Name: Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, tek molekül görüntüleme için kuantum nokta etiketli proteinler ve modifiye λ DNA kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemeyi. Bu yöntem moleküler biyoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Hasan Yardimci teşekkür ediyoruz ve Dr.Sevim Yardimci Francis Crick Enstitüsü tarz için Dr Yujie güneş Pekin Üniversitesi ve Dr Chunlai Chen, Dr. Daniel Duzdevich, Columbia Üniversitesi, Dr Eric C. Greene'in laboratuarından tek molekül denemelerinde yardımcı Tsinghua Üniversitesi yararlı tartışma için. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin 31371264, 31401059, CAS disiplinler arası yenilik takım ve Newton gelişmiş Bursu (NA140085) Royal Society tarafından desteklenmiştir.

1. λ-ARS317 DNA substrat hazırlanması
<ol><li>DNA substrat İnşaat ve ambalaj<ol>
<li>Xhokullanarak yerel λ DNA sindirmek ben enzim; tomurcuklanma genomik DNA ARS317 Maya 20 içeren primerler kullanılarak 543 bir bp DNA parçası taşıyan yükseltmek bp homolog dizileri akış yukarı ve aşağı Xhoben lambda DNA enzim ücreti. 100 Ekle ng Xhoλ DNA ve 10 sindirilmiş ng DNA parçası Homolog rekombinasyon tepki sisteminin 10 µL ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Rekombinasyon λ DNA paketlemek için 25 µL lambda ambalaj özler rekombinasyon ürün içine ekleyin ve tepki için 90 dk 30 ° C'de kuluçkaya. Sonra bir ek 25 µL lambda ambalaj özler tepki tüp içine ekleyin. 90 dk 30 ° C'de tepki kuluçkaya devam'i tıklatın.</li>
		<li>Steril seyreltme arabelleği (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) 500 µL reaksiyon sistemine ekleyin ve karışımı yavaşça baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek. Kloroform 25 µL eklemek, karışımı yavaşça ve 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Paketlenmiş fajının 100 µL ve bakteri LE392MP 100 µL ekleyin (0,8 - kültürlü LB orta 10 mM ile MgSO4ekleme kullanarak 1.0) yeni bir tüp içine. 37 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya.</li>
		<li>4 mL oftop agar (LB orta + %0,7 agar + 10 mM MgSO448 ° C-soğutmalı,) içine 200 µL faj-bakteri karışımı ekleyin. Hemen yanında dönme tüp baş aşağı birkaç kez karıştırın ve önceden ısıtılmış (37 ° C) LB tabağa dökün.</li>
		<li>37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya ve PCR kullanarak ve sıralama λ-ARS317 plak ekran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA substrat arıtma sıvı lysates11,18<ol>
<li>Steril GKD2O 10 mm MgCl2 ve 10 nM CaCl2200 µL bir plak seç. 200 µL bakteri LE392MP (LB orta kültürlü geceleme) ile karıştırın ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>NZCYM 100 mL faj-bakteri karışımı ekleyin (10 g/M NZ-Amin, 5 g/L maya ekstresi, 5 g/M NaCl, 1 g/L Casamino hidrolizat ve 2 g/L MgSO4·7H2O) orta ve kültür 37 ° C'de 7 h için Kloroform kültür içine 250 µL ekleyin ve başka bir 10 dakikadır sallamak.</li>
		<li>Kültür bir 200 mL şişe aktarın. NaCl (1 M son konsantrasyonu) 5,8 g ekleyin, el ile çözülmeye karıştırın ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>12.000 x g 4 ° C'de hücre artıkları kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi. 200 mL şişe süpernatant toplamak ve8000 (m/V) % 10 PEG ekleyin. Manyetik karıştırma aparatı tarafından dağıtılması ve 30 dakika veya daha uzun buza kuluçkaya karıştırın.</li>
		<li>12.000 x g 10 dk 4 ° C'de bakteriyofaj çökelti, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Çökelti fajının seyreltme arabellek 2 mL resuspend. 15 mL tüp içine aktarmak ve 10 µL RNase (son 20 µg/mL bölgedir) ve (son 5 µg/mL bölgedir) DNaz 40 µL ekleyin. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>0,3 2 mL ekleyin M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + %1.25 SDS, 15 µL İndinavir K (son konsantrasyonu ise 10 µg/mL). 10 dk 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş potasyum asetat (3 M, pH 4,8) 2 mL ekleyin ve buz için 10 dk metroyla kuluçkaya.</li>
		<li>8000 x g 4 ° C'de çözünmez malzemeleri kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>İsopropanol 0.7 x hacmi süpernatant ekleyin. Baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek mix ve oda sıcaklığında (RT) 2 min için kuluçkaya.</li>
		<li>RT DNA çökelti, 10 min için 8000 x g, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>% 70 ile etanol tarafından Santrifüjü 8.000 x g 10 dakika süreyle de kaldırdıktan sonra süpernatant DNA yıkayın.</li>
		<li>Yavaşça 500 µL TE tampon (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) kullanarak DNA elute ve DNA 1,5 mL tüp içine aktarın.</li>
		<li>İki kez fenol kullanarak DNA ayıklamak: kloroform Santrifüjü 10 min için 8000 g de tarafından.</li>
		<li>0.7 x birim isopropanol ile çökelti. Ters tüp yavaşça aşağı ve 8.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi dönüm tarafından karıştırın.</li>
		<li>Bir kez % 70 etanol ile yıkayın, TE 200 µL içinde resuspend. DNA toplama ölçmek ve 12.5 µg aliquots-20 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
<ol><li>Biotinylated oligonucleotides fazdan için (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3') yerli sol sonuna tamamlayıcı λ DNA, eklemek 1 µL (100 µM) oligonucleotides, GKD2O, 1 µL 10 ligaz arabellek x 7,5 µL ve T4 PNK 0.5 µL. Tepki 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>1 µL T4 PNK ve GKD2O toplam hacmiyle 30 µL. λ-ARS317 fazdan, λ-ARS317 12.5 µg, 10 ligaz arabellek x 3 µL eklemek için 3 h için 37 ° C'de tepki kuluçkaya.</li>
	<li>λ-ARS317 ile oligonucleotides tavlamak için fosforile oligonucleotides 0.5 µL, GKD2O, 10 × ligaz arabelleği fosforile λ-ARS317 tüp içine 25 µL 195 µL ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 65 ° c 5 dk. dönüş blok ısıtıcı ve izin 33 ° C blok aşağıda örnek soğumaya kapalı için kuluçkaya.</li>
	<li>λ-ARS317 ile oligonucleotides ligate T4 DNA ligaz 1 µL ve 0,63 µL ATP (200 mM) ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 2 saat veya 4 ° C için oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. 4 ° C'de 1 ay için saklayın. Not: DNA'bozulmaması için karıştırma merdivenlerden yavaşça tüp baş aşağı pipetler kullanarak karıştırma yerine çevirerek yapılmalıdır.</li>
</ol>3. Coverslip temizlik ve Functionalization
<ol><li>Temizlik Coverslip<ol>
<li>Yer 20 coverslips 4 boyama kavanoz (5 coverslips/kavanoz), içine 30 dakika içinde etanol için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın.</li>
		<li>30 dakika ve 1 M potasyum hidroksit (KOH) için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın. Etanol ve KOH sonication bir kez yineleyin.</li>
		<li>Aseton ile 30 dakika boyunca solüsyon içeren temizleyicide ve ultrasaf H2ile O iyice durulayın (en az 3 kez). Not: zaman (aseton gibi) organik çözücü yanlışlıkla piranha çözüm ile karışık bir patlama neden olabilir çünkü aseton iyice ultrasaf H2ile O, durulama tarafından kaldırılması gerekir14.</li>
		<li>Coverslips piranha çözüm yerleştirin (3:1 karışımı H2SO4 ve % 30 H2O2) ve 1 h için 95 ° C'de kuluçkaya. Not: Son derece enerjik ve aşındırıcı Piranha çözüm, çok dikkatli kullanın. Piranha çözüm hazırlanırken, 50 mL H2O2 önce 500 mL Cam kabı ekleyin ve H2150 mL kadar ekleyin4 kabı içine yavaş yavaş.</li>
		<li>Ultrasaf H2O ile coverslips 5 kere yıkayın. O zaman her coverslip ultrasaf H2O iyice ultrasaf H2ile O dolu 3 şişeler kullanarak ile yıkayıp kağıt coverslip kenarından kullanarak coverslip kurulayın. Coverslip iyice 110 ° C fırında 30 dakika boyunca kuru ve coverslip boyama kavanoza yerleştirin.<ol>
<li>Metanol ile coverslip durulama ve tekrar coverslip iyice kurumasını 110 ° C fırın boyama kavanoz yerleştirin. Not: bir kez o su19huzurunda APTES çok olası yüzey yapıların olduğundan iyice coverslip kurutma çok önemlidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip functionalization<ol>
<li>70 mL silane çözeltisi ekleyin (%93 metanol, %5 asetik ve % 2 APTES) her kavanoza vida kapağı ve oda sıcaklığında kavanoz gece bırakın.</li>
		<li>Yıkama ve coverslips iyice fırına yerleştirerek yerine azot gazı kullanarak coverslips kuru dışında 3.1.5. adımda açıklandığı gibi kuru.</li>
		<li>150 mg mPEG (metoksi-Polietilen glikol) ve 6 mg biotin-PEG (biotin-Polietilen glikol) iyice 1 mL 0.1 M taze yapılmış NaHCO3 (pH 8.2) geçiyoruz. Sonra santrifüj 17, 000 x g çözünmez mandal kaldırmak 1 dk için. Not: Taze yapılmış NaHCO3 hazırdır; Onun pH ayarlamak için gerek yoktur.</li>
		<li>Silanized coverslips kutularına yerleştirmeniz ve iki küçük coverslips iki ucu silanized coverslips üst kısmında koymak. Silanized coverslip ortasına PEG çözeltinin 100 µL pipet ve başka bir silanized coverslip üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Bazı ultrasaf H2O nemli tutmak için kutusuna ekleyin ve coverslips PEG çözüm için en az 3 saat içinde belgili tanımlık karanlık ile kuluçkaya. Bir gecede kuluçka de çalışabilirsiniz.</li>
		<li>Coverslip çiftleri ayırmak ve functionalized yüzey yüz tutmak, ultrasaf H2O yoğun olarak kullanarak coverslips durulayın ve azot gazı ile Kuru onları.</li>
		<li>Coverslips birinde bir marker kalem, functionalized yan yüzleri yukarıya, onları kutularına yerleştirmeniz ve kutuları vakum desiccator 1 ay için stok tutma kullanarak köşeleri functionalized tarafında işaretleyin.</li>
		<li>Coverslips daha uzun süre saklamak için bir coverslip onun kap üzerinde bir delik delinmiş bir 50 mL tüp içine koyun sonra tüp Plastik bir torbaya koyun ve bir vakum mühürleyen kullanarak torba mühür. Bu şekilde, coverslips-20 ° C'de yaklaşık 3 ay depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. akış hücre derleme
<ol><li>Çift taraflı bant (30 mm × 12 mm) bir zımba kullanarak bir parçası merkezinde 15 mm × 2 mm kanal kesti.</li>
	<li>Çift taraflı bant kağıt yan soyma ve iki deliği olan cam slaytta yapıştırın. Hava kabarcıkları kaldırmak için tuşuna basın. Bizim deneyime dayalı, Çift taraflı bant plastik yan daha kağıt tarafı kapalı soyulması tarafından hava kabarcıkları kaldırmak kolaydır.</li>
	<li>Functionalized coverslip (60 mm × 24 mm) dört kesilmiş elmas uçlu cam kullanarak parçaları (30 mm × 12 mm) scribe ve azot gazı kullanarak enkaz kaldırmak. Functionalized tutmayı unutmayın yan yüzleri yukarıya.</li>
	<li>Çift taraflı bant plastik yan soyma ve slayt üzerinde functionalized coverslip yapıştırın. Hava kabarcıkları coverslip ve bandı arasında kaldırmak için hafifçe bastırın. Hava kabarcıkları iyice kaldırma akışı hücre arabellekleri içine pompalanır iken sızıntı koruyabilirsiniz.</li>
	<li>Giriş ve çıkış boru sırasıyla küçük ve büyük deliklere yerleştirin. Epoksi kullanarak boru tamir.</li>
	<li>Streptavidin (0.2 mg/mL) 20 µL el ile kullanarak akış hücre pompa ve RT kuluçkaya 10 dakikadır. O zaman değiştirmek streptavidin için akış hücreye engelleme arabellek10 pompa ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
</ol>5. tek molekül görselleştirme
<ol><li>Kırmızı ve far-red ile A5 floresans mikroskobu testi slayt #1 üzerinde odak hizalamasını 532 nm lazer ve 640 nm lazer kullanarak eşzamanlı uyarma tarafından elde etmek. (Bkz: Malzemeler tablo) optik bölme ile çift dalga boyu görüntüleri üretmek.</li>
	<li>Akış mikroskobunun yerleştirin ve bir uzun boru ile bir otomatik infüzyon/para çekme programlanabilir pompa yüklü bir 10 mL bahar bağlantı onun çıkış boru bağlayın. Not: arabellekleri arabelleği akış hücre giriş boru döşeme için şırınga çekilmesi anlamına gelir aşağıda belirtilen akış hücre içine pompalıyor.</li>
	<li>Engelleme arabellek 500 µL/dak hızlı bir şekilde hava kaldırmak ve akış hücre arabellekte engellenmemiş olduğundan emin olun akış hücreye pompa. O zaman engelleme arabellek 200 µL/dak akış hücre pompa ve hava kabarcıkları giriş boru ve akış hücre iyice kaldırmak için çıkış boru ters çevirin. Not: tüm arabellekleri akışı hücre pompalanan bir vakum desiccator en az 15 dakika kullanmadan önce degassed.</li>
	<li>Biotinylated λ-ARS317 DNA'ın 0.5 µL engelleme arabellek 80 µL ekleyin ve 25 µL/min 2 min için akış hücre içine pompa. O zaman engelleme arabelleği 200 µL 50 µL/dk hızında çalıştırarak λ-ARS317 DNA sifonu çek.</li>
	<li>Engelleme arabelleği akış hücreye kaldırmak için 50 µL/dk hızında arabellek10 Binding 200 µL pompa.</li>
	<li>Streptavidin kaplı Qdot705 (1 µM) 0.2 µL ekleyin ve biotinylated ork 0.2 µL (1.2 µM) içine bir tüp ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. O zaman tampon tüp içine bağlama 20 µL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu yaklaşık 10 olduğunu nM.</li>
	<li>Ork-Qdot705 2 µL ekleyin (10 nM), DTT (100 mM), ATP (200 mM) 1 µL bağlama arabellek 96 µL içine 1 µL. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu 0,2 olduğunu nM.</li>
	<li>0.2 nM ORC-Qdot705 20 µL 10 µL/dk hızında akış hücre pompa. Bağlama arabellek 200 µL 100 µL/dk hızında çalıştırarak aşırı ORC-Qdot705 , dışarı floş. Sonra pompa bağlama arabellek ile 30 nM SYTOX portakal akış hücresine DNA yüzeylerde 100 µL/dk hızında leke.</li>
	<li>Ork-Qdot705 sinyal heyecanlandıracak ve SYTOX turuncu bir 405 nm lazer ve 532 nm lazer, sırasıyla kullanarak DNA sinyali lekeli. Sinyalleri aynı anda bir avlu-şerit bant filtre (FF01-446/510/581/703-25) kullanarak 100 µL/dak akışı ile işlevlerini izlemek ve kaydetmek çerçeve başına 100 ms tarafından EM-CCD görüntülerle. 20 görüntü yığınları farklı alanlardan toplamak.</li>
</ol>6. veri analizi
<ol><li>Dr. Ron veren laboratuar Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco tarafından geliştirilen resim tapa (OI_cut_RGBmerge) kendimizi tarafından değiştirilir yeni bir eklenti ile Fiji yazılım kullanarak görüntüleri dayalı ürün.<ol>
<li>Bir yığın görüntüleri (512 × 512 piksel) görüntüleri (256 × 256 piksel) iki yığınları kırpma. Biri bir 532 nm lazer heyecan verici sonuç, ve diğeri de bir 405 nm lazer heyecan verici sonuç.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiji-görüntü-yığınlar-Z project (ortalama yoğunluğu) kullanarak 61 sıralı görüntüleri işlemek.</li>
	<li>Ölçü DNA (LDNA) ve DNA'ın ORC-Qdot705 (LORC) bağlama DNA üzerinde sitesinden Uzaklik uzunluğu son el ile gergin.</li>
	<li>LORC/LDNA sonucunu hesaplamak kullanarak excel, r, önyükleme yöntemini kullanarak verileri analiz sonra çubuk grafik oluşturmak ve Gauss dağıtımları uygun.</li>
</ol>

<ol><li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots%3A+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62(2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li>
<li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li>
<li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li>
<li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).</li>
<li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation%3A+origin+specificity%2C+licensing%2C+and+firing+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li>
<li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li>
<li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927317301020">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li>
<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li>
<li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+%CE%BB+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li>
<li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+modification+of+%CE%BB-DNA+substrates+for+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, Qdot etiketli protein ve TIRFM akışı hücrede kullanarak site-specifically değiştirilmiş λ DNA arasındaki etkileşim gözlemlemek için bir protokol mevcut. Gerekli adımlar DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, hücre içi akış hazırlama ve tek molekül görüntüleme siteye özgü bir değişiklik içerir. Unutulmamalıdır iki anahtar nokta vardır. Yukarı ve aşağı üst üste pipetting karıştırma kaçınarak ilk olarak, tüm λ DNA ile ilgili adımlar yavaşça mümkün herhangi bir hasar, Örneğin</e...

Protein ve DNA arasındaki etkileşimler DNA ikileşmesi, DNA tamiri ve transkripsiyon gibi birçok karmaşık biyolojik süreçler için gereklidir. Her ne kadar geleneksel yaklaşımlar özellikleri bu süreçlerin ışık, birçok anahtar mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, hızla gelişen tek molekül teknikleri ile bazı mekanizmalar ele1,2,3olmuştur.
Protein-DNA etkileşimleri gerçek zamanlı olarak esas olarak görüntülenmesi üzerinde tek molekül floresans mikroskobu uygulanması floresans algılama ve floresan problar gelişimi üzerinde bağlıdır. Bir tek molekül çalışma için beri floresans algılama sistemleri çoğunlukla ticari olarak mevcuttur faiz protein ile uygun bir floresan probe etiketlemek önemlidir.
Floresan Proteinlerin moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır. Ancak, düşük floresan parlaklık ve istikrar photobleaching karşı birçok tek molekül deneyleri kendi uygulamasında kısıtlayın. Kuantum nokta (Qdots) olan küçük ışık yayan nano tanecikleri4. Nedeniyle benzersiz optik özellikleri, Qdots 10 - 20 kat daha parlak ve5birkaç bin kere daha istikrarlı daha yaygın olarak kullanılan organik boya. Ayrıca, Qdots bir büyük Stokes kayması (uyarma ve emisyon doruklarına konumunu arasındaki fark)5var. Niceliksel deneyleri kullanılan olamaz böylece, Qdots uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek sinyal gürültü oranı, görüntülerle edinimi için kullanılabilir.
Bugüne kadar Qdots bir hedef proteini site-specifically etiketlemek için iki yaklaşım vardır: birincil veya ikincil antikorlar Qdot Birleşik6,7,8; yardımı ile etiketleme ya da güçlü etkileşim arasında biotin streptavidin9,10,11,12,ve13temel hedef protein Qdots ile doğrudan, etiketleme. Streptavidin kaplı Qdots ticari olarak kullanılabilir. Bizim son çalışmada, site-specifically co-overexpression BirA ve AVI öğesini proteinler tarafından biotinylated proteinleri mayası yüksek verimlilik ile saf vivo içinde10. Aşağıda ve tek molekül deneyleri14,15,16,17en iyi duruma getirme, biz tek molekül düzey kullanarak Qdot etiketli proteinler ve DNA arasındaki etkileşimler gözlenen TIRFM10.
Burada, tomurcuklanma seçtiğiniz ilgi bizim protein özellikle tanımak ve bağlama özerk Çoğaltma sırası (ARS), kökeni tanıma karmaşık (ork), Maya. Aşağıdaki iletişim kuralı TIRFM kullanarak Qdot etiketli ORC ARS ile etkileşim görselleştirmenin adım adım bir yordam sunar. Site-specifically değiştirilmiş DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, akış hücreli montaj ve tek molekül görüntüleme hazırlanması açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Mağaza 25 &mu; -20 &gtm;C'de L alikotları.</td></tr><tr><td>XhoI enzimi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı füzyon klonlama kiti</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda Ambalaj Özleri</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>Bakteri suşu LE392MP bu pakete dahildir.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10013092</td><td>Herhangi bir marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pekin Kimya işleri</td><td>N/A</td><td>Herhangi bir marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Pekin Kimyasal işler</td><td>N/A</td><td>Herhangi bir marka kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>NZ-amin</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Casamino asitler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma aparatı</td><td>IKA</td><td>KMO2 temel</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Eppendorf tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>30122151</td><td>15 mL, steril, toplu, 500 adet</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile primerler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz, T4 DNA Ligaz, Reaksiyon Tamponu (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Termo Fisher Bilimsel</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80120891</td><td>sülfürik asit</td></tr><tr><td>H 2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reactive Co.,Ltd</td><td>10011218</td><td>%30 Hidrojen peroksit</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG (metoksi-polietilen glikol)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotin-PEG (biyotin-polietilen glikol)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vakum kurutucu</td><td>Tianjin Şubesi Milyar Akciğer Deney Ekipmanı Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Vakum mühürleyen</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Elmas uçlu cam çizici</td><td>ELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Cam sürgülü</td><td>Yelken Marka</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Giriş borusu</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>iç çap 0,38 mm; dış çap 1,09 mm.</td></tr><tr><td>Çıkış boruları</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>iç çap 0,76 mm; dış çap 1,22 mm.</td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>beş dakika epoksi</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>İnfüzyon/çekilme programlanabilir pompa</td><td>Harvard cihazı</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532 nm lazer</td><td>Tutarlı</td><td>Safir-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm lazer</td><td>Tutarlı</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Görüntüleme bölme optiği</td><td>Hamamatsu fotonik KK</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF aydınlatma sistemi</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&kez; TIRF objektif</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Dört kenarlı lazer dikroik ışın ayırıcı</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/ 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Dört bantlı bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/ 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik ışın ayırıcı</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon filtresi</td><td>Chroma Teknolojisi Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Emisyon filtresi</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck floresan, mikroskop test slaydı #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Turuncu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Streptavidin Konjuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Mağazası 4 &ordm'de; C, dondurmayın.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>ddH2O kullanarak 200 mM ATP çözeltisi hazırlayın, pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 10 & mu saklayın; -20 &gtm;C'de L alikotları.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>ddH2O kullanarak 1 M çözeltisi hazırlayın ve 10 & mu saklayın; l alikotlar -20 &ordm;C'de.</td></tr></tbody></table>

qdot etiketli protein ve site-specifically tarihinde λ dna molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

Floresans mikroskobu karmaşık biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde mekanizmaları dissekan harika katkılar yaptı. DNA-protein etkileşimleri çalışmak için tek molekül deneyleri içinde değerlendirilmesi için iki önemli etken vardır: DNA substrat kolay gözlem ve bir protein ile uygun bir floresan probe etiketleme için yeterli uzunlukta. 48,5 kb λ DNA DNA substrat için iyi bir adaydır. Kuantum nokta (Qdots), uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek kaliteli resim alma floresan problar, bir sınıf olarak izin verir. Bu yazıda, biz DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA hazırlama ve streptavidin kaplı Qdots bir hedef proteini etiketleme içerir tek molekül düzeyinde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Kavram kanıtı için ORC (kökenli tanıma karmaşık) içinde mayası faiz bir protein seçin ve TIRFM kullanarak bir ARS (özerk Çoğaltma sırası) ile etkileşimi görselleştirin. Diğer Floresan problar ile karşılaştırıldığında, Qdots ise tek molekül çalışmaları nedeniyle yüksek istikrarı photobleaching karşı bariz avantajı var, ama bu özellik nicel deneyleri kendi uygulamasında sınırlar unutulmamalıdır.

Qdot etiketli ORC ve ARS arasındaki etkileşimi görselleştirmek için ilk λ-ARS317 DNA substrat inşa. ARS317 içeren bir DNA parçası entegre edildi Xhoı (33,5 kb) yerel λ DNA'sı Homolog rekombinasyon (Şekil 1A) tarafından site. Rekombinasyon ürün özleri kullanılarak paketlenmiştir ve paketlenmiş fajının parçacıklar (Şekil 1B) LB tabaklarda kültürlü. Pozitif fajının plak PCR tarafından ekranlı ve (Şekil ...

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Bu yöntem, DNA replikasyonu, gen onarımı ve kromozom yapısının korunması gibi DNA protein etkileşimlerinin tek moleküllü görüntüleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, modifiye lambda DNA'sı, yüksek kollajen elde edilebilmesi ve daha sonra etiketli proteinlerin hızla iyileştirilebilmesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü akış hücresi montaj adımlarının öğrenilmesi zordur.Lamelleri temizlemek için, 20 lamel dört boyama kavanozuna koyun, içine etanol dökün ve etanolde 30 dakika boyunca sonikasyon yapın. Ardından lamelleri üç kez ultra saf suyla durulayın. Daha sonra, lamelleri 30 dakika boyunca bir molar potasyum hidroksit ile sonikasyon yapın ve lamelleri üç kez ultra saf su ile durulayın.Ardından etanol ve potasyum hidroksit sonikasyonunu bir kez tekrarlayın. Lamelleri 30 dakika boyunca asetonla sonikleştirin ve ardından ultra saf su ile iyice durulayın. Şimdi lamelleri Piranha çözeltisine yerleştirin ve bir saat boyunca 95 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçka işleminden sonra, lamelleri beş kez ultra saf suyla durulayın. Ardından her bir lameli ultra saf suyla yoğun bir şekilde yıkayın. Lameli kenarından kurutmak için kağıt kullanın ve lameli bir boyama kavanozuna koyun.Lameli 110 derecelik bir fırında iyice kurulayın. Şimdi lameli metanol ile durulayın ve ardından lameli kurutmak için boyama kavanozunu 110 derece fırına geri koyun. Lamel işlevselleştirmesini gerçekleştirmek için, her kavanoza 70 mililitre Silan çözeltisi ekleyin, kapağı vidalayın ve kavanozu gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.Lamelleri ultra saf suyla doldurulmuş üç beher kullanarak yıkayın. Lamelleri nitrojen gazı kullanarak iyice kurulayın. 150 miligram metoksi-PEG ve altı miligram biotin-PEG'yi bir mililitre taze hazırlanmış 0.1 molar sodyum bikarbonat içinde çözün.Çözünmeyen PEG'leri çıkarmak için bir dakika boyunca 17.000 kez g'de santrifüjleyin. Şimdi silanize lamel ortasına 100 mikrolitre PEG solüsyonu pipetleyin ve üstüne başka bir silanize lamel yerleştirin. Lamelleri karanlıkta en az üç saat boyunca PEG solüsyonu ile inkübe edin.Lamel çiftlerini ayırın ve işlevselleştirilmiş yüzeyi yukarı bakacak şekilde tutun. Lamelleri ultra saf su kullanarak iyice durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın. Şimdi bir işaretleyici kalem kullanarak köşelerden birinde lamellerin işlevsel tarafını işaretleyin.Kapağında bir delik olacak şekilde delinmiş 50 mililitrelik bir tüpe bir lamel yerleştirin. Tüpü plastik bir torbaya koyun, torbayı bir vakumlu mühürleyici kullanarak kapatın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Akış hücresini monte etmek için, bir zımba kullanarak bir çift taraflı bant parçasının ortasında bir kanal kesin.Çift taraflı bandın kağıt tarafını soyun ve iki delikli cam tarafa yapıştırın. Kağıt tarafını soyarak hava kabarcıklarını çıkarmak, çift taraflı bandın plastik tarafından daha kolaydır. Hava kabarcıklarını çıkarmak için banda bastırın.Ardından, elmas uçlu bir cam çizici kullanarak işlevselleştirilmiş bir lamel dört parçaya kesin ve işlevselleştirilmiş tarafı yukarıda tutarak nitrojen gazı kullanarak kalıntıları temizleyin. Çift taraflı bandın plastik tarafını soyun ve slaytı işlevselleştirilmiş lamel üzerine yapıştırın. Lamel ile bant arasındaki hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe bastırın.Hava kabarcıklarının tamamen çıkarılması, içine tamponlar pompalanırken akış hücresinin sızmasını önleyebilir. Şimdi giriş borusunu küçük deliğe yerleştirin ve çıkış borusunu büyük deliğe yerleştirin. Boruyu epoksi kullanarak sabitleyin.Bir şırınga kullanarak mililitre Streptavidin başına 20 mikrolitre 0.2 miligramı manuel olarak akış hücresine pompalayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra Streptavidin yerini almak ve oda sıcaklığında tutmak için bloke edici tamponu akış hücresine pompalayın. 532 nanometre lazer ve 640 nanometre lazer kullanarak aynı anda uyarma ile bir numaralı floresan mikroskobu test slayında A5 ile kırmızı ve uzak kırmızının odak hizalamasını elde edin.Bölme optikleri ile çift dalga boylu görüntüler üretin. Akış hücresini mikroskobun üzerine yerleştirin ve çıkış hortumunu, otomatik infüzyon çekme programlanabilir bir pompaya monte edilmiş 10 mililitrelik bir yaya bağlı daha uzun bir boruya bağlayın. Tamponu bloke ederek ve çıkış borusunu çevirerek akış hücresindeki hava kabarcıklarını çıkarın.80 mikrolitre bloke edici tampona 0.5 mikrolitre biyotinile lambda-ARS317 DNA ekleyin. Hazırlanan karışımı iki dakika boyunca dakikada 25 mikrolitre akış hücresine pompalayın. Daha sonra lambda-ARS317 DNA'sını dakikada 50 mikrolitre hızında 200 mikrolitre bloke edici tampon kullanarak yıkayın.Şimdi akış hücresindeki engelleme tamponunu çıkarmak için dakikada 50 mikrolitre hızında 200 mikrolitre bağlama tamponu pompalayın. Daha sonra, 96 mikrolitre bağlama tamponuna iki mikrolitre ORC-Qdot705, bir mikrolitre DTT ve bir mikrolitre ATP ekleyin. ORC-Qdot705'in son konsantrasyonu 0.2 nanomolardır.Bağlama tamponunu metin protokolünde detaylandırıldığı gibi pompaladıktan sonra, hazırlanan ORC-Qdot705 çözeltisinin 20 mikrolitresini dakikada 10 mikrolitre hızında akış hücresine pompalayın. Dakikada 705 mikrolitre hızında 200 mikrolitre bağlayıcı tampon kullanarak fazla ORC-Qdot100'i boşaltın. Daha sonra, DNA substratlarını dakikada 100 mikrolitre hızında boyamak için 30 nanomolar SYTOX Orange ile bağlanma tamponunu akış hücresine pompalayın.Son olarak, 405 nanometre lazer kullanarak ORC-Qdot705 sinyalini uyarın ve 532 nanometre lazer kullanarak SYTOX Turuncu lekeli DNA sinyalini uyarın. Dört bantlı bant geçiren bir filtre kullanarak dakikada 100 mikrolitre akışla sinyalleri aynı anda gözlemleyin. Görüntüleri EMCCD ile kare başına 100 milisaniye ile kaydedin.Lambda-ARS317 DNA substratının çizimi burada gösterilmiştir. Qdot705 etiketli ORC, 405 nanometrelik bir lazer tarafından uyarıldı. SYTOX Turuncu lekeli DNA, 532 nanometrelik bir lazerle uyarıldı.Birleştirilmiş sonuç, Qdot705 etiketli ORC'nin ARS317'ye bağlandığını gösteriyor. Lambda-ARS317 DNA'sı üzerindeki ORC bağlanma dağılımının sonucu, ORC'nin ARS317'de yüksek miktarda bağlandığını gösterir. Bu prosedürü takiben, protein-protein etkileşimleri ve protein dinamikleri ile ilgili ek soruları yanıtlamak için tek moleküllü FRET gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, tek moleküllü floresan görüntüleme alanındaki araştırmacıların, in vitro DNA replikasyonu ve DNA onarımının yeniden yapılandırılmış sistemlerinde DNA protein etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Piranha solüsyonu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken koruyucu yüz maskelerinin takılması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Tanımlanmış uzunluktaki fosforotiyoat DNA'dan tek değerlikli hedeflenen kuantum noktalarının (mQD'ler) hazırlanması için ayrıntılı talimatlar sağlıyoruz. DNA sarma yüksek verimle gerçekleşir ve bu nedenle ürünler saflaştırma gerektirmez. Canlı hücre görüntüleme uygulamaları için mQD'leri hücre yüzeyi reseptörlerine hedeflemek için SNAP etiketinin kullanımını gösteriyoruz.

Üretim ve Monovalent Kuantum Noktalarının Hedefleme

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Öğrenin, tek molekül görüntüleme için kuantum nokta etiketli proteinler ve modifiye λ DNA kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemeyi. Bu yöntem moleküler biyoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet