Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Bu prosedürün genel amacı, hücre fonksiyonunu incelemek için üç boyutlu kollajen matrisi gibi bir doku oluşturmaktır. Bu, ilk olarak sıçan kuyruğu tendonlarından kollajen çıkarılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, fibroblastların kollajen jelini kasmasına izin vermek için fibroblastların varlığında kollajen lifleri yeniden oluşturulur.

Üçüncü adımda, tümör hücreleri son adımda matrisin üstüne oturtulur. Matris, tümör hücrelerinin matrise istilasına izin vermek için bir hava sıvısı arayüzü oluşturmak için metal bir ızgaranın üzerinde inkübe edilir. Sonuç olarak, tümör hücresi istilası ve farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimler dahil olmak üzere matris sentezi hücre göçünü analiz etmek için immünohistokimyasal boyama ve floresan mikroskobu yapılabilir.

Bu nedenle bu yöntem, invazyon ve metastaza bakmak ve aynı zamanda tümör gelişimine bakmak için idealdir. Karmaşık bir üç boyutlu S'de, farklılaşma, hücre sağkalımı ve hücre büyümesi gibi şeylere bakabiliriz. Ancak özellikle, invazyonun önemli olayları sırasında tümör hücrelerinin stroma ile nasıl etkileşime girdiğine bakabiliriz.

Kanser metastazının en erken kısımlarından biri Deri implantlarından fibroblast kültürleri oluşturmak. İlk önce bir Petri kabının dibine penisilin, streptomisin ve mantar bölgesi ile takviye edilmiş birkaç damla MEM yerleştirin. Daha sonra bir insan önkolundan alınan dört milimetrelik punch biyopsisini tabağa yerleştirin.

Ardından, son olarak, 24 numaralı neşter bıçağını petri kabının dibine doğru sallayarak biyopsiyi küçük parçalara ayırın. Doku bulamacını 25 santimetre karelik bir doku kültürü şişesine yerleştirin. Daha sonra primer fibroblast büyüme ortamını dokunun üzerine dökün.

Bu, şişenin yüzeyini kaplamak için yeterlidir, ancak dokunun yüzmesi için yetersizdir. Şişeyi %5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede üç gün boyunca inkübe edin ve ardından üç gün daha üç mililitre birincil fiberblast büyüme ortamı ekleyin. Kuluçka. Ortamı yeni birincil fiberblast büyütme ortamı ile değiştirin.

Hücreler neredeyse birleşikse, taze ortam içeren yeni şişelere bir ila dört oranında bölünebilirler. Sıçan kuyruklarını% 70 Etanol içinde yıkayarak başlayın, tendonları sıçan kuyruklarından çıkarmak için bir şişe 0.5 molar asetik asidi dört santigrat derecede soğutun. İlk olarak, her bir sıçan kuyruğunun derisini çıkarın.

Ardından, tendonu kuyruğun proksimal bölgesinin çekirdeğinden ayırın. Son olarak, diş forsepsleri kullanarak tendonu kuyruğun distal bölgesine doğru çıkarın. Tendonlar çıkarıldıktan sonra, bir cam konik şişeye 250 mililitre 0.5 molar asetik asit ekleyin.

Tendon çıkarıldıktan sonra 48 saat boyunca dört santigrat derecede karıştırarak 250 mililitre asit başına bir gram tendon çıkarın. Asit ve tendon çözeltisini dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 7.500 kez G'de santrifüjleyin ve ardından peleti atın. Daha sonra süpernatanıma hacim başına %10 ağırlık NACL eşit hacimde ekleyin ve ikinci karıştırma adımından sonra 30 ila 60 dakika daha karıştırın.

Çözeltiyi peletleyin. Bu kez 10.000 kez, G, süpernatanı atın ve kırmızı, çökeltiyi 0.25 molar asetik asit içinde dört santigrat derecede 24 saat daha fazla karıştırarak çözün. Daha sonra, kollajen çözeltisini altı litre yaklaşık 17.5 milimolar asetik asitten altı ila sekiz değişikliğe karşı diyalize edin.

Diyalizden sonra, kollajeni 1.5 saat boyunca 30.000 kez G'de peletleyin. Son olarak, supra natini steril bir şişeye aktarın ve önceden soğutulmuş 0.5 milimolar asetik asit ile kollajen konsantrasyonunu mililitre başına yaklaşık iki miligrama ayarlayın ve ardından kollajeni buz üzerinde tutun. İlk olarak, birleşik primer fibroblastlardan oluşan üç T 75 şişesi seçin.

Soğuması için dört santigrat dereceye kadar bir FCS kabı koyun. Daha sonra, önceden hazırlanmış 75 mililitre sıçan kuyruğu kollajenini 100 mililitrelik cam önceden soğutulmuş steril bir şişeye ekleyin. Ardından karışımı karıştırırken dokuz mililitre 10 XMEM ekleyin.

Son mililitreye yaklaşırken yavaşlayan altı mililitre 0.22 normal sodyum hidroksit ekleyin. Son rengin turuncu ve pembe arasında olmasını sağlamak için. Tripsin, fibroblastları gözler ve daha sonra hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 kez G'de peletler.

Sıkma sırasında 36 adet 35 milimetre plastik tabak monte edin. Peletleri önceden soğutulmuş FCS'nin 10 mililitresinde yeniden süspanse edin ve fibroblastları hemen kollajene ekleyin. 35 milimetrelik bir tabak başına yaklaşık 2,5 mililitre kollajen fibroblast karışımını mümkün olan en kısa sürede karıştırın ve karıştırın.

Kabarcıklardan kaçınmak ve kollajenin ayarlanması. Kollajenin gevşek bir jel oluşturmasına izin vermek için bulaşıkları 10 dakika inkübatöre yerleştirin ve ardından her yemeğe bir mililitre fiberblast büyüme ortamı ekleyin. Ardından, kollajen fiberblast matrisini bir pipet kullanarak tabağın kenarlarından ayırın ve bulaşıkları tekrar inkübatöre yerleştirin.

Ertesi gün, bulaşıklara bir mililitre daha Fiberblast büyüme ortamı ekleyin. Ardından, önümüzdeki sekiz gün boyunca medyayı iki günde bir değiştirin. Bu süre zarfında, her bir kollajen fibroblast matrisi, bir sonraki adıma başlamadan önce yaklaşık 3,5 santimetre ila yaklaşık 1,5 santimetre çapında kasılmalı, tüm forsepsleri ve ekipmanı etanol ile sterilize etmelidir.

Daha sonra künt sterilize edilmiş forseps kullanarak, sözleşmeli bir matrisi yavaşça 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna hareket ettirin ve matrisin katlanmadığından emin olun. Daha sonra, incelenecek bir hücre şişesi seçin, bıçakları açar ve hücreleri daha önce olduğu gibi topaklar ve daha sonra hücreleri, matrisin üstündeki hücre süspansiyonunun bir mililitresi olan ortam plakasında yeniden süspanse edin ve büzülmüş matrisi, hücreler matrisin tepesine kadar neredeyse birleşecek şekilde büyüyene kadar inkübatöre yerleştirin. Kullanımdan önce tripodların oluşturulması için önceden kesilmiş paslanmaz çelik ızgaraların otoklavlanmasından yaklaşık üç ila beş gün sonra, altı santimetrelik plastik bir tabak içindeki steril bir ızgara, ızgarayı kaplamak için yeterli büyüme ortamı ekler.

Hava sıvısı arayüzünün oluşturulması, bu prosedürün en hassas kısmıdır. Matris ızgara üzerine yerleştirilmeli ve daha sonra nazikçe bu ortam, matris hala kısmen alttan suya batırılacak ve alttan beslenecek şekilde aspire edilmelidir. Bu, kemotaktik bir gradyan oluşturur ve üstteki hücrelerin matrisi istila etmeye başlamasına izin verir.

Bu kurulumdaki hücre davranışı daha sonra 21 gün veya daha uzun bir süre boyunca değerlendirilebilir. Izgaraya bir matris yerleştirin. Ardından, matrisin alt kısmı medya ile temas edene kadar, ancak medya tarafından örtülmeyene kadar medyayı nazikçe aspire edin.

Hava sıvısı arayüzü daha sonra buradaki sahneye benzer görünmelidir. Ardından, sızmış bir matrisi düz bir yüzeye aktarın. Matrisi yeni bir neşterle ikiye bölün ve ardından matrisi neşterle kaldırın ve %4 PFA'ya aktarın.

Matrisi gece boyunca oda sıcaklığında sabitleyin Aşağıdaki iki şekilde, pankreas duktal adenokarsinom hücreleri veya P DAC hücreleri bir organotipik matris üzerine katmanlanmıştır. İlk şekilde, matriksin üstündeki bir tabakada non-invaziv P dac hücreleri görülebilirken, bu ikinci şekilde matrikse sızmış invaziv P dac hücreleri burada gözlenirken, fibroblast kasılmış kollajen dermal bileşen üzerinde tabakalı bir epidermisi gösteren canlı bir cilt eşdeğeri burada görülebilir. Yeşil renkli invaziv PD hücreleri, PDX hücrelerinin organotipik matrise istilasını teşvik eden kırmızı renkli fibroblastlarla etkileşime girerken görülebilir.

Burada yine yeşil renkle gösterilen invaziv PD hücreleri, ikinci harmonik nesil kullanılarak görüntülenen kollajen matrisi içinde görselleştirilir ve matris bozunmasının mor bölgelerinde gösterilen mor matris içinde koyu delikler olarak görülebilir. Bu şekilde C 8 1 61 fibroblast kasılmış kollajen dermal eşdeğerini istila eden melanom hücreleri gösterilmiştir, ayrıca bu test sırasında floresan proteinlerin temel süreçlerinin davranışına bakılmaktadır. Bu testi, hücre proliferasyon belirteçlerine ve hücre sağkalımındaki farklılıklara vb. bakmak için immünohistokimyasal boyama ile birlikte de kullanabilirsiniz.