Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi
July 17th, 2018
Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.
Bu yöntem, DNA replikasyonu, gen onarımı ve kromozom yapısının korunması gibi DNA protein etkileşimlerinin tek moleküllü görüntüleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, modifiye lambda DNA'sı, yüksek kollajen elde edilebilmesi ve daha sonra etiketli proteinlerin hızla iyileştirilebilmesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü akış hücresi montaj adımlarının öğrenilmesi zordur.
Lamelleri temizlemek için, 20 lamel dört boyama kavanozuna koyun, içine etanol dökün ve etanolde 30 dakika boyunca sonikasyon yapın. Ardından lamelleri üç kez ultra saf suyla durulayın. Daha sonra, lamelleri 30 dakika boyunca bir molar potasyum hidroksit ile sonikasyon yapın ve lamelleri üç kez ultra saf su ile durulayın.
Ardından etanol ve potasyum hidroksit sonikasyonunu bir kez tekrarlayın. Lamelleri 30 dakika boyunca asetonla sonikleştirin ve ardından ultra saf su ile iyice durulayın. Şimdi lamelleri Piranha çözeltisine yerleştirin ve bir saat boyunca 95 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçka işleminden sonra, lamelleri beş kez ultra saf suyla durulayın. Ardından her bir lameli ultra saf suyla yoğun bir şekilde yıkayın. Lameli kenarından kurutmak için kağıt kullanın ve lameli bir boyama kavanozuna koyun.
Lameli 110 derecelik bir fırında iyice kurulayın. Şimdi lameli metanol ile durulayın ve ardından lameli kurutmak için boyama kavanozunu 110 derece fırına geri koyun. Lamel işlevselleştirmesini gerçekleştirmek için, her kavanoza 70 mililitre Silan çözeltisi ekleyin, kapağı vidalayın ve kavanozu gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.
Lamelleri ultra saf suyla doldurulmuş üç beher kullanarak yıkayın. Lamelleri nitrojen gazı kullanarak iyice kurulayın. 150 miligram metoksi-PEG ve altı miligram biotin-PEG'yi bir mililitre taze hazırlanmış 0.1 molar sodyum bikarbonat içinde çözün.
Çözünmeyen PEG'leri çıkarmak için bir dakika boyunca 17.000 kez g'de santrifüjleyin. Şimdi silanize lamel ortasına 100 mikrolitre PEG solüsyonu pipetleyin ve üstüne başka bir silanize lamel yerleştirin. Lamelleri karanlıkta en az üç saat boyunca PEG solüsyonu ile inkübe edin.
Lamel çiftlerini ayırın ve işlevselleştirilmiş yüzeyi yukarı bakacak şekilde tutun. Lamelleri ultra saf su kullanarak iyice durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın. Şimdi bir işaretleyici kalem kullanarak köşelerden birinde lamellerin işlevsel tarafını işaretleyin.
Kapağında bir delik olacak şekilde delinmiş 50 mililitrelik bir tüpe bir lamel yerleştirin. Tüpü plastik bir torbaya koyun, torbayı bir vakumlu mühürleyici kullanarak kapatın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Akış hücresini monte etmek için, bir zımba kullanarak bir çift taraflı bant parçasının ortasında bir kanal kesin.
Çift taraflı bandın kağıt tarafını soyun ve iki delikli cam tarafa yapıştırın. Kağıt tarafını soyarak hava kabarcıklarını çıkarmak, çift taraflı bandın plastik tarafından daha kolaydır. Hava kabarcıklarını çıkarmak için banda bastırın.
Ardından, elmas uçlu bir cam çizici kullanarak işlevselleştirilmiş bir lamel dört parçaya kesin ve işlevselleştirilmiş tarafı yukarıda tutarak nitrojen gazı kullanarak kalıntıları temizleyin. Çift taraflı bandın plastik tarafını soyun ve slaytı işlevselleştirilmiş lamel üzerine yapıştırın. Lamel ile bant arasındaki hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe bastırın.
Hava kabarcıklarının tamamen çıkarılması, içine tamponlar pompalanırken akış hücresinin sızmasını önleyebilir. Şimdi giriş borusunu küçük deliğe yerleştirin ve çıkış borusunu büyük deliğe yerleştirin. Boruyu epoksi kullanarak sabitleyin.
Bir şırınga kullanarak mililitre Streptavidin başına 20 mikrolitre 0.2 miligramı manuel olarak akış hücresine pompalayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra Streptavidin yerini almak ve oda sıcaklığında tutmak için bloke edici tamponu akış hücresine pompalayın. 532 nanometre lazer ve 640 nanometre lazer kullanarak aynı anda uyarma ile bir numaralı floresan mikroskobu test slayında A5 ile kırmızı ve uzak kırmızının odak hizalamasını elde edin.
Bölme optikleri ile çift dalga boylu görüntüler üretin. Akış hücresini mikroskobun üzerine yerleştirin ve çıkış hortumunu, otomatik infüzyon çekme programlanabilir bir pompaya monte edilmiş 10 mililitrelik bir yaya bağlı daha uzun bir boruya bağlayın. Tamponu bloke ederek ve çıkış borusunu çevirerek akış hücresindeki hava kabarcıklarını çıkarın.
80 mikrolitre bloke edici tampona 0.5 mikrolitre biyotinile lambda-ARS317 DNA ekleyin. Hazırlanan karışımı iki dakika boyunca dakikada 25 mikrolitre akış hücresine pompalayın. Daha sonra lambda-ARS317 DNA'sını dakikada 50 mikrolitre hızında 200 mikrolitre bloke edici tampon kullanarak yıkayın.
Şimdi akış hücresindeki engelleme tamponunu çıkarmak için dakikada 50 mikrolitre hızında 200 mikrolitre bağlama tamponu pompalayın. Daha sonra, 96 mikrolitre bağlama tamponuna iki mikrolitre ORC-Qdot705, bir mikrolitre DTT ve bir mikrolitre ATP ekleyin. ORC-Qdot705'in son konsantrasyonu 0.2 nanomolardır.
Bağlama tamponunu metin protokolünde detaylandırıldığı gibi pompaladıktan sonra, hazırlanan ORC-Qdot705 çözeltisinin 20 mikrolitresini dakikada 10 mikrolitre hızında akış hücresine pompalayın. Dakikada 705 mikrolitre hızında 200 mikrolitre bağlayıcı tampon kullanarak fazla ORC-Qdot100'i boşaltın. Daha sonra, DNA substratlarını dakikada 100 mikrolitre hızında boyamak için 30 nanomolar SYTOX Orange ile bağlanma tamponunu akış hücresine pompalayın.
Son olarak, 405 nanometre lazer kullanarak ORC-Qdot705 sinyalini uyarın ve 532 nanometre lazer kullanarak SYTOX Turuncu lekeli DNA sinyalini uyarın. Dört bantlı bant geçiren bir filtre kullanarak dakikada 100 mikrolitre akışla sinyalleri aynı anda gözlemleyin. Görüntüleri EMCCD ile kare başına 100 milisaniye ile kaydedin.
Lambda-ARS317 DNA substratının çizimi burada gösterilmiştir. Qdot705 etiketli ORC, 405 nanometrelik bir lazer tarafından uyarıldı. SYTOX Turuncu lekeli DNA, 532 nanometrelik bir lazerle uyarıldı.
Birleştirilmiş sonuç, Qdot705 etiketli ORC'nin ARS317'ye bağlandığını gösteriyor. Lambda-ARS317 DNA'sı üzerindeki ORC bağlanma dağılımının sonucu, ORC'nin ARS317'de yüksek miktarda bağlandığını gösterir. Bu prosedürü takiben, protein-protein etkileşimleri ve protein dinamikleri ile ilgili ek soruları yanıtlamak için tek moleküllü FRET gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, tek moleküllü floresan görüntüleme alanındaki araştırmacıların, in vitro DNA replikasyonu ve DNA onarımının yeniden yapılandırılmış sistemlerinde DNA protein etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Piranha solüsyonu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken koruyucu yüz maskelerinin takılması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, toplam içsel yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, tek molekül görüntülemeyi kolaylaştırmak için spesifik olarak değiştirilmiş bir λ DNA substratı ve Kuantum nokta ile etiketlenmiş proteinler kullanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- DNA-protein etkileşimlerinin anlaşılması, DNA replikasyonu ve gen onarımı hakkındaki bilgiler için çok önemlidir.
- Tek molekül görüntüleme teknikleri, moleküler dinamikler hakkında ayrıntılı bilgiler sağlar.
- Protokol, TIRFM için akış hücrelerinin montajını basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
- Görsel gösterimler, yöntemin öğrenilmesini ve uygulanmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- DNA-protein etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Kromozom yapısının korunmasındaki moleküler mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmek.
- Tek molekül görüntüleme tekniklerinde araştırmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Modifiye λ DNA substratlarının hazırlanması.
- Proteinlerin Kuantum noktalarla etiketlenmesi.
- TIRFM görüntüleme için akış hücrelerinin montajı.
- Optimal görüntüleme koşulları için cam kapakların temizlenmesi ve hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Protokol, DNA-protein etkileşimlerinin etkili görselleştirilmesini sağlar.
- Kuantum nokta ile etiketlenmiş proteinlerin DNA ile etkileşiminin başarılı görüntülemesini gösterdi.
- Akış hücreleri montajında yaygın zorlukların üstesinden gelmek için adım adım bir rehber sağladı.
- Cam kapaklar için temizleme prosedürlerinin önemini vurguladı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, DNA-protein etkileşimlerinin çalışmasını artırmaktadır.
- Moleküler biyolojideki araştırmacılar için değerli bir araç olarak hizmet etmektedir.
- Gelecekteki uygulamalar, genetik araştırmanın çeşitli yönlerine genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Single-molecule visualization of DNA-protein interactions using Qdot-labeled proteins and site-specifically modified λ DNA enables direct interrogation of molecular mechanisms underlying replication and repair. This approach enhances predictive confidence in target validation by providing high-resolution, quantitative insights into binding events and spatial localization. The method supports early discovery inflection points where mechanistic de-risking and functional validation are critical for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein-DNA binding specificity and localization at the single-molecule level.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying functional engagement of candidate targets.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of replication and repair pathways relevant to disease models.
- Provides foundational data for triaging targets based on real-time molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule imaging systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, high-stability fluorescent labeling with Qdots for extended observation windows.
- Enables quantitative measurement of binding events, supporting assay standardization and scalability.
- Prepares robust platforms for evaluating compound effects on DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanistic findings with disease-relevant DNA replication and repair processes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling detailed molecular characterization.
- Reduces translational risk by providing direct evidence of target engagement and functional relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target validation and assay development phases.
- Discovery Biology: Provides high-resolution visualization for hypothesis testing and pathway clarification in DNA-protein interaction studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables statistical comparison of binding distributions and localization patterns across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant systems by modeling replication and repair events in vitro.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to diverse protein-DNA interaction studies across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows with robust, photostable Qdot labeling and reproducible flow cell assembly.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of molecular interactions and target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and flow cell assembly.
- Demands access to TIRFM instrumentation and high-sensitivity EMCCD imaging systems.
- Necessitates rigorous cleaning and functionalization protocols for coverslips to ensure reproducibility.
- Adaptation to other protein-DNA systems may require optimization of labeling and buffer conditions.
- Qdot photostability limits application in quantitative assays requiring dynamic intensity measurements.
