Name: Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin fare küçük bağırsak lenfositlerinin izolasyonunu ve akım sitometrisi karakterizasyonunu. Bu hızlı ve tekrarlanabilir yöntem, mukozal immünoloji ve mikrobiyota-bağırsak bağışıklığı ilişkisini incelemek için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NKS, NIH ödülü K08 AI108690 tarafından desteklenmektedir.

Tüm çalışmalar Laboratuar Hayvanları Bilimi için Amerikan Derneği (AALAS) tarafından belirlenen veteriner standartlarını karşılayan Harvard Tıp Okulu&#39;nda Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre sıkı inceleme ve kuralları uyarınca yapılmıştır. Co-konut yoluyla Bakterilerin 1. Yatay İletim (İsteğe bağlı) <ol><li> yiyecek ve her ikisi de otoklavlanmış edilmiş su kullanarak, steril tek kullanımlık kafesleri montaj sırasında (gnotobiyotik fareler kullanılarak özellikle) eksojen kontaminasyonu en aza indirmek için, aseptik teknik uygulama. </li><li> Kullanım kulak yumruklar veya etiketleri tek tek farklı microbiotas liman ve aynı kafeste onlara ev 6 haftalık C57BL / 6 fareler işaretlemek için. fareler coprophagic ve kafes yerden fekal pelet yemek göz önüne alındığında, mikroplar doğal fareler arasında yatay iletilecektir. </li><li> ≥1 hafta Co-ev fareler analizden önce mikrobiyal transferi ve immünolojik değişim için zaman tanımak için. </li></ol&gt; Küçük bağırsak intraepitelyal Katman ve lamina propria bir Tek Hücre Süspansiyon 2. Hazırlık <ol><li> Çözümler hazırlanması <ol><li> (Ince bağırsak başına) Ekstraksiyonu hazırlanması: 30 ml RPMI + 93 ul% 5 ditiyotreitol (DTT) (w / v) + 60 ul 0.5 M EDTA + 500 ul cenin sığır serumu (FBS). Kullanmadan önce hemen DTT ekleyin. </li><li> 25 ml RPMI + 12.5 mg dispase + 37.5 mg kollajenaz II + 300 ul FBS: (ince bağırsağın başına) sindirim ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce hemen dispase ve kollajenaz ekleyin. </li><li> 37 ° C, 37 ° C, ön ısıtılması çözeltiler gerçekleştirilen tüm inkubasyon için. </li></ol></li><li> Servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 boğulma fare Euthanize. </li><li> aşağı fare dorsal yüzü koyun ve% 70 etanol ile karın püskürtün. sırayla fro ventral orta hat boyunca cilt ve sonra periton fasya keserek bir laparotomi gerçekleştirmek için makas kullanınböylece periton boşluğuna açığa kılıç şeklinde sürecine pubis eklemi m. </li><li> pilor sfinkter bölücü ile mideden ince bağırsağa ayırmak için makas kullanın. Yavaşça mezenterik yağ uzak alay, periton ince bağırsak kaldırın. <ol><li> Tamamen ince bağırsak kaldırmak için, ileo-çekal kavşakta ikinci bir kesim yapmak. Soğuk izole edilmiş ince bağırsağa yerleştirin (yani., 4 ° C),% 10 FBS içeren RPMI hücre canlılığı üst düzeye çıkarır. </li></ol></li><li> Yavaşça kavisli bir forseps kullanarak yağ büyük parçalar çıkarın. yağ çıkarmak isterken bağırsak dokusu kendisini yırtılmasını önlemek için dikkatli kullanın. </li><li> bir şırınga yapıştırılmış bir 18 G besleme iğne kullanılarak soğuk PBS 20 ml - 15 ile bağırsak içeriği, hafifçe yıkayın bağırsakları kaldırmak için. </li><li> PPS tüketim için makas kullanın ve% 5 FBS içeren soğuk RPMI içine koyun. PPs ince bağırsak antimezenterik tarafında bulunur ve bir çok-lobüle beyaz görünürkitle. 12 PPS - Belirli zorlanma bağlı olarak, bir fare, genellikle 8 sahiptir. </li><li> 4 inçlik segmentlerine - 3 içine ince bağırsak kesti. </li><li> uzak dokudan yağ kızdırmak için sıkıcı bir neşter kullanılarak, RPMI ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerine her ince bağırsak segmenti yuvarlayarak kalan yağ çıkarmak. </li><li> kavisli bir forseps ile bağırsak segmentleri kanüle ve doku distal ucunu tutarak dışarı içinde doku çevirin. Sonra yavaşça doku ters olan sonuçlanan (proksimal ucunda başlar) kavisli bir forseps doku segmenti çıkarmak için düz forseps bir çift kullanın. </li><li> 30 emme ml ortam ve bir karıştırma çubuğu ihtiva eden bir kap içinde, doku bölümleri yerleştirin. fincan kapağı elde edin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 500 rpm&#39;de karıştırıldı; karıştırma dinç ama çalkantılı olmamalıdır. </li><li> kuluçkadan sonra bulutlu görünmelidir epitel içeren süpernatant, doku parçaları ayırmak için çelik süzgeç kullanın. Bu yüzer madde i içerir2.23 - adımda 2.18 numune süzme işlem yolu ile, arzu edildiği takdirde daha da analiz edilebilir ntraepithelial lenfositler. </li><li> El ile artık çıkarma medya yıkayacak RPMI doku parçaları çalkalayın. </li><li> kuru bir kağıt havlu üzerine doku yerleştirin ve ekstraksiyon ortamı tarafından serbest değildi bakiye mukus çıkarılmasını kolaylaştırmak için son birkaç kez sona çevirin. </li><li> Sindirim ortamının 600 ul, 1.5 ml bir tüp içinde doku parçaları yerleştirin. </li><li> parçalar artık makas sopa ve çözüm homojen görünene kadar doku kıyma için makas kullanın. Bu adım, doku tam enzimatik sindirim sağlamak için çok önemlidir. </li><li> sindirim medya 25 ml içeren bir bardağa kıyılmış ince bağırsak ekleyin. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 500 rpm&#39;de karıştırılır. Yarım sindirim yoluyla (yani., 15 dk), pipetlemeyin yukarı ve serolojik pipet ile aşağı dokusunun herhangi büyük boyutta break up yardımcı olur. </li><li> Filtre Sindirilmiş doku (veya epithadım 2.12 Elial tabaka halinde 50 ml&#39;lik bir tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden işleme IELS). % 10 FBS ihtiva eden RPMI 20 ml süzgeç durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 x g&#39;de filtre solüsyonu santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle% 10 FBS ihtiva eden RPMI 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li><li> Filtre 50 ml&#39;lik bir tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden hücreler yeniden süspansiyon haline getirildi. % 10 FBS ihtiva eden RPMI 20 ml süzgeç durulayın. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de çözelti filtre edilmiştir. </li><li> Dikkatle% 2 FBS içeren RPMI 1 ml süpernatan, ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li></ol> Peyer yamaları tek bir hücre süspansiyonu 3. hazırlanması <ol><li> Transferi 25 sindirim medya ml ve bir karıştırma çubuğu ile bir fincan PPS eksize. Güvenli kapağı ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 rpm&#39;de döndürün. </li><li> Filtre 50 ml&#39;lik bir tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden PPS sindirilmiş. herhangi bir yığınının Rema Eğeriçinde, bir 1 ml şırınga pistonu düz ucunu kullanarak süzgeç aracılığıyla basın. </li><li> % 10 FBS ihtiva eden RPMI 10 ml süzgeç durulayın. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de çözelti filtre edilmiştir. </li><li> Dikkatle% 2 FBS içeren RPMI 1 ml süpernatan, ve tekrar süspansiyon pelet süzün. </li></ol> Akım Sitometrisi 4. Yüzey Boyama <ol><li> Hücre kısım uygun hacmi (örneğin., LPLs 200 ul) 96-çukurlu yuvarlak tabanlı plaka. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> RPMI% 2 FBS içeren 90 ul içinde süspanse hücreleri ve bir 1: anti-CD16 / 32 (Fc Block) 100 dilüsyon. 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 10 ul PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> 250 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. tarafından decant süpernatantplakayı tersini. </li><li> üreticinin protokolünü takip ederek, eğer istenirse canlılığı boya ile (isteğe bağlı) boyama hücreleri. </li><li> 100 ul% 1 formalin içinde süspanse hücreler düzeltmek için. 4 ° C&#39;de karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 200 ul PBS ekleyin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> 250 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. plakayı ters çevirerek süpernatant süzün. </li><li> 200 ul PBS içinde süspanse edin hücreleri. bir akış sitometresinin kullanarak hücrelerin analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li>
<li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li>
<li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+%28normal+microflora%29%2C+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides%3A+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li>
<li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li>
<li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Biz izolasyonu için bir protokol mevcut ve PPS&#39;de LPLs, IELS ve lenfositler de dahil olmak üzere ince bağırsak lenfosit, sitometrik karakterizasyonu akar. Mikrobiyota değişiklikler ince bağırsak bağışıklık sistemini nasıl etkilediğini değerlendirmek ilgilenenler için, detay farklı microbiotas barındıran fareler arasında organizmaların yatay iletim dahil basit adımlar. Bu protokol, ince bağırsakta odaklanır rağmen, prosedür tek fark hiçbir PPs kaldırmak için vardır (kolon yamalar mevcut olmasına rağmen, bunlar fena h...

İnce bağırsağın temel görevi, genellikle besinlerin 1 sindirim ve emilim olarak kabul edilir. Bu metabolik fonksiyon açıkça gerekli iken, ince bağırsak lümeninin 2 içinde bulunan çevresel antijenlere sürekli baraj konağı korunmasında eşit derecede önemli bir role sahiptir. Bağırsak dış dünyayı ayıran (örn., Lümen antijenler) Sadece tek bir hücre tabakası kalınlığında bir epitel tabakası ile konağın iç ortamdan. Bu şekilde, ince bağırsak, bağışıklık sistemi, işgalci patojenlere karşı güçlü bir yanıtın monte ederken, minimal mukoza girmek için diyet ve ortakçı mikroplardan yabancı antijenleri sağlayan, herhangi bir halinde, bir bağışıklık tepkisi reaktivite için eşik dengeleme üstün görevi, öteki &quot;zararlı&quot; antijenler. Bu antijenlere karşı aşırı ya da uygunsuz immün yanıtlar (patolojik hastalığa yol açabilir, örneğin., Inflamasyonedici bağırsak hastalığı, tip I diyabet, çok merkezli skleroz) ve 3-6 kaçınılmalıdır. Genel olarak, mide-bağırsak yolu, tüm antikor salgılayan hücreler 7% 70 üzerinde içeren, vücudun en büyük immün organı temsil ettiği düşünülmektedir. Lamina propriya (LP), intraepitelyal tabaka ve Peyer yamaları (PPS) - - ince bağırsak bağışıklık sistemi 3 ana bölmeden oluşur, her lenfosit 2 ayırt edici bir grubu içerir. LP lenfositleri (LPLs) ~% 20 B hücreleri ile esas TCRαβ + T hücreleridir; intraepitelyal lenfositler (IELS) TCRαβ + T hücreleri daha TCRγδ + T hücreleri çok az sayıda B hücrelerini içeren; ve ince bağırsak duvarında gömülü ikincil lenfoid organlar PPs, ~% 80 B hücrelerini içerirler. Bu anatomik bölgelerin her biraz farklı fonksiyonları ve ontolojik üsleri olmasına rağmen, onlar işlev aharmonized moda patojenik hakaretlere gelen ev sahibi korumak için. Ayrıca, Mikrobiyota özel mikroplar ve özellikle hücre soylarının 8,9 ontogeny arasındaki soydaş ilişkinin tanıma artan bağırsak bağışıklık sisteminin gelişimi için kritik bir belirleyicisi olduğunu büyüyen takdir var. Ayrıca, bağırsak bağışıklık sisteminin eğitim anatomik uzak bölgelerde bağışıklık tepkilerini etkiler göz önüne alındığında (örneğin., Artrit, multipl skleroz, pnömoni), daha önce 10 tanıdı daha bağırsak bağışıklık sisteminin gelişmesi daha hastalık süreçleri ile ilgili olduğu açıkça ortaya çıktı -12. Bu nedenle, kantitatif bağırsak bağışıklık sistemini değerlendirirken ilgi şimdi konak-ortakçı etkileşimleri ve birçok sistemik hastalığın patogenezi de içerecek şekilde konak-patojen etkileşimleri aşmıştır. mevcut yöntemlerin değişkenliği göz önüne alındığındabağırsak lenfosit izolasyonu gerekli zamanı dengeleme giderek kritik iken verimi, canlılığı ve tutarlılık için optimize edilmiş bir yöntem. Percoll geçişlerini içeren protokoller, zaman ve emek yoğun ve insan hatası potansiyel olarak daha yatkındır değişken verim giden ve 13 canlılığı. Burada, 3 ince bağırsak immün bölmelerden lenfositlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için optimize edilmiş bir protokol sağlar. Buna ek olarak, mukozal bağışıklık sistemi mikrop kaynaklı değişikler verilen artan bir ilgi, bu değişikliklerin kantitatif bağırsak bağışıklık sistemini nasıl etkilediği değerlendirmek için fareler arasında mikroorganizmaların yatay aktarım sağlamak için kullanılabilir adımları içerir.

<table><tbody><tr><td>Steril Eldivenler</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>steril fare kafesi</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>kapak, kafes tabanı ve alpha-dri yatak takımı içerir</td></tr><tr><td>Metal besleyici</td><td>Yenilikçi</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Su şişesi</td><td>Yenilikçi</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Kart sahibi</td><td>Yenilikçi</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Otoklavlanabilir kemirgen chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ortamı 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>Protokoldeki konsantrasyon, 1.878 U / mg</td></tr><tr><td>Kollajenaz, tip II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>protokolündeki konsantrasyon, 245 U/mg aktivite seviyesine dayanmaktadır</td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Besleme iğnesi (18 G, 2" uzunluk)</td><td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Şırınga</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Neşter (15 bıçak)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Düz forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Çok amaçlı kaplar, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma çubuğu</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Çok konumlu karıştırma plakası, 9 konumlu</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik konik süzgeç, 3 inç&nbsp;</td><td>LCV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tüp</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu Plaka, yuvarlak tabanlı</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD16/32 (Fc bloğu)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>(İsteğe bağlı) Sabitlenebilir canlılık boyası eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>%10 Formalin, nötr tamponlu</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

fare küçük bağırsak lenfositler izolasyonu ve akım sitometrisi karakterizasyonu

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

bağırsaklar - Vücutta herhangi bir organın bağışıklık hücrelerinin en fazla sayıda içerirler - sürekli yabancı antijenleri, mikrobik ve diyet hem de maruz kalmaktadır. bağırsak sistemik hastalıkların bir dizi için kritik olan bu lümen antijenler immün yanıtı ve bağışıklık hücrelerinin eğitimin şekillenmesine yardımcı olduğunu giderek artan bir anlayış göz önüne alındığında, bağırsak bağışıklık sistemini karakterize ilgi var artmıştır. Bununla birlikte, bir çok yayınlanmış protokoller zor, zaman alıcıdır. Biz, hızlı, tekrarlanabilir ve zahmetli Percoll geçişlerini gerektirmez ince bağırsak lamina propria, intraepitelyal tabaka ve Peyer yamaları lenfositlerin izolasyonu için burada basitleştirilmiş bir protokol mevcut. Protokol, ince bağırsakta üzerine odaklanmış olmakla beraber, bu da kolon analizi için de uygundur. Ayrıca, biz belirli bir bilimsel ques bağlı olarak ek optimizasyon gerekebilir bazı yönlerini vurgulamakyon. Bu yaklaşım daha sonra, akış sitometrik analizinde ve özellikleri alternatif yollarla kullanılabilir uygulanabilir lenfositler, çok sayıda ayrı olarak elde edilir.

Splenositler (Şekil 1A ve 1B) halinde ileri içindeki ve yan saçılma özelliklere sahip farklı bir hücreler popülasyonu elde gereken ince bağırsak lenfositlerin tekli hücre süspansiyonları, akış sitometrik analizi. Doku izolasyon ilk aşamalarında, 4 ° C de muhafaza değilse lenfositleri daha düşük bir ileri dağılım olan ve diğer epitel ve ölü hücrelerden ayırmak için daha zor olan lenfosit popülasyonu ile sonuçlanan, kalıp başlayabilir (Şekil 1C) . Ince bağ...

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Bu prosedürün genel amacı, daha sonra akış sitometrik analiz veya alternatif bir karakterizasyon yöntemi için kullanılabilecek tek hücre popülasyonlarını farklı ince bağırsak bölmelerinden izole etmektir. Bu yöntem, mikrobiyotanın bağırsak bağışıklık sisteminin gelişimi üzerindeki etkisi gibi mukozal immünolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları hızlı olması, tekrarlanabilir olması ve zahmetli percoll gradyanları gerektirmemesidir.Bu prosedüre başlamak için, fareyi sırtı alta gelecek şekilde yerleştirin ve karnına %70 etanol püskürtün; pubik simfizden ksifoid çıkıntıya kadar ventral orta hat boyunca sırasıyla deri ve ardından periton fasyasını keserek bir laparotomi gerçekleştirin ve böylece periton boşluğunu açığa çıkarın. Ardından, pilorik sfinkteri traansekt ederek ince bağırsağı mideden ayırın. İnce bağırsağı peritondan nazikçe çıkarın ve mezenterik yağı ayıklayın.İnce bağırsağı tamamen çıkarmak için ileosekal bileşkede ikinci bir kesi yapın. Hücre canlılığını maksimize etmek için izole edilen ince bağırsağı, yüzde 10 FBS içeren dört derece Celsius RPMI besiyerine yerleştirin. Büyük yağ parçalarını kavisli pensler yardımıyla nazikçe temizleyin ve bu işlem sırasında bağırsak dokusunun yırtılmamasına dikkat edin.Bağırsak içeriğini temizlemek için, bir şırıngaya takılı 18 gauge besleme iğnesi ile ince bağırsağın proksimal ucunu kanüle edin ve bağırsağı 15 ila 20 mililitre soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. İnce bağırsağın antimezenterik tarafında bulunan ve çok loblu beyaz bir kütle şeklinde görünen Peyer plaklarını eksize etmek için makas kullanın. Ardından, bunları yüzde beş FBS içeren soğuk RPMI ortamına yerleştirin.Ardından, ince bağırsağı üç ila dört inçlik segmentlere bölün; her bir ince bağırsak segmentini RPMI ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerinde yuvarlayarak kalıntı yağları temizleyin ve yağları dokudan ayırmak için küt uçlu bir bistüri kullanın. Mezenterik yağların tamamen temizlenmesine titizlikle dikkat etmek, lenfositlerin canlılığını sağlamak açısından kritiktir; çünkü çok küçük yağ parçaları bile hücrelerin ölmesine neden olabilir. Bundan sonra, kavisli penslerle bağırsak segmentlerini kanüle ederek ve dokunun distal ucunu tutarak dokuyu ters yüz edin, ardından düz bir pens kullanarak doku segmentini proksimal uçtan nazikçe çıkarın; böylece doku ters dönmüş olacaktır.Doku segmentlerini, 30 milliliters ekstraksiyon medyası ve bir manyetik karıştırıcı çubuk içeren bir kaba yerleştirin. Kapağı sıkıca kapatın ve 37 °C'de 15 dakika boyunca karıştırın. Karıştırma işlemi kuvvetli olmalı, ancak türbülans oluşturmamalıdır.15 dakika sonra, doku parçalarını bulanık görünmesi gereken süpernatant içeren epitelyumdan ayırmak için çelik bir süzgeç kullanın. Kalıntı ekstraksiyon ortamını temizlemek için doku parçalarını RPMI medyumunda manuel olarak çalkalayın. Ardından, dokuyu kuru bir kağıt havluya yerleştirin ve ekstraksiyon medyumu ile serbest bırakılamayan kalıntı mukusun temizlenmesini kolaylaştırmak için birkaç kez ters çevirin.Ardından, doku fragmanlarını 600 µL sindirim ortamı içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Parçalar artık makasa yapışmayana ve solüsyon homojen görünene kadar dokuyu ince ince kıyın. Bu adım, dokunun tam enzimatik sindirimini sağlamak için kritiktir.Parçalar artık makasa yapışmayana ve çözelti homojen görünene kadar dokuyu kıymak, hem hücresel verimi hem de sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak açısından kritik öneme sahiptir. Kıyılmış ince bağırsağı, 25 milliliters sindirim ortamı içeren bir kaba ekleyin ve 37 degrees Celsius sıcaklıkta 30 dakika boyunca karıştırın. Sindirim işleminin ortasında, büyük doku parçalarının parçalanmasına yardımcı olmak için serolojik bir pipetle sıvıyı yukarı ve aşağı pipetleyin.Ardından, sindirim dokusunu 100 mikrometre hücre süzgeci aracılığıyla 15 mililitrelik bir tüpe süzün. Süzgeci, %10 FBS içeren 20 mililitre RPMI medyumu ile durulayın. Sonrasında, süzülmüş çözeltiyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı dikkatlice dökün ve pelletini %10 FBS içeren bir mililitre RPMI mediumu içinde yeniden süspande edin. Yeniden süspande edilen hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci aracılığıyla 15 mililitrelik bir tüpe filtreleyin. Süzgeci %10 FBS içeren 20 mililitre RPMI ile durulayın.Ardından, filtre edilen çözeltiyi dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Supernatantı dikkatlice dökün ve peleti, yüzde iki FBS içeren bir mililitre RPMI besiyerinde yeniden süspande edin. Bu prosedürde, eksize edilen Peyer plaklarını 25 mililitre sindirim medyası ve bir karıştırma çubuğu içeren bir kaba aktarın.Kapağı sıkıca kapatın ve 37 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, sindirilmiş Peyer plaklarını 40 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek 15 mL'lik bir tüpe filtreleyin. Eğer topaklar kalmışsa, bunları 1 mL'lik bir şırınganın pistonunun düz ucunu kullanarak süzgeçten bastırarak geçirin.Ardından, süzgeci %10 FBS içeren 10 mililitre RPMI besiyeri ile durulayın. Filtre edilen çözeltiyi 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Sonra, süpernatanı dikkatlice dökün ve peleti %2 FBS içeren bir mililitre RPMI besiyerinde yeniden süspande edin.İnce bağırsak lenfositlerinin tek hücreli süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, splenositlerle benzer ileri ve yan saçılma özelliklerine sahip belirgin bir hücre popülasyonu vermelidir. İzolasyonun başlangıç aşamalarında doku dört derece santigrat sıcaklıkta tutulmazsa lenfositler ölmeye başlayabilir; bu durum lenfosit popülasyonunun daha düşük bir ileri saçılma göstermesine ve diğer epitel ve ölü hücrelerden ayrılmasının daha zor hale gelmesine neden olur. Ayrıca, mezenterik yağ ince bağırsak dokusundan tamamen temizlenmezse, lenfositlerin neredeyse tamamen kaybı meydana gelecektir.Genellikle, ince bağırsak LP lenfositleri için yüzde 80 canlılık elde edilir. Yöntem kavrandıktan sonra, dört fare işlenebilir ve tek hücreli süspansiyonlar dört saatten kısa bir sürede boyamaya hazır hale getirilebilir. Bu prosedür sırasında, tüm mezenterik yağın tamamen temizlenmesi ve tam sindirimi sağlamak için dokunun iyice kıyılması önemlidir.Bu prosedürün ardından, tek hücreli süspansiyonlar; bu hücrelerin fonksiyonlarını daha ayrıntılı karakterize etmek amacıyla in vitro deneyler, gen ekspresyon analizi veya adoptif transfer gibi akış sitometrisi dışındaki amaçlar için de kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, mukozal immünoloji alanındaki araştırmacıların farelerde bağırsak bağışıklık sisteminin ontojenisini ve fonksiyonel etkilerini incelemesine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra; mezenterik yağların temizlenmesi, epitel tabakasının çıkarılması ve dokunun kollajenaz ile sindirilmesi yoluyla, farklı ince bağırsak bölmelerinden tek hücreli süspansiyonların nasıl izole edileceğine dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, fare intestinal dendritik hücrelerinin (DC'ler) ve makrofajların hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. İntestinal DC'lerin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu çok renkli akış sitometrik analiz kullanılarak gerçekleştirilirken, fonksiyonel çalışmalar için yüksek saflıkta popülasyonlar elde etmek amacıyla manyetik boncuk zenginleştirmesi ve ardından hücre ayıklama yöntemi kullanılır.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Bu makalede, sitometrisi spektral, fluorochromes ayırt emisyon spektrumları şekilleri kullanan akış sitometrisi yeni bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bir algoritma, tazminat değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi edebilir. Bu yeni yaklaşım, katı organ izole edilmiş hücre uygun analizi sağlar.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Öğrenin fare küçük bağırsak lenfositlerinin izolasyonunu ve akım sitometrisi karakterizasyonunu. Bu hızlı ve tekrarlanabilir yöntem, mukozal immünoloji ve mikrobiyota-bağırsak bağışıklığı ilişkisini incelemek için temel oluşturur.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet