karakterizasyonu wt mutant TET2, özellikle TET2 dioxygenase ve onun tahlil21üretimi ile zorluklar nedeniyle literatürde bildirilmektedir. Burada, yerel TET2 dioxygenase İyon Kromatografi kullanarak basit bir tek adım arıtma raporu. Ayrıca, nicel bir LC-MS/MS tahlil en iyi duruma getirilmiş ve yerli TET2 dioxygenase enzim aktivitesini ölçmek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Karbosentez</td><td>FH31182</td><td></td></tr><tr><td>Demir(II) sülfat heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Ketoglutarik asit (2-Oksoğutarik asit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>L-Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo temiz ve yoğunlaştırıcı</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 Nükleaz</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>CIAP (Buzağı bağırsak alkalin fosfataz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Karbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [2- (N-Morfolino) etansülfonik asit monohidrat]</td> <td>Karbosentez</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SP Sefaroz</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksi-5-metilsitidin</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksi-5-hidroksimetilalsitidin</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksisitidin-5-karboksilik asit, sodyum tuzu</td><td>Berry ve Amp; İştirakler</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-Formil-2'-deoksisitidin</td><td>Berry & İştirakler</td><td>PY 7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksisitidin</td><td>Berry & İştirakler</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksiadenozin</td><td>Karbosynth</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksiguanozin</td><td>Karbosynth</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksitimidin</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi teknolojisi</td><td>Thermo Fisher</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Allegra X-15R santrifüj&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator 550</td><td>Fisher Scientific</td><td>XL2020</td><td></td></tr> <tr><td>ve AUML; KTA FPLC sistemi</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 4.5 freeze dry sistemi</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Zymo Oligo arıtma kolonları&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 sütun</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Q-Trap kütle spektrometresi</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>Shimadzu HPLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK16/20 FPLC sütunu</td><td>Pharmacia (GE Sağlık)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

etkili arınma ve on-eleven translocation-2 5-metilsitozin dioxygenase için tahlil lc-ms/ms tabanlı geliştirme

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

5-metilsitozin tarafından (5mC) aracılı epigenetik transkripsiyon yönetmelik ökaryotik gelişiminde önemli bir rol oynamıştır. Demethylation bu epigenetik izlerini timin-DNA glycosylase bağımlı baz eksizyon tamiri tarafından takip sıralı oksidasyon on-on translocation dioxygenases (TET1-3), tarafından sağlanır. TET2 gen genetik mutasyonlar nedeniyle veya diğer epigenetik mekanizmalar tarafından inactivation çeşitli kanserler, özellikle hematopoetik maligniteler olan hastalarda kötü prognoz ile ilişkilidir. Burada, enzimatik etkin etiketsiz insan TET2 dioxygenase ba * exchange Kromatografi kullanarak verimli tek adım arınma açıklayın. Biz daha fazla ayrı ve dört normal DNA baz (A, T, G ve C), (5-metil, 5-hydroxymethyl, 5-formyl ve 5-karboksil) dört değiştirilmiş sitozin baz yanı sıra ölçmek bir sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yaklaşım sağlar. Bu tahlil etkinlik vahşi türü ve mutant TET2 dioxygenases değerlendirmek için kullanılabilir.

TET-aile dioxygenases tarafından DNA ' 5mC dinamik modifikasyonu epigenetik transkripsiyon yönetmeliğinde önemli rol oynar. TET2 dioxygenase sık sık çeşitli hematopoetik maligniteler12' mutasyona uğramış. Normal geliştirme ve hastalık TET2 enzimi rolünü araştırmak için biz-klonlanmış herhangi bir benzeşme etiketi olmadan en az catalytically etkin etki alanı pDEST14 vektör22. Etiketsiz TET2 dioxygenase bakteriyel SDS SAYFALIK analizde toplam ...

Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Bu yöntem epigenetik ve TET2 aracılı 5-Metiyatozin demetilasyon alanında normal ve klinik TET2 mutasyonlarının aktivitesinin analizigibi anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı yerli TET2'nin tek bir adımda saflaştırılaması ve faaliyetinin her üç ürünün oluşumu açısından analiz edilebilmektedir. Birkaç lisansüstü öğrenci prosedürü gösterecektir.Protein arınması Chayan Bhattacharya, Aninda Sundary Dey'nin TET2 tahlilleri ve Navid Ayon'un LC-MS/MS analizi ile gerçekleştirilecektir. Bakteriyel dönüşüm için, 1.7 mililitrelik bir tüpte kimyasal olarak yetkin 100 mikrolitre E.coli BL21 DE3 hücresine etiketsiz insan TET2 dioksijenaz içeren bir mikrolitre rekombinant pDEST 14 hedef ekspresyonu vektörü ekleyin. En az 15 dakika buz üzerinde kuluçka sonra, ısı bir su banyosunda 30 saniye boyunca 42 santigrat derece karışımı şok.Isı şokundan hemen sonra, hücreleri en az iki dakika buza geri yerleştirin. Bunu takiben, hücrelere katabolit baskı ile süper optimal suyu 250 mikrolitre ekleyin. Bir shaker içinde 37 santigrat derece bir saat için bakteri hücreleri kuluçka.Kuluçkadan sonra, tüpü 9,000 kat yerçekimini bir dakika lığına santrifüj ederek hücreler

efficient-purification-lc-msms-based-assay-development-for-ten-eleven

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.

Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) enzimatik substrat protokatechuic asit kullanarak sulu bir sistemden serbest diatomik oksijen kaldırabilirsiniz (PCA). Bu protokol, bu oksijen atma enziminin ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivite analizini açıklar.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Burada, bir cDNA ara ürünü olmadan kısa RNA'yı (çalışma başına &lt;35 nt) dizilemek için doğrudan bir yöntem olarak ve tek bir çalışmada tek baz hassasiyetinde farklı nükleotid modifikasyonlarını dizilemek için genel bir yöntem olarak kullanılabilen LC-MS tabanlı bir dizileme yöntemi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Yuvarlanma çemberi geliştirilmiş enzim aktivitesi tespit testi kullanılarak topoizomeraz 1 aktivitesinin hassas ve kantitatif tespiti için bir protokol tanımlanmıştır. Yöntem, saflaştırılmış bileşenlerden veya hücre / doku ekstraktlarından topoizomeraz 1 aktivitesinin tespit edilmesini sağlar. Bu protokol, enzimatik aktivitenin tespitini içeren herhangi bir alanda geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Ham Biyolojik Numunelerde Topoizomeraz 1 Aktivitesinin Basit ve Hızlı Yuvarlanan Daire Amplifikasyonuna Dayalı Tespiti

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Keşfedin tek adımlı iyon değişim kromatografisi ile TET2 protein arıtma ve LC-MS/MS tabanlı aktivite analizi yöntemini. Bu protokol epigenetik araştırmalarında normal ve klinik TET2 mutasyonlarının incelenmesine olanak tanır.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

Daha fazla video keşfet