Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Bu yöntem, proteatların aktivitesini in vivo olarak ölçerek hastalıkların ilerlemesini tespit edebilen probların nasıl tasarlanacağı gibi protea karışımı ve teşhisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, geliştirilen tanı nozitiklerinin noninvaziv olması ve aslında biyolojik sinyallerin tespitini artırabilmesidir. Bu yöntem çok sayıda hastalığa uygulanabilir, çünkü birçok proteus aslında patogenezin ana itici güçleridir.

Kimyasal çeker ocakta, bir ml %30 amonyum hidroksiti 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Bu tüpü bir buz kovasına koyun ve 30 dakika soğumaya bırakın. 250 ml'lik bir Ehrlenmeyer şişesini deiyonize su ile yıkayın.

Sonra 10 ml çift damıtılmış su ekleyin. Şişeyi bir ısı plakası üzerinde duran bir buz banyosuna daldırın. Plastik bir pipet kullanarak, şişedeki çift damıtılmış suya nitrojen gazı akışına başlayın.

Oksijeni gidermek için 15 dakika köpürtün. Daha sonra, 15 ml'lik konik bir tüpte 4.5 g dekstrin tartın. Dekstrin dahil olmak üzere karışımın son hacmi 20 ml olacak şekilde su ekleyin.

Dekstrini çözmek için kuvvetlice girdap. 78.5 mg demir 3 klorür hekzahidratı tartın ve bunu dekstrin çözeltisine ekleyin. Çözünmek için girdap.

0,2 um'lik bir filtre kullanarak elde edilen çözeltiyi filtreleyin. Bundan sonra, 9 ml oksijeni giderilmiş suyu, 1 ml soğutulmuş amonyum hidroksit içeren 15 ml'lik konik tüpe aktarın. Konik boruyu soğuması için buz kovasına geri koyun.

73 mg demir 2 klorür tetrahidratı tartın ve kalan 1 ml oksijeni alınmış çift damıtılmış suda çözün. Çözümü filtrelemek için 0,2 um filtre kullanın. Daha sonra dekstrin demir 3 çözeltisini 250 ml'lik Ehrlenmeyer şişesine aktarın.

1.600 rpm'de karıştırırken buz üzerinde 15 dakika nitrojen gazı ile oksijeni giderin. Şişeyi lastik bir septum ile kapatın. 18 gauge bir iğne kullanarak, nitrojen gazını şişeye akıtmak için septumu delin.

Akış çıkışı olacak ayrı bir 18 gauge iğne yerleştirin. Daha sonra, dekstrin demir 3 çözeltisine 467 ul demir 2 çözeltisi eklemek için 1 ml'lik bir şırınga kullanın. 1.600 rpm'de karıştırın.

Çekirdeklenme işlemini başlatmak için soğutulmuş seyreltik amonyum hidroksit çözeltisini damla damla ekleyin. Başka bir damla eklemeden önce her damlanın iyice karıştığından emin olun. Azot gazı akışını durdurun ve kauçuk septumu çıkarın.

Buz banyosunu çıkarın ve ılık su banyosu ile değiştirin. Çözeltiyi 75 santigrat dereceye ısıtın ve ardından 75 dakika inkübe edin. Şişeyi sıcak plakadan çıkarın.

Çözeltiyi 0.2 um'luk bir filtreden ve ardından kaba parçacıkları gidermek için 0.1 um'lik bir filtreden iki kez süzün. 100 kDa moleküler ağırlık kesme yoğunlaştırıcıları kullanarak, tampon fazla dekstrini uzaklaştırmak için parçacıkları çift damıtılmış suya dönüştürür. İki ila üç dönüşten sonra akış karanlık kalırsa, kırılmış olabilecekleri için filtreleri değiştirin.

Daha sonra, demir oksit nanopartiküllerini çift damıtılmış su içinde ml başına 10 mg'lık bir konsantrasyonda yeniden süspanse edin. 1.6 hacim 5 molar sodyum hidroksit ekleyin, ardından 0.65 hacim epiklorohidrin ekleyin. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak, oda sıcaklığında 12 saat boyunca dikkatlice karıştırın.

Demir oksit nanopartikül çözeltisini 50 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir diyaliz membranına aktarmak için 18 gauge iğneli 20 ml'lik bir şırınga kullanın. Diyaliz membranını 4 litre çift damıtılmış suya yerleştirin. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Konsantrasyonu belirledikten sonra, demir oksit nanopartiküllerini ml başına 5 mg'lık bir konsantrasyona getirin. % 20'ye ulaşmak için amonyum hidroksit ekleyin ve demir oksit nanopartiküllerinin yüzeyini yumuşatmak için oda sıcaklığında en az 12 saat çalkalayın. Ardından, 30 kDa moleküler ağırlık kesme filtreleri kullanılarak tampon değişimi.

Metin protokolünde belirtildiği gibi demir oksit nanopartiküllerinin hidrodinamik yarıçapını belirlemek için dinamik ışık saçılımını kullanın. Bir peptit substratı sentezledikten sonra, 0.5 mg demir oksit nanopartiküllerini 10 kDa moleküler ağırlıklı kesme spin filtre tüpüne alikot edin. Metin protokolünde belirtildiği gibi 10 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme spin filtresi kullanarak birleştirme tamponuna tampon değişimi.

Ml başına yaklaşık 30 mg'lık bir konsantrasyona ulaşmak için SIA'yı DMF içinde çözün. Daha sonra, 500'e bir mol oranında demir oksit nanopartiküllerine SIA ekleyin. İnkübasyon ve tampon değişiminden sonra, nihai ürünü ml başına 1 mg konsantrasyona getirin.

İlgilenilen peptidi 20 kDa tiyol sonlu polietilen glikol ile karıştırın ve ardından bu peptid glikol çözeltisini demir oksit nanopartikülleri ile karıştırın. Floresan moleküllerinin foto ağartılmasını önlemek için tüpleri folyo ile örtün. Ve gece boyunca oda sıcaklığında bir tabak çalkalayıcı üzerinde inkübe edin, en yüksek hıza ayarlayın.

Daha sonra, demir oksit nanopartiküllerine 500'e bir molar oranda L sistin ekleyin. En yüksek hıza ayarlanmış bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bundan sonra, PVS kullanarak 18 ul'lik bir nanopartikül çözeltisi ve 200 nanomolar konsantrasyonda bir peptit yapın.

İlgilendiğiniz proteazın 2 ul'sini ekleyin. Bölünmeyi izlemek için her bir ila iki dakikada bir floresan ölçümleri alarak 37 santigrat derecede bir plaka okuyucuda bir saat inkübe edin. Hazırlanan nanosensör solüsyonunu kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla enjekte ettikten hemen sonra, fareleri metabolik kafeslere yerleştirin ve her fare için enjeksiyon zamanını not edin.

2 ul idrarı 5 ul hazırlanmış manyetik boncuk ile birleştirin. PVS'yi kullanarak, nihai toplam hacmi 50 ul'ye getirin. Oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.

Daha sonra, her yıkamadan sonra manyetik boncukları toplamak için manyetik bir ayırıcı kullanırken, her seferinde 50 ul PVS kullanarak iki kez yıkayın. 32.5 ul %5 buzlu asetik asit ile iki kez elute. Havuz seyreltmesini nötralize etmek ve 7 civarında bir son ph elde etmek için 35 ul 2 molar tris kullanın.

Bundan sonra, idrar floresansını ölçmek için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında bir plaka okuyucu kullanın. Bilinen serbest florofor konsantrasyonlarından oluşan bir merdivene karşı floresan raportör konsantrasyonunu hesaplayın. Bu çalışmada, proteaz substratlarının bir nanoparçacık çekirdeğine konjuge edilmesiyle aktivite tabanlı nanosensörler geliştirilmiştir.

Demir oksit nanopartiküllerinin ortalama çapının 40 ila 50 nm arasında olduğu gözlemlenmektedir. Peluşlamadan sonra bu boyut aralığı için dolaşım yarılanma ömrünün yaklaşık 6 saat olduğu görülmektedir. Başarılı peptit konjugasyonundan sonra, spektral absorbans analizi, floresan raportörün maksimum uyarma dalga boyunda belirgin bir absorbans zirvesi ortaya çıkarır.

Probun proteaz aktivitesini algılama yeteneği daha sonra bir dizi nanosensörün rekombinant proteazlarla inkübe edilmesiyle test edilir. Michaelis-Menten kinetiğini takip eden substrat bölünme hızlarını gözlemlemek tipiktir. Yakın kızılötesi floresan raportör ile kaplanmış nanosensörler daha sonra tüm hayvan floresan görüntüleme ile kanserin fare modellerindeki farmakokinetiği görselleştirmek için kullanılır.

Nanosensörlerin intravenöz uygulamasından 60 ila 90 dakika sonra, LS 174 t kolorektal taşıyan farelerin idrarında lokalize olan bir floresan sinyali görülmektedir. Kontrol farelerinin mesanelerinde önemli ölçüde daha düşük floresan sinyalleri gözlenir. Karaciğerde gözlenen sinyalin, parçacıkların sonunda karaciğer, dalak ve lenf düğümlerinde yaygın olarak bulunan ridiküloendofilik sistemdeki monositler ve makrofajlar tarafından temizlenmesi nedeniyle ortaya çıktığına dikkat edilmelidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa dört gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, floresansın birincil okuma olduğunu hatırlamak önemlidir, bu nedenle floresan işaretleyicili peptit substratlarını karanlıkta tutmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, partiküllerin çeşitli organlara lokalizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için biyodağılım çalışmaları ve in viva görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, teşhis alanındaki araştırmacıların farelerde kanser biyobelirteçlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, demir oksit nanopartiküllerinin nasıl sentezleneceğini ve karakterize edileceğini, bunları nanosensörler oluşturmak için nasıl kullanacağınızı ve ardından nanosensörleri in vivo olarak nasıl kullanacağınızı iyi anlamalısınız. Nanopartikül sentezinde yer alan kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman ve çeker ocak içinde çalışma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.