Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim
7 Ocak 2019
Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.
Bu yöntem lenfatik ve karaciğer alanlarında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, lenfatik endotel hücreleri gibi, veya LECs, belirli uyaranlara yanıt ve nasıl hastalık patogenezi katkıda bulunur. Bu tekniğin en büyük avantajı, karaciğer lenfatik endotel hücre fenotipve fonksiyonunu hücre bazında değerlendirebiliyor olmamız ve hücre ayrıştırma sonrası aşağı akım uygulamaları için kullanılabilmemizdir. Bu yöntem karaciğer lenfatik biyoloji içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda farklı dokulardan lenfatik endotel hücrelerini değerlendirmek için kullanılabilir, deri ve meme bezi gibi.
Prosedürü gösteren Jeffrey Finlon, laboratuvarımdan profesyonel araştırma görevlisi olacak. İzole karaciğer hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için, yetmiş yüzde etanol ile fare aşağı püskürtme ile başlar, ve bir diseksiyon panosuna pençeleri güvence altına. Anüs üzerinde yaklaşık bir santimetre deri kesmek için diseksiyon makas kullanın ve vücuttan uzak deri kaldırmak için dişli forseps kullanın.
Deri ve periton arasına makas uçları yerleştirin ve boynuna kadar deri kesi devam etmeden önce dokuları ayırmak için makas açın. Her forelimb altında ve her arka bacak üzerinde diseksiyonu tahtaya cilt güvenli ve boynuna doğru kesi uzatmak için yukarı periton çuval çekin. Karaciğer lobları kavramak ve karaciğer etrafında diseksiyon sağlamak için göğüs hemen altında kesti.
Sonra Click's EHAA orta dört mililitre içine organ aktarın. Yaklaşık bir milimetre çapında parçalar halinde karaciğer kesmek ve taze hazırlanmış sindirim çözeltisi ve DNase 1 beş yüz mikrolitre beş yüz mikrolitre parçaları sindirmek için neşter kullanın. Otuz yedi santigrat derece on beş dakika sonra, iyice dokuları karıştırmak ve başka bir on beş dakika için kuvöz konteyner dönmek için beş yüz mililitrelik pipet kullanın.
Kuluçka sonunda, sindirilmiş örneği yüz mikron süzgeçten elli mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve bir mililitrelik şırıngadan gelen pistonu kullanarak kalan doku parçalarını kafesten hafifçe bastırın. Filtreyi beş mililitre izolasyon tamponuyla yıkayın ve kalan dokuları süzgeçten hafifçe bastırın. Santrifüj ile izole karaciğer hücrelerini toplamak ve kırmızı kan hücresi lisis tampon dört mililitre pelet yeniden askıya alın.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, izolasyon tampon on mililitre hücreleri yıkayın ve tam karaciğer sayısını belirlemek için hemositometre hücreleri saymak. Peleti yüzde yirmi iyodixanol'ün beş mililitresinde yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu bir mililitre PBS ile kaplama. Yoğunluk gradyan ayırma ile hücreleri ayırın ve PBS ve iodixanol arasındaki katmanı hasat.
Sonra hücreleri yüz mikrometresüzsüzden yeni bir elli mililitrelik konik tüpe süzün. Hücreleri on mililitre taze izolasyon tamponuyla yıkayın ve elde edilen peleti %2'lik fetal büyükbaş serum veya FBS ile tamamlanan 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Sayma sonra, aliquot yaklaşık beş kez on altıncı non-parakimal hücreler her kontrol ve santrifüj için doksan altı iyi plaka deneysel kuyu içine ve pbs artı FBS doksan mikrolitre de pelet askıya iyi.
Her kuyuya uygun deneysel ve kontrol birincil antikor kokteylleri ekleyin ve uygun bir canlılık belirteci ile tüm kuyuları lekeleyin. Bu işlemdeki en önemli adım antikorların doğru titrasyonu ve lekelenmeyi doğrulamak için buz tipi kontrollerin ve floresan-1 kontrollerinin kullanılmasıdır. Dört santigrat derece de otuz dakika sonra, santrifüj iyi başına PBS artı FBS yüz mikrolitre ile hücreleri yıkayın ve her kuyudan tek tek beş mililitre yuvarlak alt akış sitometri tüpleri içine hücreleri transfer PBS artı tüp başına FBS dört yüz mikrolitre son hacmine.
Ardından, akış sitometresindeki lazer ve kompanse ayarlarını ayarlamak ve her tüp için tüm olayları okumak için küçük bir hücre hacmi kullanın. Tüm tüpler okunduğunda, verileri uygun bir akış sitometrisi analiz programına aktarın. Negatif ifadenin canlı olarak kabul edildiği canlı lık işaretçisi boyasını temel alan canlı hücrelerüzerindeki kapı.
Hücrelerin büyüklüğü ve tanecikliliğinin yanı sıra canlılık belirteç boya ekspresyonuna göre canlı hücrelere geçit, olumlu ve negatif popülasyonları belirlemek için uygun izotip kontrolü ve floresan-1 verilerini kullanarak CD45 negatif CD31 pozitif hücre popülasyonuna gating takip edin. Daha sonra CD45 negatif CD31 pozitif hücreleri CD16/32 ve podoplanin ekspresyonuna göre cd45 negatif CD31 pozitif, CD16/32 negatif podoplanin pozitif lenfatik endotel ve CD45 negatif CD31 pozitif, CD16/32 pozitif podoplanin negatif karaciğer sinüzoidal endotelhücre popülasyonlarının tanımlanmasına olanak sağlar. Emfaletik endotel hücreleri lenfatik damar ve endotel hyaluronan bir ifade, ama CD146 değil.
Karaciğer izole CD31 pozitif CD16/32 pozitif hücreler gösterildiği gibi izole de CD146 pozitif ve podoplanin pozitif, CD31 pozitif CD16/32 negatif hücreler öncelikle CD146 negatif ve ya podoplanin pozitif veya negatif iken. Pozitivite floresan-1 boyama dayalı olarak belirlendi. Karaciğer lenfatik endotel hücreleri CD146 negatif ve PDPN pozitiftir.
Ne vasküler endotel ne de murin karaciğer makrofajları podoplanin ifade. Podoplanin boyama da lenfatik damarlardan safra kanallarının farklı nükleer yapıları yanı sıra sitokeratin 7 boyama dayalı kolanjiyositayırt etmek için kullanılabilir. Sadece lenfatik endotel hücreleri co-ifade vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 3 ve Prospero homeobox protein 1 karaciğerde olarak, bu belirteçleri daha da sıralanmış karaciğer lenfatik endotel hücre nüfusunun saflığını doğrulamak için kullanılabilir.
Bu yordamı çalışırken, hızlı bir şekilde çalışmak ve buz üzerinde hücreleri tutmak hatırlamak önemlidir. Bu yordamı takiben, LEC popülasyonlarının akış sıralanması gibi diğer yöntemler, LEC'lerin transkripsiyonel profillemesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, gelişiminden sonra, lenfatiklerin farelerde ve insanlarda karaciğer hastalığını nasıl etkilediğini araştırmak için karaciğere özgü lenfatik biyoloji alanında araştırmacıların önünü açmıştır.
Lenfatik endotel hücreleri karaciğerde seyrek, kademeli bir popülasyon olduğu için genellikle bu yönteme yeni giren bireyler mücadele edecektir ve yöntemin hızlı bir şekilde yapılması gerekmektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, belirli belirteçler kullanarak karaciğerdeki lenfatik endotel hücre popülasyonlarını tanımlamayı amaçlamaktadır. Yöntem, farklı lenfatik endotel hücrelerini izole etmek için kollajenaz IV ve DNaz uygulamasını akış sitometrisi ile birleştirir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Lenfatik Biyoloji
Arka Plan
- Lenfatik endotelyal hücreler (LEH'ler), çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik bir rol oynar.
- LEH'lerin uyarılara verdiği yanıtların anlaşılması, hastalık mekanizmalarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Bu yöntem, LEH fenotipinin ve fonksiyonunun tek hücre düzeyinde değerlendirilmesine olanak tanır.
- Yöntem; deri ve meme bezleri dahil olmak üzere farklı dokulardan elde edilen LEH'lerle kullanıma uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Karaciğer lenfatik endotel hücrelerinin spesifik stimülasyonlara verdiği yanıtların davranışlarını incelemek.
- Lenfatik biyoloji ile ilişkili hastalık patogenezinin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
- Hücre ayıklama sonrası alt uygulamaların gerçekleştirilmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İzole edilmiş karaciğer hücrelerinden tek hücre süspansiyonunun hazırlanması.
- Doku sindirimi için kollajenaz IV ve DNaz kullanımı.
- Hücre tanımlama ve ayıklama için akış sitometrisi.
- Fare modellerinden doku toplama için diseksiyon teknikleri.
Ana Sonuçlar
- Farklı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Karaciğer LEC'lerinin fenotipi ve fonksiyonuna dair temel bilgiler.
- Çeşitli dokulardan elde edilen LEC'lerin incelenmesinde potansiyel uygulamalar.
- Prosedürün eğitimli bir profesyonel tarafından gösterimi.
Sonuçlar
- Bu yöntem, lenfatik endotel hücrelerinin incelenmesi için değerli bir araç sunmaktadır.
- Karaciğer lenfatik biyolojisinin ve bunun sağlık ve hastalıklar üzerindeki etkilerinin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu tekniği lenfatik çalışmalarda daha geniş uygulamalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, fare karaciğerindeki lenfatik endotel hücrelerinin (LEC'ler) tek hücre çözünürlüğünde analizini sağlayarak, karaciğere özgü lenfatik biyolojiyi inceleyen araçlardaki kritik bir eksikliği gidermektedir. Nadir LEC popülasyonlarını izole etmek ve fenotiplendirmek içinle tekrarlanabilir bir yöntem sunarak; karaciğer inflamasyonu, immün hücre trafiği ve fibrozis ile ilgili hedef doğrulama çalışmalarında mekanistik risk azaltma süreçlerini desteklemektedir. Bu yaklaşım, hastalıkla ilişkili bir sistemde LEC'lerin stimülilere verdiği yanıtların doğrudan değerlendirilmesine olanak tanıyarak, preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Karaciğer patofizyolojisindeki biyolojik mekanizmaları aydınlatmak için lenfatik endotel hücre fenotipinin ve fonksiyonunun hücre bazında incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Sonraki fonksiyonel analizlar için karaciğer dokusundan canlı LEC'lerin izole edilmesine yönelik standartlaştırılmış bir sindirim ve boyama iş akışı sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Deney standardizasyonu ve tekrarlanabilirliğini desteklemek için LEC markörlerinin (örneğin, podoplanin, CD31, CD45, VEGFR3, Prox1) nicelleştirilebilir, tek hücreli okumalarını oluşturur.
- Operasyonel Değer: Lenfatik endotel hücre aktivitesini veya karaciğere özgü yolakları modüle eden bileşiklerin yüksek kapasiteli taraması için uygun, valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Karaciğer LEC'lerinin izolasyonuna olanak tanıyarak, bu hücrelerin inflamasyon, bağışıklık gözetimi ve fibrozis ilerlemesindeki rollerinin incelenmesi yoluyla hastalıkla ilgili sistem modellemesini destekler.
- Operasyonel Değer: Birden fazla deneysel koşulda LEC zenginleştirme için yeniden kullanılabilir bir yöntem sunarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel sürekliliği kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle karaciğer lenfatik biyolojisi, immün modülasyon veya stromayı hedefleyen tedavilere odaklanan projeler için, hedef hipotez testinden ön ilaç (lead) tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Deneysel uyarılara yanıt olarak karaciğer LEC'lerinin fenotipik analizine olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: 96 kuyucuklu formatlarda güvenilir bileşik değerlendirmesi için tanımlanmış endotelyal ve lenfatik belirteçlere sahip, analize hazır hücre süspansiyonları sağlar.
- Analitik: Farklı koşullar arasında LEC frekansını, aktivasyon durumunu ve fonksiyonel belirteçlerin ko-ekspresyonunu karşılaştırmak için kantitatif akış sitometrisi okumalarına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Transkripsiyonel profilleme veya fonksiyonel analizler gibi ileri uygulamalar için LEC izolasyonuna izin vererek keşif bulgularını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kaynak verimliliğini maksimize ederek lenfatik endotelyal hücrelerin sadece karaciğerde değil, aynı zamanda deri ve meme bezi gibi diğer dokularda da incelenmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Karaciğer hastalığı süreçlerinde lenfatik endotelyal hücre katılımıyla ilgili mekanistik belirsizlikleri azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanı ayırımı ve çok parametreli akış sitometrisi kapılaması aracılığıyla LEC izolasyonunun tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Karaciğer patofizyolojisindeki lenfatik aracılı mekanizmalara dair erken ve insanla ilgili biyolojik içgörüler sağlayarak, devam/durdur kararlarının verilmesini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: LEC popülasyonlarının doğrudan fenotipik değerlendirmesi yoluyla, karaciğer lenfatik fonksiyonunu modüle eden hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Fare doku diseksiyonu, enzimatik sindirim ve uygun kompanzasyon kontrolleri ile çok renkli akış sitometrisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Akış sitometrelerine, santrifüj ekipmanına ve kollajenaz IV, DNase 1, iodixanol ile CD31, CD45, podoplanin, CD16/32, VEGFR3 ve Prox1 için antikor panellerini içeren reaktiflere erişime bağlıdır.
- Laboratuvarlar ve deneysel gruplar arasında tutarlılığı sağlamak için kapılama (gating) stratejilerinin ve antikor titrasyonunun ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer dokulara (örneğin deri, meme bezi) adaptasyon; doku yoğunluğu ve hücreselliğe bağlı olarak sindirim sürelerinin ve süzme adımlarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, karaciğer lenfatik endotel hücrelerinin düşük frekansı ve hassasiyeti yer almakta olup, canlılığı ve marka bütünlüğünü korumak için hızlı işlem ve soğuk zincirleme uygulama zorunluluğu bulunmaktadır.
