Name: Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin, SID4X-dCas9-KRAB füzyon proteini kullanarak hücre hatlarında çoklu artırıcı hedefleme yöntemini. Bu protokol, gen ekspresyonunu düzenleyen artırıcıları hızla tanımlamak için etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH/NHGRI R00 HG006922 ve NIH/NHGRI R01 HG008974 J.G. için ve avcı Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. J.B.C. genetik T32GM007464 NIH eğitim programında tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadow+enhancers+foster+robustness+of+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation.</a> Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).</li>
<li>Lam, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+redundant+enhancers+cooperatively+maintain+Mammalian+pomc+expression+above+a+critical+functional+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT%2F+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li>
<li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
<li>Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Engineering+and+Analysis+of+Combinatorial+Enhancer+Activity+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells.</a> Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).</li>
<li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li>
<li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li>
<li>Stampfel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+form+diverse+groups+with+context-dependent+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions.</a> Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Inducible+CRISPR-dCas9-KRAB+Effector+System+to+Dissect+Transcriptional+Regulation+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).</li>
<li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).</li>
<li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı fiziksel olarak DNA dizisi değiştirmeden artırıcı fonksiyon için endojen genomik locus dissekan için basit ve esnek bir yöntem açıklanır. Benzer olsa da kavram dCas9 KRAB27kullanarak daha önce yayımlanmış CRISPR girişim iletişim kuralları, Enhancer-i 3 ana şekilde bu iletişim kurallarından farklıdır. İlk olarak, Enhancer-i artırıcı devre dışı bırakma ulaşmak için MAD120 SIN3A etkileşen etki alanı kullanır. Artırıcı devre dışı bırakma HDAC inhibitörleri, devre dışı bırakma birincil mekanizma HDAC bağımlı olduğunu düşündüren kullanarak kurtarıldı. CRISPR dCas9-KRAB müdahale, Enhancer-i H3K9me3 birikimi yol açmaz. Gerçeğini Enhancer-i RNA'ların, transfection 3 gün hasat hücreleri ile göndermek Kılavuzu geçici giriş üzerinde dayanır nedeniyle muhtemeldir. CRISPR müdahale, 7 gün mesaj iletim12, H3K9me3 bir artış görülmektedir. Son olarak, birden çok siteyi aynı anda hedef ve hedefleme etkinliğini izlemek için bir strateji Enhancer-i Protokolü sağlar. Mozaik-seq17, dCas9-KRAB aynı anda birden fazla arttırıcılar hedeflemek için kullanılır ama bu tekniği ifade değişiklikleri tanımlamak için tek hücreli RNA sıralama dayanıyor ve (gibi östrojen duyarlı genler) birçok genler nedeniyle düşük undetected gitmek tek hücreli RNA-seq. Enhancer-i duyarlılığını ayrı ayrı ve birlikte herhangi bir gen arttırıcılar çalışmak için güvenilir bir yöntem sağlar.
En kritik artırıcı-i transfection, faiz hücre satırı için optimize edilmelidir adımdır. Puromisindir tedavi transfected hücreler için zenginleştirmek için bu protokolü kullanır ama bu ortak transfecting RNA'ların floresan bir protein ve Kılavuzu akış sitometresi kullanarak floresan hücreleri için sıralama bazı hücre için daha iyi bir zenginleştirme yöntemi olarak kanıtlamak Mayıs mümkündür türleri. İfade düzey kılavuzun RNA'ların ve SID4x-dCas9-KRAB gidermek ve transfection onaylamak için qPCR tarafından izlenmesi tavsiye ediyoruz. Kılavuzu RNA düzeyleri düşüktür (döngüsü eşik > 30), kullanıcılar ayrıca RNA üretim stratejileri vitro transkripsiyon28gibi alternatif Kılavuzu düşünün. Yüksek gRNA düzeyleri rağmen Kılavuzu RNA SID4x-dCas9-KRAB protein verimsiz hedefliyor, bu durumda farklı Seçme Kılavuzu RNA dizilerinin gerekli olabilir olanağı da sağlar. Füzyon proteini ile kromatin Enhancer-i tedavi hücrelerden üzerinde ChIP-seq gerçekleştirerek, hedefleme verimliliğini takip edilebilir. SID4x-dCas9-KRAB adlı bölge ilgi yüksek sinyal ve onun sözde hedef gen ifade değişiklik tespit edilir ise, o zaman büyük olasılıkla bölge okudu koşullar altında bu gen ifadesi için katkı sağlamamaktadır.
Bir potansiyel Enhancer-i çok fazla siteleri aynı anda hedeflenir Eğer hedef kapalı etkileri birikebilir kısıtlamasıdır. Yine de, özellikle dCas9 KRAB ifade poliklonal hücre satırı kullanıldığında CRISPR müdahale stratejileri nakavt için az daha RNAi29, hedef etkileri off olmasını. SID4X-dCas9-KRAB hedef kapalı genomik bağlama 10 site aynı anda hedeflerken gördün mü iken, biz gen ifade değişikliklerin sonucu olarak bağlama olayları belirlenememiştir. Bazı arttırıcılar birden çok organizatör ve/veya diğer arttırıcılar ile temasa geçebilirsiniz, gen düzenlemesi bu tür ortak ise belirsiz olmasına rağmen birçok gen ifade tek bir artırıcı hedefleme üzerine değişebilir mümkündür. İfade değişiklikleri belirli bir artırıcı hedefleme nedeniyle çoğu gözlenen onaylamak ve off-efektler hedef değil için Kullanıcı Kılavuzu aynı bölge hedefleme RNA'ların üst üste iki farklı kümesi ile Enhancer-i gerçekleştirebilirsiniz. Buna ek olarak, nükleaz yetkili Cas9 kullanarak bölge genetik silinmesi daha fazla gen ekspresyonu üzerindeki etkileri onaylayabilirsiniz.
Histon deasetilasyonu, aracılığıyla Enhancer-i işlevleri olarak devre dışı bırakma yetenekleri histon asetilasyon kayda değer düzeyine sahip arttırıcılar sınırlıdır mümkündür. Belirli arttırıcılar hedefleme daha etkili olabilir alternatif baskıcı füzyon çeşitli vardır. DNA metiltransferaz füzyon dCas9 için distal arttırıcılar30' a hedef zaman gen ekspresyonu azaltmak için kullanılabilir, ancak bu baskı genellikle geçici değildir. Başka bir baskıcı füzyon histon H3 lizin 27 trimethylation yol açar..... .şarap gen ekspresyonu dCas9-KRAB için benzer düzeyde hücre satırları ve rehberleri31çeşitli, GATA1 arkadaş (FOG1) etki alanı kullanır. İlginçtir, dCas9 için FOG1 daha fazla kopya ekleme rehberleri, SID'si etki alanı tek bir kopyasını şu anda Enhancer-i içinde kullanılan 4 kopya daha daha fazla artırıcı deaktivasyon sağlayabilir düşündüren, baskıcı potansiyel azalır. Bazı loci yukarıdaki dCas9 füzyon farklı kombinasyonları ikili hedefleme üzerinden yararlanabilir mümkündür. Örneğin, istikrarlı uzun vadeli baskı dCas9-DNMT3a ve dCas9-KRAB32eşzamanlı iletim tarafından elde edilebilir. Bu baskıcı füzyon çoğu sadece tek bir odağı bir anda hedef ve aynı anda birden fazla arttırıcılar manipüle en etkili olduğu belirsizdir.
Kullanıcı genler yüzlerce sözde arttırıcılar çalışma isterse enhancer-i, genler, bir avuç arttırıcılar kombinasyonları çalışmak için uygun bir yöntem ise biraz hala'nın üretimi sınırlı. Bu tekniğin gelecekteki uygulamalar aynı anda birden fazla örnekleri içinde birden çok gen ölçmek için görüntüleme tabanlı teknolojiler dahil edecektir. Önemlisi, bu teknolojilerin zaman alan RNA izolasyon ihtiyacını ortadan kaldırarak RNA molekülleri lysate, üzerinden doğrudan tespiti ile uyumlu. Bu uyarlamalar arttırıcılar büyük kümeleri sorgulama kolaylaştıracaktır.

Büyük ölçekli projeler kodla1, yol haritası Epigenomics2ve FANTOM gibi sıralama3 belirledik insan genomu içinde sözde arttırıcılar milyonlarca hücre türleri yüzlerce arasında. Bu her organizatörü ortalama 4,9 arttırıcılar ile ilişkilendirir ve gen ekspresyonu kez birden çok dağıtılmış düzenleyici etkileşimleri bütünleştirilmesi sonucu olduğunu düşündüren her artırıcı ortalama 2.4 genler3, ilgili kişileri tahmin edilmektedir. Bir önemli kalan sadece tek tek nasıl arttırıcılar gen ekspresyonu için katkıda tanımlamak için mücadeledir ama nasıl ifade etkiler için birleştirir. Genetik yaklaşımlar arttırıcılar fareler5 Drosophila4 model organizmalarda arasındaki ilişkileri tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Ancak, bu deneyler zaman alıcı ve düşük-üretim için birden çok gen, birden çok arttırıcılar çalışma vardır.
Artırıcı işlevi büyük ölçüde çalışmak için bir yaklaşım kitlesel paralel muhabir deneyleri içerir. Bu deneyleri DNA dizileri için yeteneklerini ifade bir muhabir gen6sürücü için binlerce eşzamanlı tarama sağlar. Bu deneyleri DNA dizisi yalnız gen yönetmelik bilgileri7iletmek için yeterli olabilir göstermiştir, onlar yerel kromatin bağlam dışında gerçekleştirilen uyarılar ve kapaklı bir organizatörü ile gelmek. Buna ek olarak, DNA dizisi kitlesel paralel muhabir deneyleri içinde analiz ediliyor genellikle ilgili çevresindeki sıra hariç tutabilirsiniz az 200 basepairs boyutudur. Muhabir deneyleri sadece bir dizi etkinlik teker teker ölçmek. gibi önemlisi, onlar dikkate arttırıcılar arasında bulunabilir karmaşık ilişkiler yapmak değil almak. Kitlesel paralel muhabir deneyleri bir DNA dizisi içsel etkinlikler hakkında bilgilendirici olabilir, böylece, onlar mutlaka bize o DNA dizisi genom bağlamında işlev bilgi yok.
Son zamanlarda gelişmiş CRISPR/Cas9 Araçlar8 kolaylaştırdı gen düzenlemesi çalışmanın arttırıcılar endojen odağı, silme için izin kadar. Ancak, aynı anda birden fazla arttırıcılar silme için genomik istikrarsızlık neden olabilir ve zaman alan ardışık artırıcı silmeleri bir tek hücre satırı oluşturmak için. Buna ek olarak, yeni genomik sıra onarım takip silme sitesinde oluşturulur ve bu dizi düzenleyici fonksiyonu kazanç olabilir. Cas9 alternatif versiyonu özellikle gen ekspresyonu,9,10 etkinleştirme veya11,12 etki alanlarına Cas9 nükleaz eksikliği şeklinde bastırmak füzyon güvenerek oransal için geliştirilmiştir (dCas9). Bu füzyon proteinler onlar fiziksel olarak DNA dizisi alter, bunun yerine bir düzenleyici bölgesi sorgulamak için epigenetik modüle olarak ve aynı anda birden fazla loci eğitimi için idealdir. En çok kullanılan baskıcı KAP1 Co önleyici karmaşık acemi, baskı ilişkili histon H3 lizin 9 trimethylation (H3K9me3)13birikimi teşvik KRAB, birleşimidir. dCas9-KRAB, olarak da bilinen CRISPR girişim14, hedef ve ekran bireysel arttırıcılar gen ifade15,16katkılarından dolayı kullanılmıştır; Ancak, bu aynı anda birden çok bölge hedefleme için optimize edilmiş değil. Çok katmanlı CRISPR girişim arttırıcılar, mozaik-seq17, için bir sürüm tek hücre RNA-seq bir okuma kullanır ama bu teknoloji pahalı ve yalnızca tek hücre düşük duyarlılık nedeniyle son derece ifade genler incelenmesi uygundur RNA-devamı.
Kombinatorik artırıcı işlev bağlamında, östrojen transkripsiyon bir yanıt dissekan için girişim tabanlı bir CRISPR yöntem geliştirmek için çalıştı. Yaklaşık yarısı östrojen duyarlı genlerin birden çok arttırıcılar olabilir östrojen yanıt olarak katılan ve düzenleyici mantık gerektirecektir anlama olduğunu düşündüren östrojen reseptör Alfa (ER) tarafından18, bağlı 2 veya daha fazla artırıcılar içeren aynı anda birden fazla arttırıcılar hedefleme. İlk çalışmalar CRISPR girişim Organizatör kullanarak tüm rehberleri KRAB-aracılı baskı19' a eşit derecede duyarlı ettiği gibi dCas9 için ayrı baskıcı etki alanı eklenmesi, etkinliğini kolaylaştırabilir gerekçeli çeşitli arttırıcılar. Histon uyku21, işe alım açar gibi Sin3a etkileşim etki alanı, Mad1 (SID)20 hangi transkripsiyon aktivitesiyle ilişkili histon asetil grupları kaldırmak seçtik. Önemlisi, SID'si etki alanı dCas922 ve TALEs23erimiş zaman gen ekspresyonu azaltılmasını etkili oldu ve Sin3a artırıcı sıra bağlamlarda24çeşitli güçlü bir baskıcı ortak faktör gösterdi. Biz 10 farklı arttırıcılar ER tarafından bağlı hedeflemek için SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) kullanılan ve östrojen transkripsiyon yanıt 4 genler18için gerekli olan ER bağlayıcı siteleri (ERBS) tanımlar. Biz de östrojen transkripsiyon yanıt üretimde işbirliği siteleri tanımlamak için arttırıcılar kombinasyonları hedefli. En fazla 50 siteler potansiyel olarak aynı anda tespit gen ifade değişikliklerle hedeflenebilir ki bulduk. ChIP-seq ve RNA-seq kullanarak, Enhancer-i aynı anda birden fazla arttırıcılar eğitim için çok özel bir teknik olduğunu gösterdi.
Bu protokol için Enhancer-i, bir doku kültürü ortamında aynı anda birden fazla arttırıcılar fonksiyonel çalışma sağlayan esnek bir teknik gerçekleştirme adımları açıklar. Artırıcı-i genetik silme işlemine son derece ilişkilidir ama histon uyku (HDACs) üzerinde bağlıdır geçici etkinliğini kaldırmayı sağlar. Kılavuzu RNA'ların aksine viral vektörler aracılığıyla kararlı tümleştirme geçici transfection üzerinden sunarak, bu iletişim kuralı ifade ve potansiyel H3K9me3 yayılmasını önler. Bu protokolü ayrıntılar kılavuzu RNA tasarım ve Gibson derleme yolu ile transfection, klonlama RNA'ların lipofection kullanma kılavuzu ve qPCR tarafından elde edilen gen ekspresyon Analizi değiştirir. Biz de Enhancer-i genom ve transcriptome düzeyinde hedefleme özgüllüğü değerlendirmek için yöntemler içerir. Bu teknik eğitim için geliştirilen gen düzenlemesi er arttırıcılar insan kanser hücre hatlarında bağlı, herhangi bir memeli artırıcı diseksiyon için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>ZR 96 kuyulu Hızlı RNA Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Güç SYBR Yeşil RNA'dan CT'ye 1 Adımlı</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>AflII kısıtlama enzimi</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Tamponlu Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Montaj Ana Karışımı</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA Temiz & Yoğunlaştırıcı Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>İnsan: Ishikawa hücreleri</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac tavşan poliklonal</td><td>Aktif Motif&nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 tavşan poliklonal</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>BAYRAK fare monoklonal</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER alfa tavşan poliklonal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro plazmid</td><td>Eklentisi&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen ve ark., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector plazmid</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali ve ark., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 puromisin plazmidi</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton ve ark., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB plazmid</td><td>Ekle&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton ve diğerleri, 2017</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraSaf DNase/RNaz İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Örgülü mRNA-Seq Kiti, KAPA mRNA Yakalama Boncukları</td><td>Kapa Biyosistemleri</td><td>KK8420</td><td></td> ile</tr><tr><td>Pierce Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Mini Tabletler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Genetikin Seçici Antibiyotik (G418 Sülfat) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Et</td><td>Suyu ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep</td><td>Kiti Zymo Araştırma</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yüklemeli Mor 2 Günlüklü DNA Merdiveni</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında multiplex artırıcı crispr tabanlı girişim kullanma

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Birden çok arttırıcılar, genellikle belirli bir gen düzenleyen henüz çoğu genler için bu hangi arttırıcılar gen ekspresyonu için gereklidir ve bu arttırıcılar transkripsiyon bir yanıt üretmek için birleştirmek nasıl belirsizdir. Arttırıcılar milyonlarca tanımlandığı gibi yüksek üretilen iş araçları bir genom geniş ölçekte artırıcı işlevini belirlemek için gereklidir. Nükleaz-usta Cas9 kullanarak genetik silme işlemlerini yapma artırıcı işlev eğitim için geçerli yöntemleri içerir, ancak birden çok ardışık klonal hücre satırı olmalıdır gibi bu tekniği kullanarak birden çok arttırıcılar Kombinatorik etkileri çalışma zordur oluşturulan. Burada, Enhancer-i, onların endojen loci, aynı anda birden fazla arttırıcılar fonksiyonel sorgulama için izin veren bir CRISPR parazit tabanlı yöntem mevcut. Artırıcı-i nükleaz eksikliği için erimiş iki baskıcı etki alanlarının Cas9, SID ve KRAB, artırıcı deaktivasyon histon deasetilasyonu hedeflenen loci, üzerinden elde etmek için kullanır. Bu iletişim kuralı Kılavuzu RNA'lar hedef bölgeleri geçici inactivation etkinleştirmek için geçici transfection kullanır ve doku kültürü ayarları uyaranların indüklenebilir transkripsiyon yanıtlarını engelleme özellikle etkilidir. Artırıcı-i genomik hedefleme ve küresel gen ekspresyonu üzerindeki etkileri hem de çok özel. Bu iletişim kuralı elde edilen sonuçlar bir artırıcı gen ekspresyonu, katkı büyüklüğü ve katkı tarafından yakındaki diğer arttırıcılar nasıl etkilenir katkıda olup olmadığını anlamak için yardımcı.

Şekil 1 bir şematik iletişim kuralında tanımlanan iş akışı gösterir. ER-bağlı arttırıcılar östrojen düzenlenir gen ChIP-seq (Şekil 2A) ile tanımlanan 3 bağlayıcı siteleri yakın olan MMP17, yakınındaki katkılarıyla RNA'ların yol belirlemek için her bölge için dizayn edilmiştir. Kılavuzu RNA'lar, sıra her ER çevreleyen bir 600-900 bp pencere tasarlamak için ilgi bağlama sitesi seçilen ve Kılavuzu RNA tasarım programına. Kılavuzu kaynaklanan RNA 0-2 hedeften siteleri BLAT kullanarak insan genomu uyumlu tahmin diziler. Dört üst üste rehberlik ChIP-seq tarafından tanımlanmış bölgesine yayılmış RNA'ların ve DNaseI aşırı duyarlılık (Şekil 2B) hedefleme için seçildi. (Tablo 1) ek sırası aşağı akım klonlama ve sonucu olan 59 nükleotit parçaları sipariş edilen kolaylaştırmak için her iki ucu için eklendi. Elimize RNA'ların seyreltilmiş ve site ve kısa bir PCR tarafından havuza alınmış Kılavuzu Homoloji bölgeler önce Gibson derleme eklemek için gerçekleştirildi. Beklenen Kılavuzu RNA ürün dizisinin 20 basepairs 59 basepair her sonuna kadar ekleyecek olan "U6_internal" primerler (Tablo 1), kullanılarak kısa bir PCR sonra Kılavuzu RNA parça, bir ~ 100 basepair sırada ortaya çıkan Şekil 2C gösterir. Gibson derleme, bu kılavuzu RNA havuzları bakteri dönüştürülmüş ve plazmid minipreps ertesi gün hazırlanmıştır. Şekil 2B sonuçları nerede MMP17 yakın birden çok arttırıcılar yalnız hedeflenir artırıcı diseksiyon deney ve birlikte Geliștirici-i kullanarak gösterir. Enhancer-i tarafından hedef siteleri ile siyah bir altıgen gösterilir. Belirtilen Site Hedefleme Rehberi RNA plazmid stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade bir östrojen yoksun Ishikawa hücre kültürünü transfected. İki gün sonra medya değiştirildi ve puromisindir transfected hücreler için zenginleştirmek için eklendi. Ertesi gün, 8 saat 10 nM estradiol tedavi aşağıdaki hücre hasat edildi. RNA izole edildi ve bir tek adımlı qPCR gerçekleştirildi. Site 3 Bu koşullarda (Şekil 2B, şerit II-IV) katkı sağlamamaktadır Örneğin, siteleri 1 ve 2 MMP17, bir tam östrojenik yanıt için gerekli iken. Ne zaman sadece 2 veya 3 sitelerdir etkin (VI ve VII), östrojen yanıttır ne zaman yok sitelerdir için benzer aktif (VIII), bu sitelerde bağımsız olarak katkıda bulunamaz düşündüren. 1 sitesi bazı ifade katkıda bulunabilir tek başına (v), ama en büyük etkinlik siteleri 1 ve 2 etkin olduğunda görülür (IV).
(Şekil 3A), aynı anda 4 farklı genler yakınındaki 10 arttırıcılar işlemek için RNA'ların karmaşık takımlık rehberlik 42 artırıcı kılavuzları ve 16 organizatörü kılavuzları içeren oluşturulan. Kılavuzu RNA oligos Başlangıç Kılavuzu RNA uzantısı PCR (adım 3.3) önce havuza alınmış ve elde edilen PCR ürünleri Saflaştırılmış ve Gibson derleme kullanarak boş puromisindir U6 klonlama vektör ile kombine. Gibson derleme birden çok bağımsız dönüşümleri gerçekleştirilen ve kaplama. Tabakları LB kazınmış ve 2-4 h önce maxiprep için dışarı büyümeye izin. Bu kılavuzu RNA havuzları stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade bir östrojen yoksun Ishikawa hücre kültürünü transfected ve (Şekil 2B) açıklandığı gibi tedavi Şekil 3B temsilcisi indirimleri gen ifadesinde qPCR tarafından gösterir. İndirimleri Enhancer-i gelen sözde hedef gen organizatörü hedefleyerek elde edilen benzer. Şekil 3 c seyreltme kılavuzun etkileri RNA'ların Enhancer-i kullanarak östrojen yanıt azalma gösterir. 1:50 G0S2 hala yakınındaki artırıcı Hedefleme Rehberi RNA havuzu seyreltme Enhancer-i ilâ 50 hedeflemek için kullanılabilir düşündüren gen ekspresyonu önemli azalma verimleri hemen siteler. Ancak, devre dışı bırakma, daha duyarlı algılama yöntemleri istihdam edilmektedir sürece sitelerin yüzlerce aynı anda hedeflenemediği gösteren seyreltilmiş.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> Şekil 1. Protokolü Enhancer-ı. kullanarak çok katmanlı artırıcı diseksiyon için şematik Kılavuzu RNA'ların (kırmızı ve mavi) kullanarak e-net ve seçili UCSC genom tarayıcı kullanarak tasarlanmıştır. Dört kılavuzu RNA'ların bu faiz (ChIP-seq tarafından tanımlanan transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri) bölgelerinde yayılan seçilir. Faiz (kırmızı ve mavi) bölgeye göre havuza Kılavuzu RNA oligonucleotides Gibson derleme ve dönüşüm önce Homoloji bölgeleri (turuncu) eklemek için bir PCR tabi. Elde edilen plazmid havuzları stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade hücre hatları veya vahşi-türü hücre SID4X-dCas9-KRAB plazmid ile birlikte lipofection yolu ile transfected. Kılavuzu RNA plazmid havuzları ayrı ayrı bir zamanda veya aynı anda birden çok site hedeflemek için birlikte tek bir site hedeflemek için transfected. Transfected hücre kılavuzu RNA'ları içeren hücreler için zenginleştirmek için antibiyotik ile tedavi edilir. ~ 72 h sonrası transfection hücre hasat. Nükleik asitler qPCR, RNA-seq veya çip seq. için çıkarılan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> Şekil 2. Kılavuzu MMP17için RNA tasarım ve artırıcı diseksiyon. (A) genom tarayıcı ekran görüntüsü yakınındaki hedef için ER Alfa bağlı arttırıcılar (gri) MMP17. Bu rakam Carleton, et al. değiştirildi 18. (B) Kılavuzu RNA siteleri18bağlama 3 için tasarımlar. Bağlama için ChIP-seq tarafından tanımlandığı şekilde ER hedef ve 4 Kılavuzu RNA'ların kiremit bu bölgede sitedir. Bağlama Makinası açıklıklı, DNaseI hassasiyet sinyali Kılavuzu RNA tasarım için hedef sırasını tanımlamak için de kullanılabilir. ChIP-seq ve DNaseI HS veri ile 10 nM estradiol Homoloji bölgeleri eklemek için kısa bir PCR geçirmiş Gibson montaj için hazır 1 h. (C) temsilcisi Kılavuzu RNA serileri için tedavi Ishikawa hücrelerden elde edilmiştir. (D) MMP17 göreli ifade, özel bölgelerin Enhancer-i ve bir 8-h10 nM estradiol tedavi ile hedefleme takip qPCR ile ölçülür. MMP17 estradiol ile tedavi değil hücrelerdeki CTCF ve ifade düzeyini ifade görelidir. RNA'lar hedef organizatörü denetim Rehberi IL1RN. Tüm hata çubukları SEM temsil eden, çift yıldız belirtmek p &lt; 0,01 ve tek yıldız belirtmek p &lt; 0,05 eşleştirilmiş bir t-test. Bu rakam Carleton, değiştirilmiş ve ark. 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> Şekil 3. Birden çok arttırıcılar ile aynı anda farklı genler yakınındaki hedefleme havuzlu Enhancer-ı. (A) şeması bağlayıcı siteleri ve havuza alınan Enhancer-i içinde var olmak hedef için organizatör. (B) ifade E2 tedavi Ishikawa hücrelerde Enhancer-i plazmid Havuzu (yeşil), organizatörü-i plazmid Havuzu (mavi) veya kontrol gRNAs (beyaz)18transfected sonra qPCR tarafından ölçülen üzerinde etkileri. Tüm genler önemli bir azalma Enhancer-i ile görülmektedir. Bu rakam Carleton, güncellenmiştir ve ark. 18. E2 tedaviden sonra G0S2 ifade düzeyleri üzerine etkisi Ishikawa hücrelerde transfected Kılavuzu G0S2hedefleme RNA'ların farklı miktarda (C) . Hatta küçük miktarlarda Kılavuzu RNA ile önemli bir azalma görülebilir (1:50 seyreltme), ilâ düşündüren 50 siteler hedef aynı anda. Tüm hata çubukları SEM temsil eden, çift yıldız belirtmek p &lt; 0,01 ve tek yıldız belirtmek p &lt; 0,05 eşleştirilmiş bir t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td>Sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Kılavuz RNA uzantısı ve sıralama, qPCR ve füzyon protein tespiti için kullanılan astar.

Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Bu yöntem, genomik ve gen regülasyonu alanında, güçlendiriciler olarak da bilinen çoklu gen düzenleyici bölgelerin transkripsiyonu kontrol etmek için birlikte nasıl çalıştığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, gen regülasyonunda yer alan bölgeleri hızlı bir şekilde tanımlamak için birden fazla farklı genin yakınındaki çoklu güçlendiricilerin aynı anda test edilebilmesidir. Kılavuz RNA tasarımına başlamak için, önce metin protokolünde açıklandığı gibi DNA dizileri oluşturun.Düşük hedef dışı kılavuz RNA'ları bulmak için oluşturulan DNA dizileri üzerinde E-CRISP gibi bir program kullanın. Kılavuz RNA'lar, S.pyogenes'ten dCas9 için NGG şeklini alan bir protospacer-bitişik motifin yukarısında 20 nükleotidden oluşur. E-CRISP web sitesinde, açılır menüyü kullanarak ilgilendiğiniz organizmayı seçin.Genom düzeneği, tür adının sağında görünür. Giriş FASTA dizisi radyo düğmesini seçin. FASTA dizilerini yukarıdan kopyalayın ve iletişim kutusuna yapıştırın.Her dizi için bir FASTA başlığının dahil edildiğinden emin olun. Açılır menüden orta radyo düğmesini ve Tek tasarım'ı seçin. Tek gRNA aramasını başlat düğmesine tıklayın.Yeni bir tarayıcı sekmesi açılacak ve sonuçlar görüntülenecektir. Düğmesine tıklayarak aday dizilerini indirin, Tüm sorgu dizileri için birlikte Excel formüle edilmiş bir tablo raporu indirin. Ardından, aday tam uzunlukta kılavuz RNA dizilerini genoma yönlendirmek için UCSC genom tarayıcısını kullanın.Bir tarayıcıda, UCSC genom tarayıcısı web sitesine gidin. Araçlarımız bölümünün altında BLAT kelimesini bulun ve üzerine tıklayın. BLAT arama aracı açılacaktır.İlgilendiğiniz organizmayı ve genom montajını seçmek için BLAT arama genom metninin altında bulunan açılır menüleri kullanın. E-CRISP tarafından oluşturulan tablo raporundan kılavuz RNA dizilerini kopyalayın ve bunları iletişim kutusuna yapıştırın. Her dizinin benzersiz FASTA başlığına sahip olduğundan emin olun, ardından iletişim kutusunun altındaki gönder'i tıklayın.BLAT arama sonuçları sayfasında, her bir kılavuz RNA dizisinin hizalamaları görünecek ve her satır bir hizalamayı temsil edecektir. İdeal olarak, her kılavuz RNA için, o kılavuz RNA'nın benzersizliğini gösteren bir hizalama olmalıdır. Mümkünse, genomdaki birden fazla konuma eşlenen kılavuzlardan kaçının.İlgilenilen bölge içindeki kılavuz RNA lokalizasyonunu ve dağılımını incelemek için, sorgulanan kılavuz RNA'lardan biri için Eylemler bölümünün altındaki tarayıcı bağlantısına tıklayın. Genom tarayıcısı görünecek ve seçilen kılavuz RNA'ya odaklanacaktır. E-CRISP tarafından tanımlanan diğer kılavuz RNA'ların ilgilenilen bölge içindeki dağılımını görselleştirmek için sayfanın üst kısmındaki uzaklaştırma düğmelerini kullanın.İlgilenilen bölge boyunca dağıtılmış, tercihen örtüşmeyen, kılavuz RNA'ları seçin. İlgilenilen bölge 600 baz çiftini aşarsa, bir ila iki ek kılavuz eklemeyi düşünün. Homopolimerik esnemelere ve aşırı GC içeriğine sahip kılavuz RNA'lardan kaçının, çünkü bu özellikler kılavuz RNA klonlama sürecini engelleyebilir ve kılavuz RNA hedefleme verimliliğini azaltabilir.Kılavuz RNA oligolarını ultra saf suda 100 mikromolar nihai konsantrasyonda sulandırın. İlgilenilen her bölge için en az dört ayrı kılavuz RNA oligosu olmalıdır. Her düzenleyici ilgi alanı için, ilgilenilen bölgeye karşılık gelen tüm oligolardan oluşan bir havuz oluşturun.Bir Eppendorf tüpünde, her bölge için her bir yeniden yapılandırılmış kılavuz RNA oligosunun beş mikrolitresini birleştirin. Havuzu girdap yaparak iyice karıştırın, ardından bir mikrolitre çıkarın ve bu eloquat 1'den 200'e kadar ultra saf suda seyreltin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi oligolara homoloji bölgeleri eklemek için USICS primerleri ile kısa bir PCR gerçekleştirin.Her oligoya yaklaşık 40 baz eklenecek ve her iki uçta USIC hayaletine yeterli homoloji içeren yaklaşık 100 baz çifti ürünü elde edilecektir. Ardından, buz üzerinde Gibson Assembly reaksiyonlarını ayarlayın. 20 mikrolitrelik bir reaksiyonda 50 nanogram sindirilmiş vektör ve yedi nanogram ek kullanın.Ayrıca, 50 nanogram vektör kullanarak ve eki suyla değiştirerek yalnızca sindirilmiş vektör içeren bir Gibson Assembly reaksiyonu ayarlayın. Gibson Assembly reaksiyonlarını 50 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, ardından 4 santigrat derecede tutun. Birleştirilen ürünleri buza aktardıktan sonra, buz üzerinde ultra saf suda 1'e 4 oranında seyreltin.Örneğin, 15 mikrolitre ultra saf suya beş mikrolitre Gibson Assembly ürünü ekleyin. Ardından, seyreltilmiş Gibson Assembly ürünlerini dönüştürün. Yüksek verimli yetkin hücreleri buzun üzerine bırakın ve her dönüşüm için 25 mikrolitrelik eloquat yapın.Birden çok siteyi hedefleyen karmaşık bir havuz isteniyorsa, birden çok bağımsız dönüşüm gerçekleştirmek için yeterli sayıda hücreyi farklı tüplere bırakın. Dönüştürülmüş hücrelerin 50 mikrolitresini plakalayın ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Tek tek bölgeleri hedefleyen havuzların mini hazırlıkları için, hücreleri doğrudan ampisilin veya karbenisilin içeren üç ila beş mililitre LB suyuna yerleştirin.Hücreleri gece boyunca 250 rpm ve 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Büyük kitaplıklar için, her bir plakadaki tüm kolonileri tek bir maxi-prep'te toplamak için bir plaka kazıyıcı kullanın. Bu, uygun antibiyotikle birlikte yaklaşık beş mililitre LB'nin 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne dökülmesi ve kolonilerin tüpe kazınmasıyla kolaylaştırılabilir.Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri 24 oyuklu bir plakada,% 30 ila 50 birleşme hızında plakalayın. Transfeksiyonların çift olarak gerçekleştirilebileceği şekilde yeterli sayıda hücreyi plakalayın ve kontrol kılavuzu RNA'ları ile transfekte edilecek kuyuları dahil edin. Hücre kaplamasından sonra plakayı hafifçe sallayarak hücrelerin kuyu boyunca eşit olarak dağıldığından emin olun.İlk 15 dakikada bir her beş dakikada bir çalkalayın. Ertesi gün, tercih edilen transfeksiyon reaktifinin talimatlarına göre transfeksiyonları hazırlayın. Ishikawa hücreleri için, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu için 550 nanogram toplam plazmit kullanın.Plazmitleri serum içermeyen ortamda mililitre başına 020 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Her bir mikrogram DNA için üç mikrolitre transfeksiyon reaktifi kullanın, hafifçe girdap yapın ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 25 mikrolitre son karışım ekleyin.% 1 beta-merkaptoetanol ile yeterli miktarda lizis tamponu hazırlayın. Ortamı bir vakum aspiratörü kullanarak aspire edin. Hücreleri bir kez eşit hacimde 1x PBS ile yıkayın ve mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarmak için aspire edin.Çok kanallı bir pipet kullanarak her oyuğa 300 mikrolitre lizis BME çözeltisi ekleyin. Lizis çözeltisini sekiz ila on kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve buz üzerinde derin bir kuyu plakasına veya 1.7 mililitre Eppendorf tüplerine aktarın. RNA hemen ekstrakte edilebilir veya lizatlar gelecekteki işlemler için eksi 80 santigrat derecede dondurulabilir.MMP17 yakınındaki üç transkripsiyon faktörü bağlanma bölgesi için kılavuz RNA tasarımları gösterilmiştir. Hedef bölge, ChiP-seq tarafından tanımlandığı gibi ER alfa için bağlanma bölgesidir ve bu bölge boyunca dört kılavuz RNA döşenir. Burada, USIC'in dahili primerleri kullanılarak kısa bir PCR'den sonra beklenen kılavuz RNA ürünü gösterilmektedir.Reaksiyon, 59 baz çifti kılavuz RNA fragmanının her bir ucuna 20 baz çifti dizisi ekleyecek ve yaklaşık 100 baz çifti dizisi ile sonuçlanacaktır. MMP17'deki bir Enhancer-I deneyinden elde edilen kalitatif PCR sonuçları gösterilmektedir. Enhancer-I tarafından hedeflenen siteler siyah bir altıgen ile gösterilir.1. ve 2. bölgeler, MMP17'nin tam östrojenik yanıtı için gereklidir, ancak 3. bölge katkıda bulunmaz. Site 1 kendi başına bazı ifadelere katkıda bulunabilir, ancak en büyük etkinlik site 1 ve 2 aktif olduğunda görülür. İlgilenilen hücre hattı için optimize edildikten sonra, bu teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse beş ila yedi gün içinde yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, Enhancer-I için kılavuz RNA'ların nasıl tasarlanacağını, karmaşık kılavuz RNA havuzlarının nasıl oluşturulacağını ve transfekte edileceğini ve transfekte edilmiş hücrelerin nasıl hasat edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu işlemi denerken, steril bir doku kültürü ortamının sürdürülmesi ve RNaz ve DNaz içermeyen materyallerin kullanılması önemlidir. Bu prosedürü takiben, ChiP-seq ve RNA-seq gibi diğer yöntemler, Enhancer-I'in genomun neresine bağlandığı ve küresel gen ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların epizomal raportörler kullanmak yerine, insan genomundaki endojen lokuslarda östrojen kaynaklı gen regülasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Memeli doku kültürü ortamlarında çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

Embriyonik kök hücrelerden üretilen embriyoid cisimlerde yüksek iş eldeli sıralamanın ardından kantitatif kromozom konformasyon yakalama uygulamasını rapor ediyoruz. Bu teknik, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında belirli bir genin putatif arttırıcılar ve promotör bölgeleri arasındaki temasları tanımlamaya ve quantitate sağlar.

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Protokol, plazmid DNA transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyonu kullanılarak insan hücre hatlarında Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı epigenom düzenleme yöntemlerini açıklar.

Plazmid DNA Transfeksiyonu ve mRNA Nükleofeksiyon Dağıtımı Kullanılarak İnsan Hücrelerinde CRISPR Epigenom Düzenleme

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Öğrenin, SID4X-dCas9-KRAB füzyon proteini kullanarak hücre hatlarında çoklu artırıcı hedefleme yöntemini. Bu protokol, gen ekspresyonunu düzenleyen artırıcıları hızla tanımlamak için etkili bir yaklaşım sunar.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Daha fazla video keşfet