Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Bu yöntem, genomik ve gen regülasyonu alanında, güçlendiriciler olarak da bilinen çoklu gen düzenleyici bölgelerin transkripsiyonu kontrol etmek için birlikte nasıl çalıştığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, gen regülasyonunda yer alan bölgeleri hızlı bir şekilde tanımlamak için birden fazla farklı genin yakınındaki çoklu güçlendiricilerin aynı anda test edilebilmesidir. Kılavuz RNA tasarımına başlamak için, önce metin protokolünde açıklandığı gibi DNA dizileri oluşturun.

Düşük hedef dışı kılavuz RNA'ları bulmak için oluşturulan DNA dizileri üzerinde E-CRISP gibi bir program kullanın. Kılavuz RNA'lar, S.pyogenes'ten dCas9 için NGG şeklini alan bir protospacer-bitişik motifin yukarısında 20 nükleotidden oluşur. E-CRISP web sitesinde, açılır menüyü kullanarak ilgilendiğiniz organizmayı seçin.

Genom düzeneği, tür adının sağında görünür. Giriş FASTA dizisi radyo düğmesini seçin. FASTA dizilerini yukarıdan kopyalayın ve iletişim kutusuna yapıştırın.

Her dizi için bir FASTA başlığının dahil edildiğinden emin olun. Açılır menüden orta radyo düğmesini ve Tek tasarım'ı seçin. Tek gRNA aramasını başlat düğmesine tıklayın.

Yeni bir tarayıcı sekmesi açılacak ve sonuçlar görüntülenecektir. Düğmesine tıklayarak aday dizilerini indirin, Tüm sorgu dizileri için birlikte Excel formüle edilmiş bir tablo raporu indirin. Ardından, aday tam uzunlukta kılavuz RNA dizilerini genoma yönlendirmek için UCSC genom tarayıcısını kullanın.

Bir tarayıcıda, UCSC genom tarayıcısı web sitesine gidin. Araçlarımız bölümünün altında BLAT kelimesini bulun ve üzerine tıklayın. BLAT arama aracı açılacaktır.

İlgilendiğiniz organizmayı ve genom montajını seçmek için BLAT arama genom metninin altında bulunan açılır menüleri kullanın. E-CRISP tarafından oluşturulan tablo raporundan kılavuz RNA dizilerini kopyalayın ve bunları iletişim kutusuna yapıştırın. Her dizinin benzersiz FASTA başlığına sahip olduğundan emin olun, ardından iletişim kutusunun altındaki gönder'i tıklayın.

BLAT arama sonuçları sayfasında, her bir kılavuz RNA dizisinin hizalamaları görünecek ve her satır bir hizalamayı temsil edecektir. İdeal olarak, her kılavuz RNA için, o kılavuz RNA'nın benzersizliğini gösteren bir hizalama olmalıdır. Mümkünse, genomdaki birden fazla konuma eşlenen kılavuzlardan kaçının.

İlgilenilen bölge içindeki kılavuz RNA lokalizasyonunu ve dağılımını incelemek için, sorgulanan kılavuz RNA'lardan biri için Eylemler bölümünün altındaki tarayıcı bağlantısına tıklayın. Genom tarayıcısı görünecek ve seçilen kılavuz RNA'ya odaklanacaktır. E-CRISP tarafından tanımlanan diğer kılavuz RNA'ların ilgilenilen bölge içindeki dağılımını görselleştirmek için sayfanın üst kısmındaki uzaklaştırma düğmelerini kullanın.

İlgilenilen bölge boyunca dağıtılmış, tercihen örtüşmeyen, kılavuz RNA'ları seçin. İlgilenilen bölge 600 baz çiftini aşarsa, bir ila iki ek kılavuz eklemeyi düşünün. Homopolimerik esnemelere ve aşırı GC içeriğine sahip kılavuz RNA'lardan kaçının, çünkü bu özellikler kılavuz RNA klonlama sürecini engelleyebilir ve kılavuz RNA hedefleme verimliliğini azaltabilir.

Kılavuz RNA oligolarını ultra saf suda 100 mikromolar nihai konsantrasyonda sulandırın. İlgilenilen her bölge için en az dört ayrı kılavuz RNA oligosu olmalıdır. Her düzenleyici ilgi alanı için, ilgilenilen bölgeye karşılık gelen tüm oligolardan oluşan bir havuz oluşturun.

Bir Eppendorf tüpünde, her bölge için her bir yeniden yapılandırılmış kılavuz RNA oligosunun beş mikrolitresini birleştirin. Havuzu girdap yaparak iyice karıştırın, ardından bir mikrolitre çıkarın ve bu eloquat 1'den 200'e kadar ultra saf suda seyreltin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi oligolara homoloji bölgeleri eklemek için USICS primerleri ile kısa bir PCR gerçekleştirin.

Her oligoya yaklaşık 40 baz eklenecek ve her iki uçta USIC hayaletine yeterli homoloji içeren yaklaşık 100 baz çifti ürünü elde edilecektir. Ardından, buz üzerinde Gibson Assembly reaksiyonlarını ayarlayın. 20 mikrolitrelik bir reaksiyonda 50 nanogram sindirilmiş vektör ve yedi nanogram ek kullanın.

Ayrıca, 50 nanogram vektör kullanarak ve eki suyla değiştirerek yalnızca sindirilmiş vektör içeren bir Gibson Assembly reaksiyonu ayarlayın. Gibson Assembly reaksiyonlarını 50 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, ardından 4 santigrat derecede tutun. Birleştirilen ürünleri buza aktardıktan sonra, buz üzerinde ultra saf suda 1'e 4 oranında seyreltin.

Örneğin, 15 mikrolitre ultra saf suya beş mikrolitre Gibson Assembly ürünü ekleyin. Ardından, seyreltilmiş Gibson Assembly ürünlerini dönüştürün. Yüksek verimli yetkin hücreleri buzun üzerine bırakın ve her dönüşüm için 25 mikrolitrelik eloquat yapın.

Birden çok siteyi hedefleyen karmaşık bir havuz isteniyorsa, birden çok bağımsız dönüşüm gerçekleştirmek için yeterli sayıda hücreyi farklı tüplere bırakın. Dönüştürülmüş hücrelerin 50 mikrolitresini plakalayın ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Tek tek bölgeleri hedefleyen havuzların mini hazırlıkları için, hücreleri doğrudan ampisilin veya karbenisilin içeren üç ila beş mililitre LB suyuna yerleştirin.

Hücreleri gece boyunca 250 rpm ve 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Büyük kitaplıklar için, her bir plakadaki tüm kolonileri tek bir maxi-prep'te toplamak için bir plaka kazıyıcı kullanın. Bu, uygun antibiyotikle birlikte yaklaşık beş mililitre LB'nin 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne dökülmesi ve kolonilerin tüpe kazınmasıyla kolaylaştırılabilir.

Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri 24 oyuklu bir plakada,% 30 ila 50 birleşme hızında plakalayın. Transfeksiyonların çift olarak gerçekleştirilebileceği şekilde yeterli sayıda hücreyi plakalayın ve kontrol kılavuzu RNA'ları ile transfekte edilecek kuyuları dahil edin. Hücre kaplamasından sonra plakayı hafifçe sallayarak hücrelerin kuyu boyunca eşit olarak dağıldığından emin olun.

İlk 15 dakikada bir her beş dakikada bir çalkalayın. Ertesi gün, tercih edilen transfeksiyon reaktifinin talimatlarına göre transfeksiyonları hazırlayın. Ishikawa hücreleri için, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu için 550 nanogram toplam plazmit kullanın.

Plazmitleri serum içermeyen ortamda mililitre başına 020 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Her bir mikrogram DNA için üç mikrolitre transfeksiyon reaktifi kullanın, hafifçe girdap yapın ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 25 mikrolitre son karışım ekleyin.

% 1 beta-merkaptoetanol ile yeterli miktarda lizis tamponu hazırlayın. Ortamı bir vakum aspiratörü kullanarak aspire edin. Hücreleri bir kez eşit hacimde 1x PBS ile yıkayın ve mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarmak için aspire edin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak her oyuğa 300 mikrolitre lizis BME çözeltisi ekleyin. Lizis çözeltisini sekiz ila on kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve buz üzerinde derin bir kuyu plakasına veya 1.7 mililitre Eppendorf tüplerine aktarın. RNA hemen ekstrakte edilebilir veya lizatlar gelecekteki işlemler için eksi 80 santigrat derecede dondurulabilir.

MMP17 yakınındaki üç transkripsiyon faktörü bağlanma bölgesi için kılavuz RNA tasarımları gösterilmiştir. Hedef bölge, ChiP-seq tarafından tanımlandığı gibi ER alfa için bağlanma bölgesidir ve bu bölge boyunca dört kılavuz RNA döşenir. Burada, USIC'in dahili primerleri kullanılarak kısa bir PCR'den sonra beklenen kılavuz RNA ürünü gösterilmektedir.

Reaksiyon, 59 baz çifti kılavuz RNA fragmanının her bir ucuna 20 baz çifti dizisi ekleyecek ve yaklaşık 100 baz çifti dizisi ile sonuçlanacaktır. MMP17'deki bir Enhancer-I deneyinden elde edilen kalitatif PCR sonuçları gösterilmektedir. Enhancer-I tarafından hedeflenen siteler siyah bir altıgen ile gösterilir.

1. ve 2. bölgeler, MMP17'nin tam östrojenik yanıtı için gereklidir, ancak 3. bölge katkıda bulunmaz. Site 1 kendi başına bazı ifadelere katkıda bulunabilir, ancak en büyük etkinlik site 1 ve 2 aktif olduğunda görülür. İlgilenilen hücre hattı için optimize edildikten sonra, bu teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse beş ila yedi gün içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, Enhancer-I için kılavuz RNA'ların nasıl tasarlanacağını, karmaşık kılavuz RNA havuzlarının nasıl oluşturulacağını ve transfekte edileceğini ve transfekte edilmiş hücrelerin nasıl hasat edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu işlemi denerken, steril bir doku kültürü ortamının sürdürülmesi ve RNaz ve DNaz içermeyen materyallerin kullanılması önemlidir. Bu prosedürü takiben, ChiP-seq ve RNA-seq gibi diğer yöntemler, Enhancer-I'in genomun neresine bağlandığı ve küresel gen ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların epizomal raportörler kullanmak yerine, insan genomundaki endojen lokuslarda östrojen kaynaklı gen regülasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Memeli doku kültürü ortamlarında çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.