Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, daha sonra akış sitometrik analizi veya alternatif bir karakterizasyon aracı için kullanılabilen farklı ince bağırsak bölmelerinden tek hücre popülasyonlarını izole etmektir. Bu yöntem, mikrobiyotanın bağırsak bağışıklık sisteminin gelişimini nasıl etkilediği gibi mukozal immünolojideki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, hızlı olmaları, tekrarlanabilir olmaları ve zahmetli percoll gradyanları gerektirmemeleridir.

Bu işleme başlamak için, farenin sırt tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve karın bölgesine yüzde 70 etanol püskürtün, cildi ve ardından ventral orta hat boyunca kasık simfizinden ksifoid sürecine kadar periton fasyasını sırayla keserek bir laparotomi yapın, böylece periton boşluğunu açığa çıkarın. Daha sonra, pilor sfinkterini keserek ince bağırsağı mideden ayırın. İnce bağırsağı peritondan nazikçe çıkarın ve mezenterik yağı uzaklaştırın.

İnce bağırsağı tamamen çıkarmak için, ileoçekal kavşakta ikinci bir kesi yapın. İzole edilmiş ince bağırsağı, hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için yüzde 10 FBS içeren dört santigrat derece RPMI ortamına yerleştirin. Kavisli forseps kullanarak büyük yağ parçalarını nazikçe çıkarın ve işlem sırasında bağırsak dokusunun yırtılmasını önlemek için dikkatli olun.

Bağırsak içeriğini çıkarmak için, ince bağırsağın proksimal ucunu bir şırıngaya tutturulmuş 18 gauge bir besleme iğnesi ile kanüle edin ve bağırsağı 15 ila 20 mililitre soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. İnce bağırsağın antimesenterik tarafında bulunan ve çok loblu beyaz bir kitle olarak görünen Peyer Yamalarını çıkarmak için makas kullanın. Ardından, bunları yüzde beş FBS içeren soğuk RPMI ortamına yerleştirin.

Daha sonra, ince bağırsağı üç ila dört inçlik segmentlere kesin, her bir ince bağırsak segmentini RPMI ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerinde yuvarlayarak kalan yağı çıkarın ve yağı dokudan uzaklaştırmak için donuk bir neşter kullanın. Mezenterik yağın tamamen uzaklaştırılmasına çok dikkat etmek, lenfositlerin canlılığını sağlamak için kritik öneme sahiptir, çünkü çok küçük yağ parçaları bile hücrelerin ölmesine neden olabilir. Bundan sonra, bağırsak segmentlerini kavisli forsepslerle kanüle ederek ve dokunun distal ucunu kavrayarak dokuyu ters çevirin, ardından doku segmentini proksimal uçtan nazikçe çıkarmak için bir çift düz forseps kullanın, bu da dokunun ters çevrilmesine neden olur.

Doku segmentlerini 30 mililitre ekstraksiyon ortamı ve bir karıştırma çubuğu içeren bir kaba yerleştirin. Kapağı kapağa sabitleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika karıştırın. Karıştırma kuvvetli olmalı, ancak türbülanslı olmamalıdır.

15 dakika sonra, doku parçalarını bulanık görünmesi gereken süpernatan içeren epitelden ayırmak için çelik bir süzgeç kullanın. Artık ekstraksiyon ortamını yıkamak için doku parçalarını RPMI ortamında manuel olarak çalkalayın. Ardından, dokuyu kuru bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve ekstraksiyon ortamı tarafından serbest bırakılmayan artık mukozanın çıkarılmasını kolaylaştırmak için birkaç kez çevirin.

Daha sonra, doku parçalarını 600 mikrolitre sindirim ortamı ile bir nokta beş mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Parçalar artık makasa yapışmayana ve çözelti homojen görünene kadar dokuyu kıyın. Bu adım, dokunun tam enzimatik sindirimini sağlamak için kritik öneme sahiptir.

Parçalar artık makasa yapışmayana ve çözelti homojen görünene kadar dokuyu kıymak, hücresel verimi sağlamanın yanı sıra sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Kıyılmış ince bağırsağı 25 mililitre sindirim ortamı içeren bir bardağa ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika karıştırın. Sindirimin yarısında, büyük doku parçalarını parçalamaya yardımcı olmak için serolojik bir pipetle yukarı ve aşağı sıkın.

Daha sonra, sindirim dokusunu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 15 mililitrelik bir tüpe süzün. Süzgeci yüzde 10 FBS içeren 20 mililitre RPMI ortamı ile durulayın. Daha sonra, filtrelenmiş çözeltiyi dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve peleti yüzde 10 FBS içeren bir mililitre RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 15 mililitrelik bir tüpe süzün. Süzgeci yüzde 10 FBS içeren 20 mililitre RPMI ile durulayın.

Daha sonra, filtrelenmiş çözeltiyi dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve peleti yüzde iki FBS içeren bir mililitre RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Bu prosedürde, eksize edilmiş Peyer Yamalarını 25 mililitre sindirim ortamı ve bir karıştırma çubuğu içeren bir bardağa aktarın.

Kapağı sabitleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika döndürün. Daha sonra, sindirilmiş Peyer's Patches'i 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 15 mililitrelik bir tüpe süzün. Herhangi bir topak kalırsa, bir mililitrelik şırıngadan pistonun düz ucunu kullanarak süzgeçten bastırın.

Ardından, süzgeci yüzde 10 FBS içeren 10 mililitre RPMI ortamı ile durulayın. Filtrelenmiş çözeltiyi dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı dikkatlice boşaltın ve peleti yüzde iki FBS içeren bir mililitre RPMI ortamında yeniden askıya alın.

İnce bağırsak lenfositlerinin tek hücreli süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, splenositlerle benzer ileri ve yan saçılma özelliklerine sahip gizli bir hücre popülasyonu vermelidir. İzolasyonun ilk aşamalarında doku dört santigrat derecede tutulmazsa lenfositler ölmeye başlayabilir, bu da lenfosit popülasyonunun daha düşük bir öne doğru dağılıma sahip olmasına ve diğer epitel ve ölü hücrelerden ayrılmasının daha zor olmasına neden olabilir. Ayrıca, mezenterik yağ ince bağırsak dokusundan tamamen çıkarılmazsa, neredeyse tamamen lenfosit kaybı olacaktır.

Tipik olarak, ince bağırsak LP lenfositleri için yüzde 80'lik bir canlılık elde edilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, dört fare işlenebilir ve dört saatten daha kısa bir sürede lekelenmeye hazır tek hücreli süspansiyonlara sahip olabilirsiniz. Bu prosedür sırasında, tam sindirimi sağlamak için tüm mezenterik yağın tamamen çıkarılması ve dokunun iyice kıyılması önemlidir.

Bu prosedürü takiben, tek hücreli süspansiyonlar, bu hücrelerin işlevini daha fazla karakterize etmek için en vitro deneyler, gen ekspresyon analizi veya evlat edinme transferi gibi akış sitometrisi dışındaki amaçlar için kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, mukozal immünoloji araştırmacılarının farelerde bağırsak bağışıklık sisteminin ontogenezi ve fonksiyonel etkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, mezenterik yağı temizleyerek, epitel tabakasını çıkararak ve dokuyu kollajenaz ile sindirerek tek hücreli süspansiyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.