Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde
22 Nisan 2019
Burada, iki farklı türde kültür yüzeylerde hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut kullanan tip ı kollajen. Bağlı olarak kollajen nasıl işlendiğini, kolajen molekülleri iki boyutlu, fibröz olmayan bir form korumak ya da üç boyutlu, Fibriller formuna yeniden birleştirmek. Hücre çoğalması olarak tip ı kollajen fibril oluşumu ile büyük ölçüde etkilenir.
Bu video nasıl tip I kollajen ve iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yöntemi kullanarak hücre kültürü yüzeylerin iki farklı türde hazırlamak için gösterir. Üç boyutlu kültür yöntemi biyolojik çevreye göre kabul edilir, üç boyutlu bir kültür alt tabakasının nasıl kolayca hazırlanacağını gösteren çalışmalar için yararlıdır. Çok sayıda hücre tiplerinde, aynı kollajen kullanılmasına rağmen, hücre davranışı önemli ölçüde iki boyutlu ve üç boyutlu substratlar arasında değişir.
Üç boyutlu kültür alt tabakası kullanılarak, canlı organizmalarınkine daha çok benzeyen hücre davranışı kolayca incelenebilir. Bu yöntem çok basittir ve en az özel reaktif gerektirir. Görsel gösteri önemlidir, çünkü bu yöntemin kolayca denendiğini göstermek isterken, üç boyutlu jel kırılgandır ve düzgün bir şekilde kullanmak çok önemlidir.
Başlamak için, uygun kültür ortamını hazırlayın. Kollajen hazırlamaya başlamak için, 10x PBS, deiyonize su, kollajen, 96-iyi kültür plakası ve buz üzerinde boş bir iki mililitrelik tüp yerleştirin. Bir pipet kullanarak, boş iki mililitrelik tüp için deiyonize su 1.12 mililitre ekleyin.
Deiyonize suya 200 mikrolitre 10x PBS ekleyin ve tüpü birkaç kez hafifçe sallayın. Hemen kullanımdan önce, iki mililitretüp kollajen 0.66 mililitre ekleyin. Yavaşça ve hızlı bir şekilde tüp birkaç kez sallamak.
96 kuyulu kültür plakasının her kuyuya bu kollajen çözeltisinin 100 mikrolitresini dökün ve kuyuların tüm yüzeyini kaplayın. Soldan sağa hareketi kullanarak plakayı hafifçe sallayın. Kültür plakasını bir saat boyunca 37 derecede karbondioksit kuvözde kuluçkaya yatırın.
Sonra kollajen jelasyon onaylamak için plaka yatırın ve temiz bir tezgah için kültür plakası hareket ettirin. Yavaşça kuyunun duvar boyunca borulama tarafından jeller üzerine K110 150 mikrolitre dökün. Bir saat liğine 37 derecede karbondioksit kuvözde kuluçkaya yat.
Bundan sonra, temiz bir tezgah için kültür plakası taşıyın. Hücre kültüründen hemen önce, K110'u nazikçe atmak için bir pipet kullanın. İlk 1.5 mililitrelik tüp bir milimolar hidroklorik asit 1.2 mililitre kollajen dört mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın, ve yavaşça karıştırın.
Yeni bir 96-well kültür plaka her kuyuiçine bu kollajen karışımı 100 mikrolitre dökün. Plakayı soldan sağa doğru hafifçe sallayın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kollajen çözeltisi atın.
Bir pipet kullanarak, her biri pbs ile iyi yıkayın. Kültür plakasının her kuyusuna 150 mikrolitre BSA ve PBS ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatın. Hücre kültüründen önce %1'lik BSA çözeltisini atın.
Başlamak için, FEPE1L-8 hücreleri ve K110, tripsin ve trippsin inhibitörü metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Dikkatle kültür çanak orta çıkarın ve% 0.05 tripsin üç mililitre eklemek için bir pipet kullanın. Yemeği karbondioksit kuvöze geri yerleştirin ve 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra 10x büyütme de faz kontrast mikroskobu kullanarak kültür çanak yüzeyinden hücre dekolmanı kontrol edin. Tripsin inhibitörü üç mililitre ekleyin ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüp içinde müstakil hücreleri toplamak için bir pipet kullanın. Santrifüj 200 kez g beş dakika için.
Bundan sonra, supernatant atın ve K110 10 mililitre pelet resuspend. Hücreleri saymak için 10x büyütme faz kontrast mikroskobu kullanın ve mililitre başına 50, 000 hücre yoğunluğu K110 ile hücreleri seyreltmek. Yavaşça iyi duvar boyunca borulama tarafından kültür plakaher kuyuiçine hücre süspansiyon 0.1 mililitre tohum.
Uygun süre için 37 santigrat derecede karbondioksit kuvözde kuluçkaya yat. İlk iki mililitretüp te1.3 mililitre k110 ile tetrazolyum tuz ve WST-8 130 mikrolitre karıştırın. Kültür plakasını temiz bir tezgaha taşıyın ve K110'u kuyulardan nazikçe atmak için bir pipet kullanın.
K110 ile yapışmayan ve yapışmayan hücreleri hafifçe yıkayın. Sonra her kuyuya WST-8 ile karıştırılmış 110 mikrolitre K110 ekleyin. Karbondioksit kuvözde iki saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Bundan sonra, temiz bir tezgah için kültür plakası taşıyın. Her kuyudan 100 mikrolitre klimalı ortam toplayın ve 96 kuyulu yeni bir kültür plakasının kuyularına taşıyın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 450 nanometre olarak absorbans ölçmek ve canlı hücrelerin sayısını tahmin.
Hücre morfolojisi non-fibröz ve fibril formları burada gösterilmiştir gözlenmektedir. Culturing ilk iki saat içinde, hücreler yapışır ve kollajen her iki formları yayıldı. Fibrül formundaki hücreler sınırlı yayılma gösterirken, fibröz olmayan formdaki hücreler yayılmaya devam eder ve hücre sayıları artar.
FEPE1L-8 hücreleri tip I kollajenin lifsiz olmayan formunda ve işlenmemiş çanak yüzeylerinde çoğalmaya devam eder. Buna karşılık, hücreler fibril formunda çoğalmaz. Bu yordamı çalışırken, üç boyutlu jel çok kırılgan olduğunu hatırlamak önemlidir.
Bir çözüm veya ipuçları jelleri ile doğrudan temas olmadığından emin olmak için dikkatli olmalıdır. Bu yöntem çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Örneğin, numunenin membran bileşenlerini karıştırmak için, bir hücre kültürü alt tabaka bir bodrum membran taklit yapabilirsiniz.
Birçok durumda, canlı lardaki hücre dışı matriksin işlevleri bilinmemektedir. Üç boyutlu kültür deki kültür hücrelerine göre, canlı bedene daha çok benzeyen hücre dışı matriks bileşeninin işlevini inceleyebilirsiniz. Üç boyutlu jel kültür teknikleri uygulayarak, bir etkili hücrelerde ilaçların konsantrasyonu test edebilirsiniz.
Bu protokol, kişinin amacına dayalı olarak, jelasyonlar sırasında diğer EGM bileşenleri veya büyüme faktörleri karıştırılarak karmaşık üç boyutlu kültür yüzeyleri geliştirmek için kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu makale, tip I kollajen kullanarak iki tip hücre kültürü yüzeyinin hazırlanması için bir protokol sunmakta ve iki boyutlu ve üç boyutlu yüzeylerde hücre davranışlarındaki farklılıkları vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre kültürü teknikleri
- Kollajen yüzey hazırlanması
- Hücre davranışı analizi
Arka Plan
- Tip I kollajen iki formda bulunabilir: lifsiz ve fibriller.
- Kullanulan kollajen formu hücre çoğalmasını önemli ölçüde etkiler.
- Üç boyutlu kültür yöntemleri biyolojik ortamları daha iyi taklit eder.
- Üç boyutlu jellerin kullanımı hassasiyet gerektirir çünkü kırılgandır.
Çalışmanın Amacı
- Kollajen bazlı kültür yüzeyleri hazırlamak için basit bir yöntem göstermek.
- İki boyutlu ve üç boyutlu yüzeylerde hücre davranışını karşılaştırmak.
- Biyolojik olarak daha alakalı bir ortam gerektiren çalışmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kollajen çözeltileri ve kültür plakalarının hazırlanması.
- Jelleşmeyi teşvik etmek için yüzeylerin inkübasyonu.
- Tripsin kullanarak hücre ayrıştırma ve sayımı.
- Hücre canlılığının absorbans ölçümü yoluyla değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Hücreler, fibriller formlara kıyasla lifsiz kollajen üzerinde daha etkili şekilde çoğalmıştır.
- Hücre morfolojisi iki yüzey tipi arasında önemli ölçüde farklılık göstermiştir.
- Üç boyutlu kültürler, in vivo koşullarına benzer hücre davranışına dair içgörüler sağlamıştır.
- Üç boyutlu jellerin kırılganlığı dikkatli kullanım gerektirmiştir.
Sonuçlar
- Üç boyutlu kültür yüzeyleri hücre davranışı çalışmasını geliştirebilir.
- Bu yöntem çeşitli deneysel ihtiyaçlar için uyarlanabilir.
- Dış hücresel matrisin rolünü anlamak gelecek araştırmalar için kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Evaluating keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type I collagen substrates enables mechanistic de-risking in target validation by revealing how extracellular matrix architecture influences cellular behavior. This comparative approach supports predictive confidence in preclinical models by identifying substrate-dependent differences in adhesion, spreading, and proliferation. Such insights inform assay development and phenotypic screening strategies where physiological relevance is critical for drug efficacy assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying how collagen dimensionality affects keratinocyte proliferation and adhesion.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct comparison of cell behavior on physiologically relevant versus standard culture substrates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing substrate-specific proliferation baselines.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through defined collagen preparation and gelation protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease relevance by modeling wound healing-like conditions using on-gel keratinocyte culture.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by mimicking in vivo extracellular matrix environments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable platform to assess how extracellular matrix composition influences cellular phenotypes prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating the variable of collagen dimensionality.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative viability readouts via WST-8 absorbance.
- Analytics: Enables comparative analysis of cell proliferation and morphology between 2D and 3D conditions using microplate reader outputs.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling physiological cell behaviors relevant to drug efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to various cell types and extracellular matrix component screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in keratinocyte responses to extracellular matrix cues.
- Operational Value: Promotes standardization and scalability through simple, reagent-minimal collagen preparation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying substrate-dependent proliferation risks early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on physiological relevance of culture systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture techniques and extracellular matrix biology.
- Depends on standard laboratory instrumentation including incubators, pipettes, phase contrast microscopes, and microplate readers.
- Necessitates cross-team standardization of collagen handling due to gel fragility and sensitivity to mechanical disruption.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or extracellular matrix compositions.
- Includes practical limitations such as the fragility of three-dimensional gels requiring careful handling to avoid damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:12
Preparation of Keratinocyte Culture Medium and the Fibril Form of Type I Collagen
2:53
Preparation of the Non-fibrous Form of Type I Collagen
3:50
Culture of FEPE1L-8 Cells
5:20
Estimation of the Number of Viable Cells
6:20
Results: Evaluation of Keratinocyte Proliferation
7:01
Conclusion
