Name: Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Keşfedin C. arabica L. hücre süspansiyonlarından kafein ekstraksiyonu ve kafein sentaz enzimatik aktivite değerlendirmesi yöntemini. Bu teknik bitki metabolizması ve biyoteknoloji alanlarında kafein biyosentezi çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bizim Laboratuvar çalışmalarını Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS için bir hibe tarafından finanse edildi. Bu araştırma RJPK (No. 37938) CONACyT ve Sistema Nacional de Investigadores (4422) tarafından verilen bir arkadaş grubu tarafından da desteklenmiştir. Yazarlar CIATEJ Bu makale yazma sırasında onun teçhizatları kullanım için teşekkür ederiz. Özel teşekkür Dr Víctor Manuel González Mendoza tesisleri için moleküler biyoloji bölümü ve Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM tüm öneriler için bu makalenin çekimler sırasında genişletilir.

1. kafein çekme içinde hücre süspansiyonlar, C. arabica L.
<ol><li>C. arabica hücre süspansiyonlar9kullanın. Sürekli 100 sürekli ışık (8.3 W/m2) altında 25 ° C'de sallayarak rpm ile pH 4,3 Murashige ve Skoog ortamda iki haftada bir altkültürler tarafından süspansiyonlar bakımını yapar.</li>
	<li>11 µm gözenek filtre kağıdı ve bir Buchner huni kullanarak vakum filtrasyon altında hücre hasat.</li>
	<li>Bir ölçek kullanarak kendine hakim hücre taze ağırlığını kayıt, alüminyum folyo poşete, onları sıvı azot içinde dondurma ve-80 ° C'de analiz kadar tutun.</li>
	<li>72 h için dondurulmuş hücresel malzeme lyophilize.</li>
	<li>Lyophilized hücreleri ağırlığını Kuru ağırlık verim tahmin etmek için kayıt.</li>
	<li>Toz malzeme (9 cm x 7.5 cm) yeniden kullanılabilir polietilen torbalarda saklayın. Malzeme ince toz ve bir desiccator deposunda kadar kullanmak macerate.</li>
	<li>Analitik ölçekte kuru hücresel maddenin 0.5 g ölçmek ve bir cam şişeye (25 mL) ekleyin.<ol>
<li>10 mL aseton lyophilized hücrelere ve girdap karıştırıcı 30 karıştırın s homojenizasyon için. O zaman, şişeye alüminyum folyo ile kapatın.</li>
		<li>100 rpm bir rotator (25 ° C) Oda sıcaklığında 5 h için kullanarak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 mL konik tüp ve 13.000 x g , santrifüj 10 dk. sıvı faz için yeni bir tüp ve azaltmak için Transfer için tüm malzeme transfer kuruluk duman başlıklı oda sıcaklığında.</li>
	<li>Aseton 25 µL örnekle resuspend.</li>
</ol>2. koşullar kafein ince tarafından değerlendirilmesi için katman Kromatografi (TLC)-Dansitometresi
<ol><li>Daha önce resuspended kafein ekstresinin 1 µL durağan faz için geçerlidir. Not: Silis jeli tabak (F254) durağan faz kullanılır. Örnekleri uygulamadan önce tabakları bir kromatografi odasında kloroform-metanol [9:1 v/v] 10 mL ile geliştirilmiştir (14 cm x 12 cm x 9,5 cm), ve tabakları oda sıcaklığında kurutulur. Örnekleri uygulandığı kromatografik plaka özellikleri Şekil 1' de gösterilmiştir. Odası için 30 dk plaka geliştirme önce solvent ile doymuş. TLC plakaları kirlenmesini önlemek için eldiven kullanarak işlemesi gerekir.</li>
	<li>TLC ile mobil faz Siklokekzan-aseton [40:50 v/v] 10 mL Kromatografi odasında geliştirmek. Not: Bu karışımı bir saklama faktör 0.34 (Rf) kafein ayırma verir.<ol>
<li>TLC plaka odasından kaldırın ve oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kısa dalga boyu ultraviyole ışık bantlarında kafein görselleştirmek (UV, 254 nm). Kompakt bir UV lamba kullanın. Ayrıca, bu adımda, UV koruma ile kullanım gözlükler.</li>
	<li>Tarafından Dansitometresi 273, kafein düzeyleri ölçmek nm. Araç Kromatografi yazılımı ile kontrol edilir.</li>
</ol>3. ribonükleik asit (RNA) yalıtım
<ol><li>Hücre süspansiyonlar adım 1.1 ve filtre kağıdı (11 µm gözenek boyutu) ile vakum filtrate al.</li>
	<li>Filtre kağıdı hücresel malzeme toplamak, dışarı bir analitik bakiyesine hücresel malzemenin 0.5 g tartmak ve alüminyum folyo paketi. Sıvı N2örnekle dondur.</li>
	<li>Bir porselen havan topu sıvı azot ile hücre örnekte macerate ve homojenize oluncaya kadar RNA izolasyon reaktif 1 mL ekleyin. Not: 6 h. RNA izolasyon reaktif fenol, guanidin isothiocyanate ve diğer bileşenler içerir için 300 ° c Muffe fırın porselen havan Sterilize.<ol>
<li>Örnek 500 µL steril microcentrifuge tüp (1,5 mL) aktarın. Kloroform izoamil alkol (24:1) 300 µL ve denge fenol (pH 8.0) 300 μL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek bir girdap mikser ile karıştırın ve sonra 20.000 x g 4 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Üst aşaması 300 μL microcentrifuge tüp aktarın. İsopropanol 200 μL ekleyin. -20 ° C'de 1 h için tüp kuluçkaya</li>
	<li>Tüp, 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve sıvı faz dikkatle boşaltmak.<ol>
<li>1 mL tüp bir Pelet oluşturmak için etanol (% 70) ekleyin. 12.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve dikkatle boşaltmak. Bu iki kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek oda sıcaklığında (25 ° C) 1,5 saat için kuru. RNA özü 25 μL dietil pyrocarbonate (DEPC) ile resuspend-tedavi su. Not: RNA ayıklama için %0,1 DEPC v/v ile tedavi su kullanın.</li>
</ol>4. kuluçka RNA transkript deoksiribonükleaz (DNaz) ile
<ol><li>Steril microcentrifuge tüp içine 2 µg toplam RNA'ın özü ekleyin. 10 x reaksiyon arabellek (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) 1 μL ekleyin. 1 U/µL DNaz 1 μL ekleyin.<ol>
<li>Son hacmi 10 μL DEPC tedavi su ile reaksiyon getir. Örnek ve 1 dk. için 2.000 x g de kısaca santrifüj karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>50 mM disodyum ethylenediaminetetraacetate dihydrate (Na2EDTA) 1 μL ilavesi ile reaksiyonu durdurmak ve örnek 10 dk 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>RNA bütünlüğünü özel jel elektroforez tarafından analiz.<ol>
<li>Standart bir % 1'özel jel hazırlamak ve nükleik asit leke çözüm enterkalasyon x 3 1 µL ile leke.</li>
		<li>500 uygulamak ng RNA'ın özel jel ve jel çalıştırın.</li>
		<li>Bir jel fotoğraf dokümantasyon sistemi kullanarak RNA bütünlüğünü görselleştirin.</li>
		<li>RNA transkriptaz tarafından cDNA sentezi için şablon olarak kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. tamamlayıcı Deoksiribonükleik asit (cDNA) sentezi
<ol><li>Toplam RNA'ın 2.5 μg microcentrifuge tüp ekleyin. 1 μL oligo-deoxythymine (dT) astar ekleyin ve 13 μL son hacim tüp nükleaz ücretsiz su ile doldurun. Örnek mix ve 2.000 x g için 1 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Örnek 5 min için 65 ° C ve daha sonra 4 ° C'de 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Ters transkriptaz, 2 μL deoxynucleotide trifosfatlardan (dNTPs) Mix (her dNTP 10 mM) ve ters transkriptaz (200 U/µL) 1 μL için kullanılan tepki arabellek x 5 4 μL ekleyin. Karışımı yavaşça ve 2.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Örnek 50 dk 45 ° C ve daha sonra 10 dk 70 ° C kuluçkaya.</li>
	<li>UV spektrofotometre kullanarak cDNA konsantrasyon ölçmek.</li>
	<li>CDNA polimeraz zincir tepkimesi (PCR) için şablon olarak kullanın. Not: Tepki arabellek 10'a kadar kullanıldı (adım 4.1.1) x ve 5 x kere konsantre (adım 5.3), anılan sıraya göre.</li>
</ol>6. Gene CCS1 yükseltmek için gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR)
<ol><li>Taq DNA polimeraz 2 x (0.1 U/mL) ve 0,1 mikron 5-carboxy-X-rodamine (ROX), 7.5 μL PCR microcentrifuge tüp ekleyin. Not: Sıcak başlangıç Taq DNA polimeraz 2 x 2 x konsantre bir çözüm olarak kullanıldı.<ol>
<li>5 μL nükleaz ücretsiz su ekleyin.</li>
		<li>0,75 μL her 10 mikron ileriye ve geriye doğru ilk gen CCS1 (AB086414) yükseltmek için Ekle (ileri: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' ve ters: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Ev tutma gen ayrı bir tepki olarak tübülin için astar kullanmak (ileri: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' ve ters: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.</li>
		<li>600 eklemek cDNA şablonunun ng.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 dk ve 95 ° C 5 dakika süreyle tepki 40 devredir 30 95 ° c için gerçek zamanlı PCR sistemdeki kuluçkaya için 50 ° c amplifikasyon reaksiyonu gerçekleştirmek s, 60 ° C 30 30 72 ° C ve s s.</li>
	<li>Örneği 50 ° C'kuluçkaya 30 s ve 20 ° C 10 s.</li>
	<li>PCR yazılımlarıyla veri analiz.</li>
	<li>2 tarafından göreli Ifade hesaplamak-ΔΔCT yöntemi Livak ve Schmittgen tarafından açıklanan (2001)12. Not: DNA şablon (şablon kontrol, NTC) dışında tüm bileşenleri içeren bir denetim tepki kontamine atma reaktifler veya amplifikasyon astar-dimer çözümleyebilirsiniz.</li>
</ol>7. Toplam Protein özü hücre süspansiyonlar, C. arabica L.
<ol><li>Bir orta-gözenek filtre kağıdı ile vakum altında hücre süspansiyonlar filtre.</li>
	<li>Hücresel malzeme 1 g tartmak ve alüminyum folyo paketi.<ol>
<li>Sıvı azot ile örnek dondur. İnce bir toz almak için sterilize porselen havan mermisi örnekte macerate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek bir cam şişe nakletmek ve eklemek 2.5 mL ayıklama arabelleği (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hidroklorid (Tris-HCl), pH 8.0, 10 mM β-mercaptoethanol, 5 mM Na2EDTA ve %0,5 (w/v) sodyum askorbat içeren.<ol>
<li>Örnek bir girdap karıştırıcı 2 min için karıştırın. Not: Örnek proteini denatürasyon önlemek için buza tutulur önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve 500 µL aliquots kriyojenik şişeleri (2 mL) aktarın. -72 ° C'de örnekleri kullanmak kadar saklamak.</li>
	<li>562 örnek protein konsantrasyonu ölçmek bicinchoninic asit tahlil Sığır serum albümin ile standart olarak kullanarak bir spektrofotometre nm.</li>
</ol>8. enzimatik tahlil için kafein Synthase
<ol><li>200 µM SAM, metil [3H] 4,07 kBq içeren bir microcentrifuge tüp bir reaksiyon karışım hazırlamak-SAM, 200 µM theobromine, 200 µM MgCl2ve 5 mikron kafein. 100 mM Tris-HCl pH 8.0 ile 200 µL birime artırın.</li>
	<li>Microcentrifuge tüp buz üzerinde tutun ve 7-9 mg protein içeren çözünür kesir bir ses eklemek. Sonra gönderen vortex mix ve termostatik banyo/sirkülatörün 30 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Çeşitli örnekleri bir toplu iş için her örnek içinde yinelenen bir 30 dk tam zaman diliminde tüm örnekleri için tepkiler durdurmak için yeterli zaman vermek için 1 dk dönemlerde kuluçkaya.<ol>
<li>Reaksiyon durdurmak ve örnek bir girdap mikser ile sallamak için kloroform 1 mL ekleyin. Radyoaktif kafein çözücü içinde kaldırmak için 3 dk bir girdap Mikser kullanarak örnek sallamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>11.000 x g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve dikkatle 900 µL hacmi yeniden elde etmek. Ardından örnekleri için mercek şişeleri aktarın.</li>
	<li>Kuruluk başlıklı 25 ° C'de oda sıcaklığında tamamlamak için kloroform buharlaşır Mercek sıvı 5 mL flakon ve örnek karıştırın.</li>
	<li>Kafein bir mercek Counter içine dahil radyoaktivite analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolgy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li>
<li>Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814607001422">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li>
<li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li>
<li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Headache+and+Pain%22%5BJournal%5D)">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li>
<li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li>
<li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945296045888">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li>
<li>Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li>
<li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li>
<li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+%28Coffea+arabica+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li>
<li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022998000817">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li>
<li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132000000100009">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li>
<li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945206000963">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li>
<li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li>
<li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+%28Arabica%29+and+Coffea+canephora+%28Robusta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada içerik kafein değerlendirmek için en uygun koşulları mevcut, CS etkinlik ve transkript düzeyleri bir vitro doku kültürü, C. arabicahücre süspansiyonlar gibi bitki. Önceki raporlar Bakımı hücreleri ışık ışınlama altında ve theobromine kültür orta huzurunda kafein, kafein ayırma yöntemleri değerlendirmek edinerek düzeyini artırmak için uygun parametreler olduğunu doğruladı ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) kullanarak. Şu anda hücre süspansiyonlar içinde biyosentezi kafein e...

Kafein bitkilerin cins Coffea1tarafından uzarlar olan ikincil bir metaboliti olduğunu. Bu alkaloit methylxanthine ailesine ait ve bu patojenler ve otobur2,3olumsuz etkilerine karşı hareket edebilir çünkü bir kimya fabrikası savunma olarak kabul edilir. Buna ek olarak, bu metaboliti yaygın olarak tüketilen dünya çapında4,5kahve içecek uyarıcı özellikleri için sorumludur. Onun özellikleri nedeniyle, birkaç araştırma grubu biyosentetik yolu ve katabolizma kafein6,7okumak ilgilendi. Şu anda, bitki vitro hücre/doku kültürleri çeşitli biyotik ve abiyotik stratejileri8,9altında kafein birikimi değerlendirmek için bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Kafein biyosentezi içerir tarafından sipariş edilen Ntakip karşılık gelen riboz nükleozit hydrolytic açıklaması, 7-methylxanthine-methylations pozisyonlarda 3 ve 1. Belirli bir S- adenosyl metiyonin (SAM)-bağımlı N-Metiltransferaz (NMT) tromboksan metilasyonu pozisyonda 7, oysa theobromine synthase (TS) ve CS söz konusu olursa 3 - ve 1-methylations yılında, sırasıyla, theobromine üreten ve kafein. Genlerin farklı NMTs kodlama çalışma kafein üretim10,11düzenleyen mekanizması anlama izin verdi. N -metiltransferaz etkinliği olan CS, kafein11biyosentetik yolun son iki adımı tromboksan. Kahve ağacı fidan ışık radyasyon kafein biyosentezi artış sonuçlanır CS etkinlik artırabilir gösterilmiştir. Son zamanlarda, C. arabica L. ışık ışınlama altında hücre Süspansiyonlar bakım kafein8biyosentetik yolu etkileyen abiyotik stres faktörleri üretmek etkilerini değerlendirmek için en uygun koşul olduğunu gösterdi. Bu çalışmalarda elde edilen bilgileri kafein biyosentetik yolu çalışmanın tür vitro sistemlerde maksimize etmek için metabolik Mühendisliği ve sistemleri biyoloji uygulamaları olabilir.
Kafein biyosentezi incelenmesi için uygun bir model alma avantajları göz önüne alındığında, biz C. arabica L. çıkarma koşulları hücre süspansiyonlar kafeini için en iyi duruma getirilmiş Enzimatik aktivite yanı sıra organik kafein synthase bu enzim kodlama 1 (CCS1) gen tutanaklar düzeyini değerlendirmek için metodolojik adımları eğitim için yararlı bir protokolü geliştirmeye mümkündü. Burada, biz ayıklayın ve ince katmanlı Kromatografi ve Dansitometresi (TLC-Dansitometresi) tarafından C. arabica hücre süspansiyonlar kafein ölçmek için bir protokol raporu.

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog Bazal tuz karışımı</td><td>FitoTeknoloji Laboratuvarları</td><td>M524</td><td>Paket Boyutu: 50 L <güçlü>Reaktif (mg/L) </güçlü> Amonyum Nitrat (1650) Borik asit (6.2) Kalsiyum klorür, susuz (322.2) Kobalt Klorür ve boğa; H2O (0.025) Bakır Sülfat & boğa; 5H2O (0.025) Na2EDTA&boğa; 2H2O (37.26) Demir Sülfat & boğa; 7H2O (27.8) Magnezyum Sülfat, Susuz (180.7) Manganez Sülfat & boğa; H2O (16.9) Molibdik Asit (Sodyum Tuzu) & boğa; 2H<alt>2</alt>O (0.25) Potasyum İyodür (0.83) Potasyum Nitrat (1900) Potasyum Fosfat, Monobazik (170) Çinko Sülfat ve boğa; 7H2O (8.6) <güçlü>< ><güçlübr/> miyo-inositol (100) tiamin (10) sistein (25) sükroz (30000) 2,4-diklorofenoksiasetik asit (3) 6-benzilamin pürin (1)</td></tr><tr><td>Kafein</td><td>SIGMA</td><td>C0750-5G</td><td>STANDART-5g</td></tr><tr><td>Teobromin</td><td>SIGMA</td><td>T4500</td><td>20 g</td></tr><tr><td>CAMAG TLC Tarayıcı-4</td><td>CAMAG</td><td>27.62</td><td></td></tr><tr><td>WinCATS Düzlemsel Kromatografi Yöneticisi yazılımı</td><td>CAMAG</td><td>1.4.10</td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>İzoamil alkol (24:1)</td><td>SIGMA</td><td>C-0549</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Sikloheksan</td><td>JALMEX</td><td>C4375-13</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>JT BAKER</td><td></td> 900643 <td>4 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT BAKER</td><td>9093-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>JALMEX</td><td>C-4425-15</td><td>3.5 L</td></tr><tr><td>TLC silika jel 60 F254</td><td>Merck</td><td>1.05554.0001</td><td>TLC plaka</td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol</td><td>M6250</td><td>SIGMA</td><td>100 mL</td></tr> <tr><td>(+) - sodyum L-askorbat</td><td>A4034</td><td>SIGMA</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trizma bazı</td><td>SIGMA</td><td>T6066</td><td>1 Kg</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit %36.5-38</td> <td>JT Baker</td><td>9535-05</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Termo bilimsel</td><td>232227</td><td>Kiti</td></tr><tr><td>Metil [3H] -S-adenosil metiyonin</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155</td><td>15 Ci / mmol</td></tr><tr><td>Sıvı sintilasyon şişelerinin</td> spesifik aktivitesi <td>SIGMA</td><td>Z253081</td><td></td></tr><tr><td>Termostatik banyo / sirkülatör</td><td>Cole Parmer</td><td>60714</td><td></td></tr><tr><td>Mikro santrifüj tüpü</td><td></td><td>1,5 mL Eppendorf</td><td></td> Tüpü</tr><tr><td>Kriyojenik şişeler</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS23202A</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Santrifüj 5804</td><td>Eppendorf</td><td>5804 000925</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>Termolin,</td><td>LR 5947</td><td></td></tr><tr><td>Porselen harç</td>, <td>Fisherbrand</td><td>FB961B</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>Z274844</td><td>Gözeneklilik ortamı</td></tr><tr><td>Picofuge</td><td>Stratagene</td><td>400550</td><td>2000 x g</td></tr><tr><td>Analitik terazi</td><td>VE</td><td>HR-120</td><td>Model HR-120</td></tr><tr><td>Sintilasyon sayacı</td><td>Beckman Coulter</td><td>6500</td><td></td></tr><tr><td>Jel fotoğraf dokümantasyon sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemic XRS</td><td>Model Chemic XRS</td></tr><tr><td>Kompakt UV lambası</td><td>UVP</td><td>95002112</td><td>UVGL-25</td></tr><tr><td>Scienceware HDPE Buchner hunisi</td><td>SIGMA</td><td>2419907</td><td>Tip 37600 karıştırıcı</td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>Thermo scientific</td><td>15596-018</td><td>200 mL</td></tr><tr><td>ReverdAid Ters transkriptaz</td><td>Thermo scientific</td><td>#EP0441</td><td>10000 U</td></tr><tr><td>Oligo (dT)18 astar</td><td>Thermo scientific</td><td>#S0131</td><td>100 &mikro; M</td></tr><tr><td>DNase I, RNaz içermeyen</td><td>Thermo scientific</td><td>#EN0525</td><td>1000 U</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1.25 mL</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Thermo scientific</td><td>R0191</td><td>R0191</td></tr><tr><td>SYBR Yeşil qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo scientific</td><td>K0251</td><td>25 ve mikro'nun 200 reaksiyonu için; L</td></tr><tr><td>PikoReal</td><td>Thermo scientific</td><td>2.2</td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>Fenol, pH 8.0, dengeli, Moleküler Biyoloji Sınıfı, Ultra saf</td><td>USB</td><td>J75829</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Karal</td><td>2040</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Etil alkol</td><td>SIGMA</td><td>64175</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Dietil pirokarbonat</td><td>SIGMA</td><td>D5758</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Lab Döndürücü</td><td>LW Bilimsel</td><td>Mod. LW210</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Kafein (1,3,7-trimethylxanthine) bir pürin alkaloid popüler içecekler kahve ve çay gibi mevcut olduğunu. Bu Antimikrobiyal aktivite ve doğal bir böcek ilacı olarak kabul edilir çünkü bu ikincil metaboliti kimyasal bir savunma olarak kabul edilir. Kafein Ayrıca çevredeki bitkilerin büyüme engelleyen olumsuz allelopathic etkileri üretebilir. Buna ek olarak, dünyanın her yerinden insanlar kafein analjezik ve uyarıcı etkileri için tüketmek. Kafein teknolojik uygulamalar ilgi nedeniyle bu bileşik biyosentetik yol üzerinde araştırma büyüdü. Bu çalışmalar öncelikle kafein biyosentezi düzenleyen biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları anlama üzerinde odaklanmıştır. Vitro doku kültürü biyosentetik bu yolu çalışmak için kullanışlı bir sistem haline gelmiştir. Bu makale için miktar kafein ve kafein synthase (CS) kodlama transkript düzeyleri gen (CCS1) ölçmek için adım adım bir protokol içinde hücre süspansiyonlar C. arabica L. hem de faaliyete anlatacağız.

Burada sunulan oluşum yolu ile elde edilen kafein özleri TLC-Dansitometresi tarafından Kromatografi Şekil 1' de gösterilen düzenine göre plaka örnekleri subjecting tarafından analiz edildi. Bu bileşik için hücre özleri kafein, bir eğri seviyeleri çeşitli ticari standart konsantrasyonları ile ölçmek için (Şekil 2A) kullanılır. Kafein absorbans desen görünür ışık spektrumu (UV-VIS) maksimum emilim tepe 273 kullanarak analiz nm (<st...

Bu iletişim kuralı çıkarma ve miktar hücre süspansiyonlar C. arabica L., kafein için verimli bir metodoloji ve kafein synthase enzimatik aktivite ile ifade düzeyini değerlendirmek için deneysel bir işlem açıklar Bu enzimi kodlayan gen.

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Bu yöntem analitik kimya, biyokimya ve biyoteknoloji alanlarında ki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Kafein biyosentezinde meydana gelen değişiklikler nelerdir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, kafein üreten invitro bitki modellerine uygulanabilmektir.Başlamak için, lyophilized hücrelere aseton 10 mililitre ekleyin ve 30 saniye girdap karıştırıcı ile karıştırmadan önce şişe mühür. Daha sonra, oda sıcaklığında beş saat boyunca bir rotator ile 100 rpm örnek karıştırın. Bundan sonra, aseton 25 mikrolitre ile numuneyi yeniden askıya alın.İlk olarak, silika jel plakaları için önceden hazırlanmış kafein ekstresi bir mikrolitre uygulayın. Daha sonra, mobil faz, sikloheksane aseton 10 mililitre ile kromatografi odasında TLC geliştirmek. Kafein bantlarını kompakt bir UV lambası ile kısa dalga boyu ultraviyole ile görselleştirin.Bundan sonra, 273 nanometre densitometri ile kafein düzeylerini ölçmek. Filtre kağıdı kullanarak, vakum filtresi önceden hazırlanmış hücre süspansiyon. Daha sonra, hücre örneğini sıvı nitrojen ve RNA izolasyon reaktifi ile homojenize olana kadar kullanmak için porselen harç kullanın.Daha sonra, numunenin 500 mikrolitresini steril mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sonra, kloroform izoamyl alkol 300 mikrolitre ekleyin ve dengeli fenol 300 mikrolitre. Bir girdap karıştırıcı ile karıştırın ve santrifüj 20, 000G dört derece santigrat 15 dakika için.Bundan sonra, temiz bir mikro santrifüj tüpü üst faz300 mikrolitre aktarın. Sonra, 200 mikrolitre isopropanol ekleyin ve tüpü negatif 20 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Pelet etanol bir mililitre ekleyin.Daha sonra tüpü 12,000G'de 10 dakika santrifüj edin ve sıvı fazı ayırın. Daha sonra, oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca numune kuru. Daha sonra, DEPC ile işlenmiş su 25 mikrolitre ile RNA ekstresi yeniden askıya.İlk olarak, steril bir mikro santrifüj tüp toplam RNA ekstresi iki mikrogram ekleyin. Daha sonra, 10X reaksiyon tampon bir mikrolitre ve DNase bir mikrolitre ekleyin. DEPC ile işlenmiş su ile 10 mikrolitre reaksiyonun son hacmini getirin.Sonra, bir dakika için 2, 000G örnek ve santrifüj karıştırın. Sonra, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca örnek kuluçka. Bundan sonra, reaksiyonu durdurmak için 50 mikromkare disodyum etilen dimine dilamin tetraasetat bir mikrolitre ekleyin.Numuneyi 65 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, bir agarose jel için RNA 100 nanogram uygulayın ve jel çalıştırın. Bir jel fotoğraf dokümantasyon sistemi kullanarak RNA bütünlüğünü görselleştirin.İlk olarak, bir mikro santrifüj tüpüne toplam RNA 2,5 mikrogram ekleyin. Sonra, oligo deoksitimidin astar bir mikrolitre ekleyin ve nükleaz içermeyen su ile 13 mikrolitre son hacmine tüp doldurun. Karışımı örnek ve santrifüj 2, 000G bir dakika için.Numuneyi 65 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Ve sonra dört derecede iki dakika lığına. Daha sonra, numuneye dört mikrolitre 5X reaksiyon tamponu, iki mikrolitre dNTP karışımı ve bir mikrolitre ters transkriptaz ekleyin.Daha sonra, bir dakika için 2, 000G hafifçe örnek ve santrifüj karıştırın. Bundan sonra, 45 santigrat derecede 50 dakika, sonra 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübül. PCR mikro santrifüj tüpüne 7,5 mikrolitre 2X Taq DNA polimeraz ve 0,1 mikromol RAX ekleyin.Daha sonra, CCS1 genini yükseltmek için her biri ileri ve ters astar 0,75 mikrolitre ekleyin. Bundan sonra, 600 nanogram CDNA şablonu ekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi gerçek zamanlı PCR amplifikasyon reaksiyonu Preform.Ardından, verileri PCR yazılımıyla analiz edin. Hücresel malzeme bir gram tartmak ve alüminyum folyo içinde paketi. Numuneyi aldıktan sonra, cam bir şişeye aktarın ve 2,5 mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin.Sonra, 20, 000G dört santigrat derece 20 dakika için örnek santrifüj. 500 mikrolitre aliquot'u kriyojenik şişelere aktarın. Bir spektrofotometre ile, standart olarak sığır seric albumin ile, bir bicinchoninic asit tsay kullanarak 562 nanometre de numunenin protein konsantrasyonu ölçün.İlk olarak, metin protokolüne göre, bir mikro santrifüj tüp reaksiyon karışımı hazırlayın. Daha sonra, 100 milimolar tris HCL ile 200 mikrolitre toplam hacmini artırmak. Unutmayın, kendi güvenliğiniz için radyoaktif madde ile reaksiyon karışımı hazırlanması sırasında uygun önlemleri takip etmek zorunludur.Mikro santrifüj tüpünü buzda tutun ve yedi ila dokuz miligram protein içeren çözünür fraksiyonun hacmini ekleyin. Sonra, karışımı girdap ve 30 derece santigrat 30 dakika kuluçka. Bundan sonra, beş dakika için 11, 000G de numuneleri santrifüj.Daha sonra, dikkatle 900 mikrolitrelik bir hacim kurtarmak ve bir Scintillation vial örnekleri aktarın. Daha sonra, oda sıcaklığında kaputun kuruluğu tamamlamak için kloroform buharlaşır. Şişeye beş mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin.Son olarak, bir sintillation sayacı kullanarak kafein dahil radyoaktivite analiz. Bu protokolde kafein emiciliği, TLC densitometrisi, görünür ışık spektrumu ve 273 nanometrede maksimum emilim de okunarak analiz edildi. TLC plaka kafein ayırma eğrisi, 0.34 arasında bir RF gösterdi, ve 0.39.Askıda hücrelerden elde edilen RNA, 28'ler, 18'ler ve 5'ler RRNA alt birimlerinin açık ayrımlarını sergileyerek örneklerin yüksek kalitede olduğunu gösterir. Son olarak, kafein synthase geni için tek bir amplifikasyon ürünü gösteren QPCR analizinden bir erime eğrisi elde edildi. Bu teknik, geliştirildikten sonra biyoteknoloji ve biyokimya alanlarındaki araştırmacıların kahve, çay ve cocodan ikincil metabolize doku kültürünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.Radyoaktivite ve moleküler patoloji ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven, gözlük ve radyoaktif madde için özel ekipman kullanımı gibi önlemler her zaman alınacaktır.

caffeine-extraction-enzymatic-activity-gene-expression-caffeine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Kaynak: Rufián, J. S. ve diğerleri. Bitki dokusunda Pseudomonas Syringae genlerinin tek hücreli analizi. J. Vis. Exp. (2022).Bu video, floresan etiketlenmiş transkripsiyon faktörü kullanılarak bitkiden ekstra edilmiş patojenik bakterilerde gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Konfokal görüntüleme, virülans gen ifadesinde heterojenliği ortaya koyarak klonal bakteri popülasyonundaki fonksiyonel çeşitliliği ortaya koyuyor.

Bitki Ekstraksiyonu Patojenlerinden Gen İfadesinin Tek Hücreli Analizi

sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

Bu makalede, algılama ve serbest Kılcal bölge elektroforezi ile bitki maddesinden organik asitlerin ölçümü için bir yöntem sunulur. Kahve tohumları organik asit seviyesi üzerinde ikincil bir fermantasyon etkilerini belirleyen bu yöntemin olası bir uygulama, bir örneği temin edilmiştir.

Bitki Doku Organik Asit belirlememize Kılcal Elektroforez kullanma: Bir Test Case incelenmesi<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Tohumlar

In vitro sistemlerin Metabolik yetkinlik ilaç ve toksik maddelerin biyotransformasyonu ve dışa atılması için önemli bir gereksinimdir. Bu protokol, biz Hücre kültürlerinde metabolizma faz değerlendirmek için referans metabolik sondaları uygulanmasını açıklar.

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize<em&gt; İn Vitro</em&gt; Hücre Kültürleri

Bu çalışma, bir hücre süspansiyon kültürü çay (Camellia sinensis L.) bu böcek ilaçları gibi tüm bitki tarafından alınabilir dış bileşiklerin metabolizmasını incelemek için kullanılabilir yaprakları türetilen kurulması için bir protokol sunuyor.

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Bir örnek kullanarak biyolojik dokulardan lipidlerin, metabolitlerin ve proteinlerin kapsamlı şekilde ekstraksiyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Keşfedin C. arabica L. hücre süspansiyonlarından kafein ekstraksiyonu ve kafein sentaz enzimatik aktivite değerlendirmesi yöntemini. Bu teknik bitki metabolizması ve biyoteknoloji alanlarında kafein biyosentezi çalışmalarına olanak tanır.

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Daha fazla video keşfet