Name: Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin, fare karaciğerinden lenfatik endotel hücrelerini akış sitometrisiyle izole etme ve analiz etme yöntemini. Bu teknik, tek hücre düzeyinde fenotip ve fonksiyon değerlendirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar GI ve karaciğer doğuştan gelen bağışıklık programları bu projenin parasal destek için teşekkür etmek istiyorum. B.A.J.T. da R01 AI121209 tarafından finanse edilmektedir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlık malzemeleri
<ol><li>DNaz, 5 mg/mL solüsyon yapmak ı fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).</li>
	<li>Tıklayın'ın EHAA medya için 5000 U/mL collagenase IV ekleyerek bir sindirim karışımı olun.</li>
	<li>Sindirim karışımı kullanmadan 30 dk önce için 37 ° C'de ısıtın.</li>
	<li>Bir yalıtım arabellek % 4.8 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyerek getirin.</li>
	<li>100 mM amonyum klorür, 10 mM KHCO3ve 0,1 mM EDTA H2O. distile ekleyerek bir kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tampon yapmak</li>
</ol>2. bir tek hücre süspansiyon bir fare karaciğer üzerinden hazırlanması
<ol><li>Fare ile CO2 ve servikal çıkığı ötenazi.</li>
	<li>Fare kürk ıslak için % 70 etanol ile aşağı sprey. Fare pin bir diseksiyon tahta metreye.</li>
	<li>Yaklaşık 1 cm yukarıda sadece deri (yaklaşık 1 mm) yoluyla kesmek dikkatli olmak anüs, deriyi kesme diseksiyon makası kullanarak. Deri vücuttan dişli forseps ile çekin ve cilt ve karın zarını arasındaki makas ekleyin. Cilt periton ayırmak ve sonra belgili tanımlık kesme cilde boyun kesim için makas açın.</li>
	<li>PIN diseksiyon kurulu her kol altında ve her bacak üstü bir PIN kullanarak cilde. Periton sac yukarı çekin ve yukarı doğru boyun kesti. Karaciğer lobları kapmak ve göğüs kemiği altında sadece kesti. Not: herhangi bir karaciğer immünhistokimya (IHC) için kullanılacaksa, özen gösterilmelidir.</li>
	<li>Karaciğer kesmek ve fare karaciğer çıkarın ve 4 mL tıklayın'ın EHAA medya yerleştirin.</li>
	<li>Bir neşter kullanarak, karaciğer ~ 1 mm çap parçalar kesin.</li>
	<li>500 µL sindirim karışımı ekleyip DNaz 500 µL karaciğere ben (2 mg/mL).</li>
	<li>Karaciğer 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 15 dakika sonra 5 mL pipet kullanarak sıvı karışımı.</li>
	<li>Kuluçka 30 dk sonra sindirilir örnek 50 mL konik tüp 100 µm süzgeç aracılığıyla aktarın.</li>
	<li>Yavaşça kalan parçaları 1-mL şırınga pistonu ile filtre aracılığıyla itin.</li>
	<li>Yalıtım arabelleği 5 mL filtresiyle yıkama ve yavaşça doku bir dalgıç arkası ile süzgeç aracılığıyla 1 mL şırınga itin. Filtre yalıtım arabellek 25 mL ile yıkanmış alıncaya kadar bunu yineleyin.</li>
	<li>5 dk. dikkatle Aspire için süpernatant 400 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pelet RBC lizis arabellek 4 mL ile resuspend. Hücreleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Yalıtım tampon ve 5 min için 400 x g , santrifüj 10 mL hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Tam karaciğer sayısını belirlemek için bir hemasitometre üzerinde hücreleri saymak.</li>
	<li>5 mL % 20 iodixanol de hücrelerde resuspend ve onları PBS 1 mL ile katman.</li>
	<li>Hücreleri vasıl 300 x g bir fren olmadan 15 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>PBS ve iodixanol arasında kat kaldırmak ve, 100 µm filtreden bir yeni 50 mL konik tüp içine koyun.</li>
	<li>Yalıtım tampon ve 5 min için 400 x g , santrifüj 10 mL hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Süpernatant atın ve PBS 500 µL % 2 fetal Sığır serum (FBS) ile hücrelerde resuspend.</li>
</ol>3. akış sitometrik analizinde tek karaciğer hücrelerinden
<ol><li>Bir hemasitometre ve hücrelerin ölçmek için trypan mavi dışlama kullanarak mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Trypan mavi 10 µL için hücre 10 µL ekleyin ve hemen onları bir hemasitometre üzerinde yer ve mikroskop altında canlı hücreleri (mavi değil) saymak. Sonra microliter başına hücre sayısını hesaplayın.</li>
	<li>Aliquot yaklaşık 5 milyon 96-şey plaka tek bir kuyuya kalan nonparenchymal hücrelerinin.</li>
	<li>Senaryo Özeti 400 x g 5 min için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atmak ve PBS 90 µL % 2 ile hücrelerde resuspend FBS.</li>
	<li>Anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) ve PDPN (1: 200) 10 2.4G2 veya anti-CD16/32 (1: 200) x 10 µL içinde seyreltilmiş ekleyin. Not: Anti-CD16/32-etiketli antikor kullanıldığında herhangi bir Fc engelleme (2.4G2) kullanılmıştır.</li>
	<li>Pozitif ve negatif kapıları nerede ayarlanması gerekir belirlemek için bir (FMO) leke her renk ve bir izotip kontrol antikor için eksi bir floresan içerir.</li>
	<li>Canlı ve ölü hücreleri belirlemek için bir canlılık işaretleyici (örneğin, hayalet kırmızı 780) ile leke. 30 dk için 4 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>PBS 100 µL % 2 ile hücrelerle yıkama FBS.</li>
	<li>Küçük bir aliquot hücre lazer ve tazminat akış sitometresi ayarları için kullanın. Her bireysel fluorophore ve herhangi bir antikor olmadan tek bir antikor hücrelerle leke. Not: Kullanılan akış sitometresi bağlı olarak bir tazminat matris spektral örtüşme kaldırmak için kurulmalıdır.</li>
	<li>Örnek tüp sitometresi prob üzerine yerleştirin ve toplamak ve tüm olayları kaydedin.</li>
</ol>4. veri analizi
<ol><li>Yan-dağılım alanı vs ileri-dağılım alanı arıyorsunuz, "canlı" hücreleri üzerine boyutu ve parçalı yapı ve canlılığı marker boya alarak kapıya.</li>
	<li>Ardından, CD45 parlak mor 510 ve CD31 PerCp Cy5.5, pozitif ve negatif örneğin alınma olasılığını belirlemek için izotip kontrol eder ve FMO kullanarak CD45 - CD31 + hücre kapısı kullanarak.</li>
	<li>Son olarak, CD146 v450 veya CD16/32 FITC ve PDPN APC kullanarak, CD146 - PDPN + veya CD16/32 Al-izotip kontrol eder ve FMO, pozitif ve negatif örneğin alınma olasılığını belirlemek için kullanarak yeniden PDPN + hücreler,. Bu LECs hücrelerdir.</li>
</ol>

<ol><li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li>
<li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740(2014).</li>
<li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771(2015).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
<li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li>
<li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+antigen+scavenging%2C+cross-presentation%2C+and+CD8%2B+T+cell+priming%3A+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li>
<li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li>
<li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li>
<li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li>
<li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lymphatic+vessels%2C+not+blood+vessels%2C+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li>
<li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034(2017).</li>
<li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma%3A+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li>
<li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989(2014).</li>
<li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+marker+podoplanin%2FD2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).</li>
<li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li>
<li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospero-related+homeobox+1+%28Prox1%29+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development%2C+injury+and+regeneration%2C+and+is+absent+from+%22oval+cells%22%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li>
<li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li>
<li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li>
<li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li>
<li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphatic+System%3A+Integral+Roles+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li>
<li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphatic+system+in+body+homeostasis%3A+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphatic+Research+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

LECs genel önem bağışıklık homeostazı ve düzenleme son zamanlarda hafif25için geldi. Yayımlanmış lenfatik edebiyatının çok fazla deri ve lenf düğümlerinde odaklanmaktadır; Ancak, Lenfleribile vücut26 bulunur ve bu nedenle anlayışımız farklı organlarda önem sırasında gereklidir. İşte hücre hücre olarak aynı anda onların ifade farklı yüzey işaretleyicileri, sitokinler, kemokinler ve transkripsiyon faktörleri gibi hücre içi proteinler daha iyi anlamak için bir yöntem içinde LE...

Lenf damarları ve LECs rolünü karaciğerde de anlaşılmış değildir. Olsa da lenf damarları karaciğer1 portal üçlü içinde bulunur ve hastalık2sırasında genişletin, çok az işlev ve LECs fenotip içinde karaciğer ile ilgili anlaşılmaktadır. Üzerinde öncelikle3LECs bulunur işaretleri keşfi ile bu hücrelerin farklı doku nişler homeostazı ve hastalık içinde önemini anlayışımızın önemli bir boşluğu dolduracaktır. LECs doğrudan T hücreleri4,5,6,7,8ile, etkileşerek periferik tolerans lenf nodu ve metastatik tümörler korumada önemli bir rol var 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs lenf düğümünde koruyucu bağışıklığı göçmen dendritik hücreler14,15,16ile onların etkileşim yoluyla teşvik. Bu nedenle, doku ve etkileşimleri mevcut oldukları için belirli olabilir LECs için birden çok rol vardır. Ancak, çok az doku bağışıklık hücreleri nasıl LECs etkileşim veya nasıl farklı organ sistemlerinde LECs çalışması hakkında anlaşılmaktadır; Böylece, LECs karaciğer veya diğer organlara içinde hücre başına bazında değerlendirilmesi nasıl LECs doku özgü bağışıklık programı gelişmeler yol açabilir. Karaciğerde LECs üzerinde duruluyor edebiyat çoğunu LECs bir ya da iki işaretleri ve morfoloji17kullanarak görselleştirmek için mikroskobu kullanırken, çok az özellikle LECs akış sitometresi, yine de bir çalışmada kullanılarak hücre hücre için ayrı ayrı değerlendirmek için yapılmıştır karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri (LSECs) ve LECs18arasındaki farklılıkları değerlendirmek. LEC nüfus karaciğerde akış sitometresi tarafından analiz edememek LEC fenotip derinlemesine çalışma için normal homeostazı veya hastalık sırasında sağlar.
LECs tarafından akış sitometresi değerlendirmek için birden fazla yüzey işaretleyicileri ihtiyaç vardır. Genellikle, LECs ifade prospero ile ilgili homeobox 1 (Prox-1), lenf damarı endotel hyaluronan reseptör 1 (LYVE1) veya vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör 3 (VEGFR3) mikroskopi kullanarak tarafından görüntülenmiştir. Ancak, karaciğerde, bu işaretleri ifade LECs için sınırlı değildir. Prox-1 yaygın tarafından hepatosit karaciğer geliştirme, yenilenme ve yaralanma19sırasında ifade edilir ve LYVE1 ve VEGFR3 karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri18tarafından ifade edilir. Lenf düğümünde, LECs akış sitometresi farklılaşma (CD) kümeleri kullanılarak tanımlanır CD45-, CD31 + ve podoplanin + (PDPN)16. Ancak, bu yaklaşım LECs karaciğerde CD45 - CD31 + hücreler endotel hücreleri ele geçirecek, ve vasküler endotel hücreleri karaciğer baskın nüfusu LSECs yana yalıtmak için de en az düzeydedir. Böylece, diğer işaretleri bol LSEC nüfus nadir LEC popülasyondan ayırt etmek için ihtiyaç vardır. CD16/32 (olgun LSECs18tarafından ifade edilir) ve CD146 (içinde karaciğer sinusoids karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri20 az lenfatik tarafından herhangi bir ifade ile ifade edilen ağırlıklı olan bir ortak vasküler endotel hücre işaretçisi endotel hücreleri21) aday işaretleri vardı.
Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş izole edip yukarıdaki işaretleri, CD45, CD31, CD146, CD16/32 PDPN akış sitometresi için kullanma ve karaciğerde LECs görüntülenmesi için bir yöntem. Biz collagenase IV kullanımı, DNaz 1 ve karaciğer dokusu sindirim içine bir tek hücre süspansiyon için mekanik ayırma açıklar. Biz de iodixanol yoğunluk gradient yalıtım parenkima hücre (NPC) ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak için nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, birden çok işaretçileri kullanarak, LECs ile PDPN baskın marker olarak karaciğer tanımlamak için en uygun akış sitometresi gating strateji belirleriz.

<table><tbody><tr><td>Tıklamalar / EHAA ortamı</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Worthington Biyokimya şirketi</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biyokimya şirketi</td><td>LS002145</td><td>Deoksiribonükleaz 1</td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>Yoğunluk Gradyan Ortamı</td></tr><tr><td>V450 anti fare CD146 (klon ME-9F1)</td> <td>BD biyolojik bilimler</td><td>562232</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti fare CD146 (klon ME-9F1)</td><td>Biolegend</td><td>134706</td><td>Floresein izotiyosiyanat (FITC)</td></tr><tr><td>Pasifik Mavisi anti fare CD31(klon 390)</td><td>Biolegend</td><td>102422</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 anti fare CD31(klon 390)</td><td>Biolegend</td><td>102420</td><td>Peridinin-klorofil proteinleri-Siyanin 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr><tr><td>APC anti fare PDPN (klon 8.1.1)</td><td>Biolegend</td><td>127410</td><td>Allofikosiyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti fare CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti fare CD45 (klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti fare CD16/32 (klon 93)</td><td>Biolegend</td><td>101306</td><td>Floresein izotiyosiyanat (FITC)</td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 anti fare CD16/32(klon 93)</td><td>Biolegend</td><td>101324</td><td>Peridinin-klorofil proteinleri-Siyanin 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr><tr><td>hayalet kırmızısı 780 canlılık boyası</td><td>TONBO biosceinces</td><td>3-0865-T100</td><td></td></tr><tr><td>APC suriye hamsterı IgG (klon SHG-1)</td><td>Biolegened</td><td>402102</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 sıçan IgG2a (klon RTK2758)</td><td>Biolegend</td><td>400531</td><td></td></tr><tr><td>FITC sıçan IgG2 (klon eBR2a)</td><td>ebioscience</td><td>1-4321-80</td><td></td></tr><tr><td>Anti fare LYVE1 (klon 223322)</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>FAB2125A</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare Sitokeratin (klon EPR17078)</td> <td>abcam</td><td>ab181598</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare F4 / 80 (klon Cl: A3-1)</td> <td>Bio-rad</td><td>MCA497</td><td></td></tr><tr><td>BSA (fraksiyon V)</td> <td>Fischer</td><td>BP1600-100</td><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td></tr> <tr><td>Keçi serumu</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>E177</td><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) -RBC lizis tamponu için</td></tr><tr><td>Amonyum Klorür</td><td>Fischer</td><td>A687-500</td><td>RBC Lizis tamponu için</td></tr><tr><td>Potasyum Bikarbonat</td><td>Fischer</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Tüyü</td><td>2975 # 21</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu; m hücre süzgeci</td><td>Fischer</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2</td><td>evde/ATCC</td><td>ATCC HB-197</td><td>FC bloğu, Fc gama + hücrelerine spesifik olmayan bağlanmayı inhibe etmek için -hibridomdan yapılmıştır</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik</td><td>Truline</td><td>TR2004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipet ucu</td><td>ABD bilimsel</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; L pipet ucu</td><td>ABD bilimsel</td><td>1110-1700</td><td></td></tr><tr><td>10 & L pipet ucu</td><td>ABD bilimsel</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>seriolojik 10 mL pipet</td><td>greiner bio-one</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>seriolojik 5 mL pipet</td><td>greiner bio-one</td><td>606107</td><td></td></tr><tr><td>Hücre inkübatörü</td><td>Fischer</td><td></td><td>Heracell 160i</td></tr><tr><td>BD FacsCanto II akış sitometresi</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klinik Santrifüj</td><td>Beckman </td><td></td> sürgü <td>modeli X-14R</td></tr></tbody></table>

lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Karaciğer içinde lenf damarları portal Triad'ın içinde bulunan ve açıklanan işlevlerine interstisyel sıvı karaciğer lenf düğümlerine nerede hücresel artıkları ve antijenleri ankete kaldırmaktır. Nasıl lenfatik damarlara inflamasyon ve bağışıklık hücre fonksiyon içinde karaciğer dahil anlamakta çok ilgileniyoruz. Ancak, çok az sindirim karaciğer veya karaciğer değerlendirmek için kullanılan belirli işaretleri lenfatik endotel hücrelerinin (LECs) yalıtım için protokollerin oluşturulması yayımlanmış LECs hücre başına temelinde. Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş sindirim ve karaciğer karaciğer LEC nüfus değerlendirmek için boyama için bir yöntem. Biz burada özetlenen yöntemi kimlik ve karaciğer LECs, izolasyon için yararlı olacak ve bizim anlayış nasıl yanıt LECs karaciğer microenvironment güçlendirecek eminiz.

Karaciğer Lenfleribile analiz çalışmaları öncelikle immünhistokimya frekans ve lenf damarları karaciğer çapını quantitate için kullanmış. Ancak, bu yöntem LECs değerlendirme hücre hücre olarak veya ifade birden çok işaretçileri, sitokinler, kemokinler veya transkripsiyon faktörleri için izin vermez. Bu nedenle, biz sordu olup olmadığını karaciğer LECs karaciğer izole olabilir ve akış sitometresi kullanılarak hesaplandı. Önceki çalışma lenf nodu LECs izole Liberase DL (collagenase ı-II-ve-...

Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Bu yöntem lenfatik ve karaciğer alanlarında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, lenfatik endotel hücreleri gibi, veya LECs, belirli uyaranlara yanıt ve nasıl hastalık patogenezi katkıda bulunur. Bu tekniğin en büyük avantajı, karaciğer lenfatik endotel hücre fenotipve fonksiyonunu hücre bazında değerlendirebiliyor olmamız ve hücre ayrıştırma sonrası aşağı akım uygulamaları için kullanılabilmemizdir. Bu yöntem karaciğer lenfatik biyoloji içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda farklı dokulardan lenfatik endotel hücrelerini değerlendirmek için kullanılabilir, deri ve meme bezi gibi.Prosedürü gösteren Jeffrey Finlon, laboratuvarımdan profesyonel araştırma görevlisi olacak. İzole karaciğer hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için, yetmiş yüzde etanol ile fare aşağı püskürtme ile başlar, ve bir diseksiyon panosuna pençeleri güvence altına. Anüs üzerinde yaklaşık bir santimetre deri kesmek için diseksiyon makas kullanın ve vücuttan uzak deri kaldırmak için dişli forseps kullanın.Deri ve periton arasına makas uçları yerleştirin ve boynuna kadar deri kesi devam etmeden önce dokuları ayırmak için makas açın. Her forelimb altında ve her arka bacak üzerinde diseksiyonu tahtaya cilt güvenli ve boynuna doğru kesi uzatmak için yukarı periton çuval çekin. Karaciğer lobları kavramak ve karaciğer etrafında diseksiyon sağlamak için göğüs hemen altında kesti.Sonra Click's EHAA orta dört mililitre içine organ aktarın. Yaklaşık bir milimetre çapında parçalar halinde karaciğer kesmek ve taze hazırlanmış sindirim çözeltisi ve DNase 1 beş yüz mikrolitre beş yüz mikrolitre parçaları sindirmek için neşter kullanın. Otuz yedi santigrat derece on beş dakika sonra, iyice dokuları karıştırmak ve başka bir on beş dakika için kuvöz konteyner dönmek için beş yüz mililitrelik pipet kullanın.Kuluçka sonunda, sindirilmiş örneği yüz mikron süzgeçten elli mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve bir mililitrelik şırıngadan gelen pistonu kullanarak kalan doku parçalarını kafesten hafifçe bastırın. Filtreyi beş mililitre izolasyon tamponuyla yıkayın ve kalan dokuları süzgeçten hafifçe bastırın. Santrifüj ile izole karaciğer hücrelerini toplamak ve kırmızı kan hücresi lisis tampon dört mililitre pelet yeniden askıya alın.Oda sıcaklığında beş dakika sonra, izolasyon tampon on mililitre hücreleri yıkayın ve tam karaciğer sayısını belirlemek için hemositometre hücreleri saymak. Peleti yüzde yirmi iyodixanol'ün beş mililitresinde yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu bir mililitre PBS ile kaplama. Yoğunluk gradyan ayırma ile hücreleri ayırın ve PBS ve iodixanol arasındaki katmanı hasat.Sonra hücreleri yüz mikrometresüzsüzden yeni bir elli mililitrelik konik tüpe süzün. Hücreleri on mililitre taze izolasyon tamponuyla yıkayın ve elde edilen peleti %2'lik fetal büyükbaş serum veya FBS ile tamamlanan 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Sayma sonra, aliquot yaklaşık beş kez on altıncı non-parakimal hücreler her kontrol ve santrifüj için doksan altı iyi plaka deneysel kuyu içine ve pbs artı FBS doksan mikrolitre de pelet askıya iyi.Her kuyuya uygun deneysel ve kontrol birincil antikor kokteylleri ekleyin ve uygun bir canlılık belirteci ile tüm kuyuları lekeleyin. Bu işlemdeki en önemli adım antikorların doğru titrasyonu ve lekelenmeyi doğrulamak için buz tipi kontrollerin ve floresan-1 kontrollerinin kullanılmasıdır. Dört santigrat derece de otuz dakika sonra, santrifüj iyi başına PBS artı FBS yüz mikrolitre ile hücreleri yıkayın ve her kuyudan tek tek beş mililitre yuvarlak alt akış sitometri tüpleri içine hücreleri transfer PBS artı tüp başına FBS dört yüz mikrolitre son hacmine.Ardından, akış sitometresindeki lazer ve kompanse ayarlarını ayarlamak ve her tüp için tüm olayları okumak için küçük bir hücre hacmi kullanın. Tüm tüpler okunduğunda, verileri uygun bir akış sitometrisi analiz programına aktarın. Negatif ifadenin canlı olarak kabul edildiği canlı lık işaretçisi boyasını temel alan canlı hücrelerüzerindeki kapı.Hücrelerin büyüklüğü ve tanecikliliğinin yanı sıra canlılık belirteç boya ekspresyonuna göre canlı hücrelere geçit, olumlu ve negatif popülasyonları belirlemek için uygun izotip kontrolü ve floresan-1 verilerini kullanarak CD45 negatif CD31 pozitif hücre popülasyonuna gating takip edin. Daha sonra CD45 negatif CD31 pozitif hücreleri CD16/32 ve podoplanin ekspresyonuna göre cd45 negatif CD31 pozitif, CD16/32 negatif podoplanin pozitif lenfatik endotel ve CD45 negatif CD31 pozitif, CD16/32 pozitif podoplanin negatif karaciğer sinüzoidal endotelhücre popülasyonlarının tanımlanmasına olanak sağlar. Emfaletik endotel hücreleri lenfatik damar ve endotel hyaluronan bir ifade, ama CD146 değil.Karaciğer izole CD31 pozitif CD16/32 pozitif hücreler gösterildiği gibi izole de CD146 pozitif ve podoplanin pozitif, CD31 pozitif CD16/32 negatif hücreler öncelikle CD146 negatif ve ya podoplanin pozitif veya negatif iken. Pozitivite floresan-1 boyama dayalı olarak belirlendi. Karaciğer lenfatik endotel hücreleri CD146 negatif ve PDPN pozitiftir.Ne vasküler endotel ne de murin karaciğer makrofajları podoplanin ifade. Podoplanin boyama da lenfatik damarlardan safra kanallarının farklı nükleer yapıları yanı sıra sitokeratin 7 boyama dayalı kolanjiyositayırt etmek için kullanılabilir. Sadece lenfatik endotel hücreleri co-ifade vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 3 ve Prospero homeobox protein 1 karaciğerde olarak, bu belirteçleri daha da sıralanmış karaciğer lenfatik endotel hücre nüfusunun saflığını doğrulamak için kullanılabilir.Bu yordamı çalışırken, hızlı bir şekilde çalışmak ve buz üzerinde hücreleri tutmak hatırlamak önemlidir. Bu yordamı takiben, LEC popülasyonlarının akış sıralanması gibi diğer yöntemler, LEC'lerin transkripsiyonel profillemesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, gelişiminden sonra, lenfatiklerin farelerde ve insanlarda karaciğer hastalığını nasıl etkilediğini araştırmak için karaciğere özgü lenfatik biyoloji alanında araştırmacıların önünü açmıştır.Lenfatik endotel hücreleri karaciğerde seyrek, kademeli bir popülasyon olduğu için genellikle bu yönteme yeni giren bireyler mücadele edecektir ve yöntemin hızlı bir şekilde yapılması gerekmektedir.

digestion-murine-liver-for-flow-cytometric-analysis-lymphatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Alkolsüz steatohepatiti için basit ve güvenilir bir diyet kaynaklı kemirgen hayvan modeli (NASH) tarif edilir, hayvanlar ve özel bir yüksek yağ diyet uygulanması SPF olmayan konut aracılığıyla elde. Biz karaciğer ve adipoz immün hücre alt kümeleri tanımlamak için insan immünolojik koşulları farları çevresel mikroplar maruz tarafından yeniden tanımlamakta.

Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli

Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu protokol, farelerde intraduodenal besin infüzyonlarına yanıt olarak akan bağırsak lenfini izole etmek için ayrıntılı bir cerrahi protokolü tanımlamaktadır. Bu, çeşitli deneysel besinlere yanıt olarak toplam bağırsak lipit emiliminin ve şilomikron sentezinin ve sekresyonunun fizyolojik olarak belirlenmesini sağlar.

Diyet Lipid Emiliminin ve Şilomikron Sekresyonunun İn Vivo Kinetiğini Ölçmek için Farelerde Akan Mezenterik Lenflerin İzolasyonu

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin, fare karaciğerinden lenfatik endotel hücrelerini akış sitometrisiyle izole etme ve analiz etme yöntemini. Bu teknik, tek hücre düzeyinde fenotip ve fonksiyon değerlendirmesi sağlar.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Daha fazla video keşfet