Name: Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Keşfedin, organotipik kollajen matrisi kullanarak tümör hücrelerinin invazyon ve migrasyon davranışlarını 3 boyutlu ortamda nasıl analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, kanser metastazı ve tümör-stroma etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Cilt eksplantlarından fibroblast kültürlerinin oluşturulması <ol><li> 100 ünite / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 0.25 ug / ml Fungizone takviye insan önkol elde edilen 4 mm punch biyopsi MEM yerleştirilir. </li><li> Herhangi bir deri altı yağ Trim ve ince petri dibine bir dizi 24 Bistüri sallanan tarafından küçük parçalar halinde biyopsi doğrayın. </li><li> Şişenin yüzeyi kadar birincil fibroblast büyüme ortamı (MEM% 10 FCS, 100 ünite / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 25 ug / ml Fungizone ile desteklenmiş) ile 25 cm2 doku kültürü şişesi içinde yer doku bulamaç eklendi kapalı ama sıvı derinliği doku float için yetersizdir. </li><li> % 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfer içinde 37 3 gün inkübasyondan ° C ardından, birincil fibroblast büyüme ortamı olarak 3 ml eklenir. </li><li> Taze primer fibroblast büyüme ortamı ile başka bir 3 gün inkübasyon değişimi medya takiben veya cel eğerls onlar taze ortama 01:04 bölünebileceği neredeyse konfluent vardır. (Fungizone Bu noktadan itibaren ihmal edilebilir). </li></ol> 2. Evre I - sıçan kuyrukları gelen kollajen I hazırlanması Not: Yaklaşık 12-14 ergen (taze veya dondurulmuş) sıçan kuyrukları için protokol <ol><li> % 70 etanol içinde yıkanarak sıçan kuyruğu hazırlayın ve aşağıdaki gibi tendonlar kaldırın: </li><li> Ile yukarıdan aşağıya doğru kuyruk ortasında dilimleme sıçan kuyruk deri çıkarın bir neşter ve kuyruk uzunluğu boyunca pealing. </li><li> Kuyruk proksimal bölgenin çekirdek tendonu ayırın. </li><li> Dişli forseps kullanarak kılıfı kaçınarak kuyruk distal bölgeye yönelik tendonu çıkarın. </li><li> 48 saat için 4 ° C sıcaklıkta karıştırıldı, tendonun 1 g / L 0.5 M asetik asit, 250 ml çıkarın. </li><li> 30 dakika ekstraktı (7,500 xg) santrifüjleyin ve pelet atın. </li><li> Süpernatant% 10 eşit bir hacim (ağırlık / hacim) NaCl ekleyin ve 30-60 dakika için karıştırın. </li><li dakika i santrif xg s atmak ve c saat kar oran m asetik asit yeniden c.><li> 6L 6-8 değişikliklere karşı kolajen çözeltisi ~ 17.5 mM asetik asit (soğuk su litre başına 1 ml glasiyel asetik asit, değişim 2 x günlük) Dialyze. </li><li> 1.5 saat için 30.000 xg'de diyaliz kollajen santrifüjleyin. </li><li> Steril şişeye süpernatant ve yer çıkarın. </li><li> ~ 2 mg / ml arasında bir konsantrasyonda 4, 0.5 mM asetik asit kullanılarak ° C'ye ayarlayın kolajen </li></ol> 3. Evre II - gömülü fibroblastlar (8 gün için sözleşme için izin) ile 3D matris kurma. <ol><li> Önceden soğutulmuş bir şişe 4'te Soğuk reaktifler kullanarak ° C karışımı birleştirin. Buz üzerinde kollajen I tutun. </li><li> Konfluent birincil fibroblastlar biri T75 şişesi için (~ hücre sayısı 1 x 10 6) kullanımı: <ul><li> 25 ml fare kuyruk kolajeni (yaklaşık kons 2mg/ml) </li><li> 10x 3 miMEM </li><li> 0.22 M NaOH: Birincisi, 2ml, kollajen turuncu yanana kadar düşmesi-bilge iken, karıştırarak ekleyin </li><li> fakat pembe (genellikle en fazla 3 ml) eklenmiştir. Yaklaşık p H = 7.2. </li><li> Not: Hatta hafif alkali koşullara maruz kalırsa fibroblastlar jel sözleşme olmayacak gibi orta / jel nötral veya hafif asidik kalmasını sağlamak için önemlidir. </li></ul></li><li> , Fibroblastlar Trypsinise 5 dakika boyunca 400 xg'de spin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> 5 dakika boyunca üzerinde sıkma: 12 x 35 mm plastik tabaklar hazırlayın - normal fibroblastlar / kollajen karışımı bir şişeye 12 yemekleri ulaşmak. </li><li> 3 ml FCS fibroblastların yeniden askıya ve hemen kollajen karışıma ekleyin ve karıştırın. </li><li> Levha yaklaşık 2,5 ml tabak başına kollajen / fibroblast mümkün olduğunca çabuk. Kabarcıklar ve kollajen ayarını önlemek için deneyin. </li><li> Kollajen 10 dakika için hava içinde% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfer içinde 37 ° C 'de geçsin. </li><li> Fibroblast 1ml büyümeye ekleTh ortamı (DMEM +% 10 FCS). </li><li> Bir pipet kullanarak yemeğin taraftan kollajen / fibroblast matriks ayırın. </li><li> Ertesi gün: fibroblast büyüme ortamı (DMEM +% 10 FCS) 1ml ekleyin. </li><li> Her gün medya değiştirin. Onlar 24-iyi çanak uyum kadar, yaklaşık 8 gün boyunca sözleşme kollajen / fibroblast matriks İzin (çapı 1.5 cm ~ 3.5 cm Daralma, Şekil 1'e bakınız). </li></ol> Not: kolajen konsantrasyon uygulamasına uyacak şekilde ayarlanması gerekmektedir. Daha fazla kollajen çözüm sulandırmak, daha hızlı fibroblastlar yaptırılacaktır. Daralma oranı küçük farklılıklar, aynı konsantrasyonda kollajen farklı seri ile yaşanacaktır. Benzer şekilde, farklı fibroblast kültürleri farklı oranlarda kollajen jeller daralacağını, daha fibroblastlar sunmak, daha hızlı daralma oranı. Kollajen konsantrasyon ve fibroblast yoğunluğu dolayısıyla tarafından, daralma oranı değiştirmek için ayarlanabilir olabilirkollajen jel ve nihai yoğunluk. 4. Evre II - matris üstüne faiz Kaplama hücreleri Not: Kullanmadan önce etanol ile tüm forseps ve ekipmanları sterilize edin. <ol><li> Künt forseps kullanarak, hafifçe 24-iyi çanak sözleşmeli matris taşıyın. Bunu kat değil emin olun. </li><li> Matris üstüne yaklaşık 4 x 10 4 / ml ve plaka 1ml (tripsin kurtulmak trypsinising, spin hücreler sonra) ilgi hücrelerinin süspansiyonu hazırlayın. Ihtiyaç duyulan hücre tam sayısı kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişebilir. Hücre ortamı ilgi hücrelerin normal büyüme ortamı olmalıdır. </li><li> Hücrelerin matrisin üst, yaklaşık 3-5 gün izdiham büyümeye izin verin. </li></ol> 5. Evre III - işgali için bir ızgara (yaklaşık 0-21 gün) matris aktarılması <ol><li> Bir tripod oluşturmak ve (Bakınız Şekil 2) kullanmadan önce otoklav paslanmaz çelik ızgaralar kesin. </li><li> Steril ızgara yerleştirin6 cm çanak, ızgara üzerinde bir seviyede (yaklaşık 10.5ml) büyüme ortamı ekleyin. Yer ızgara üzerinde matris ve matris alt ortam maddesi ile temas halinde olduğu, ancak daldırılmayan kadar yavaşça ortam aspire. Bu istila teşvik eden bir eğim oluşturur hava / sıvı arayüz olarak adlandırılır. Her orta iki gün (Bakınız Şekil 2) değiştirin. </li><li> Canlı hücre floresan hücreleri kullanarak içeriksel görüntüleme bu aşamada veya daha erken de görüntülenebilir. Sözleşmeli veya fibriler kollajen ben ikinci harmonik üretimi (SHG, Şekil 3'e bakınız) kullanılarak görüntülenebilir. Biz sitoplazmik GFP ifade hücreleri en az 200 mikron derin imaged olabilir oysa SHG, matriks içine en az 100 mikron yansıması bulabilirsiniz geniş alan algılama ile birlikte çoklu foton uyarma kullanma. </li></ol> Not: istilası ölçümü ile ilgili olarak, Matris ızgara üzerine edildiği gün 0. Gün tanımlar. Izgaraların üzerine Yerleştirme işgali int teşvik hücre kültürü ortamı bir degrade üretir matris o. Örnekleri sonraki 1 üzerinde yansıması olabilir - 21 gün (veya daha uzun) gibi invazyon, çoğalma, hayatta kalma ya da farklılaşma (referans listesine bakınız) gibi biyolojik süreçleri değerlendirmek için. 6. Evre IV - Fiksasyon <ol><li> Falcon bir tüp içinde% 4 PFA 5 ml ilave edilir. </li><li> Bir düz yüzey üzerine matris aktarın. Taze temiz neşter (Eğer kesit boyama olacak gibi) ile yarıda matris Kes, gece boyunca düzeltmek, neşter ve% 4 PFA transferi ile matris kaldırın. </li><li> Organotipik matrisler artık antikor ile leke / (Bakınız Şekil 3) seçim leke hazırız. </li></ol> 7. Temsilcisi sonuçları: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil fibroblast ve petri kopuk ve 6-8 gün içinde sözleşme izin sıçan kuyruk kollajen fibroblast sözleşmeli kollajen I. Karışım 1 Örnek. Şekil 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/&gt; 2 Organotipik tahlil ilerlemesi Şekil. Organotipik kurulum ve progresyon A, şematik. B, paslanmaz çelik, hava / sıvı arayüzü oluşturmak için steril ızgara üstüne kollajen / fibroblast matris örneği. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Organotipik assay 3 Uygulamalar Şekil. A, B non-invaziv ve invaziv pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) hücreleri organotipik matris ile zamanla istila eder. C, fibroblast sözleşmeli kollajenöz dermal bileşeni katmanlı epidermis gösteren derisi eşdeğeri yaşıyor. D, C8161 melanom hücrelerinin işgalci bir fibroblast için kollajenöz Dermal eşdeğer. E organotipik matriks içinde etkileşim ve fibroblast (kırmızı) ile işgalci invaziv PDAC hücreler (yeşil)-daralmıştır. F

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Burada invaziv hücre göçü 6-8 çalışmalar için uygun bir 3-boyutlu matrisi üretmek için bir yöntem sunmaktır. Matris birincil insan epidermal fibroblastlar tarafından birkaç gün bir süre içinde sözleşmeli kollajen tip 1 fibrillerinin oluşmaktadır. Kollajen poli-peptit ucunda tepkime özelliklerini koruyan ve tampon koşulları 9 nötrleştirme üzerine daha büyük agregalar halinde kollajen fibrillerin çapraz bağlanma teşvik asit ekstraksiyon, değil enzimatik sindirimi ile hazırlanır. Daha yakından in vivo kolajen özelliklerini taklit eder ve jel içinde kültür hücrelerinin invazif özellikleri için önemli sonuçlara sahiptir yeniden oluşturulmuş jel elde edilir. Kollajen çapraz bağlama genç hayvanlarda daha kararsızdır çünkü taze veya dondurulmuş başlangıç ​​malzemesi kullanılıp kullanılmadığını önemli, ama ergen sıçan kuyrukları kullanmak değildir önemlidir. Kollajen Ben genç hayvanlardan elde etmek bu nedenle kolay ve w yeniden oluştururITH yüksek sadakat. Kolajen matris sabittir ve lekeli istilacı tümör hücreleri ya da stromal fibroblastlann 2,10 ya karşı yönlendirilmiş antikorlar ile ve istila 5,6 inhibe ilaçların etkinliğini test etmek için son derece yararlıdır edilebilir. Bu protokol, birincil insan derisi fibroblast kullanımını göstermektedir, ancak, bu araştırma altında doku tipine bağlı olarak, diğer doku tipi, ikinci birincil fibroblast kullanmak mümkündür. Bu stabil bir şekilde floresan protein konjugatları ile transfekte edilmiş olan hücreler de dahil olmak üzere ölümsüzleştirilmiş, fibroblastlar, kültürleri kullanılarak oluşturulması da mümkündür. Bu şekilde stromal tümör her iki hücre invazyonu 11 sırasında hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için etiketlenmiş olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 10x MEM </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> 367176-500G </td><td> Su içinde 0.22 M stok hazırlayın </td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA Laboratuvarlar </td><td> A15-101 </td><td> - </td></tr><tr><td> 35 mm yemekleri </td><td> Şahin </td><td> 353001 </td><td> Adım 3.4 için </td></tr><tr><td> 60 mm yemekleri </td><td> Şahin </td><td> 353004 </td><td> Adım 5.2 için </td></tr><tr><td> Bahar forseps künt </td><td> Samco </td><td> E003/02 </td><td> Düzgün değil, Dişli </td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td> Elektron Mikroskopi Hizmetleri </td><td> 15710 </td><td> Kullanımdan önce PBS içinde% 4 ile seyreltilir </td></tr><tr><td> Cd-1, boyutu 40 mesh için ekranlar </td><td> Sigma </td><td> S07707-5EA </td><td> Paslanmaz çelik ızgaralar, paket başına 5 </td></tr><tr><td> Diyaliz boru </td><td> Medicell Uluslararası </td><td> 7607 2295 </td><td> 12 - 14 kD </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Oxoid </td><td> BR0014G </td><td> - </td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> Sigma </td><td> 242853 </td><td> - </td></tr><tr><td> 24 de çanak </td><td> Şahin </td><td> 353047 </td><td> Adım 4.1 için </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Vitrogen In </td><td> 15290018 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

organotipik kollajen ben assay: 3-boyutlu bağlamında hücre davranışı değerlendirin a dövülebilir platformu

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Hücre göçü gelişimi, yara iyileşmesi, bağışıklık sisteminin hücresel yanıtları, ve tümör hücrelerinin metastaz gibi biyolojinin birçok yönleri için esastır. Göç ışık mikroskobu ile incelenmesi için mükellef hücresel dinamikleri yapmak için cam lameller üzerine çalışılmıştır. Ancak, hücre göçü birçok açıdan sadakatle cam ve plastik 1 gibi sert iki boyutlu yüzeyler tarafından temsil edilmeyen, elastikiyet, protein kompozisyonu ve gözenek boyutu dahil yerel çevrenin özelliklerine bağlı olduğu açık hale gelmiştir. Ayrıca, stromal fibroblastlann 2 ve 3 bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri ile etkileşimi kanser hücreleri istila teşvik edilmesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Moleküler düzeyde incelenmesi giderek karşılaştırıldığında aynı hücrelerin ilaç tedavisine yanıt dahil moleküler dinamik, önemli ölçüde farklı olduğunu göstermiştir <em&gt; In vitro ve in vivo 4. İdeal olarak, bu canlılar kendi doğal bağlamında hücre göçü incelemek için iyi olurdu, ancak bu her zaman mümkün değildir. Böyle hücre elde matrisi, Matrigel, organotipik kültürü (burada açıklanan) doku eksplant, organoids ve xenografts gibi Orta doku kültürü sistemleri, bu nedenle önemli deneysel ara vardır. Bu sistemler yaklaşık bazı in vivo ortamda yönlerini ancak böyle stably transfekte hücre hatları, ilaç tedavisi rejimleri, uzun vadeli ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı gibi deneysel manipülasyon için daha uygundurlar. Böyle ara sistemleri probları doğrulamak ve görüntü öncesinde vivo 5 görüntüleme üstlenen hücreleri ve floresan gazetecilere dinamik tepki için gerekli parametreleri kurmak Vaitoudden olarak özellikle yararlıdır. Bu nedenle, onlar livin üzerinde deney ihtiyacını azaltmada önemli bir rol hizmet edebilirg hayvanlar.

Bir yöntem olup kollajen tip I ve primer insan fibroblast oluşan bir 3-boyutlu matrisi hazırlanması için tarif edilmektedir. Bu doku stroma temel özelliklerini taklit eder ve mikroskopi birçok formları için müsait olduğundan bu organotipik jel invaziv hücre göçü değerlendirmek için yararlı bir substrat olarak hizmet vermektedir.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Hücre göçü; gelişim, yara iyileşmesi, bağışıklık sisteminin hücresel yanıtları ve ... dahil olmak üzere biyolojinin birçok yönü için temel teşkil eder.

Bu prosedürün genel amacı, hücre fonksiyonlarını incelemek için doku benzeri üç boyutlu bir kolajen matrisi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle sıçan kuyruk tendonlarından kolajen ekstrakte edilerek gerçekleştirilir. Ardından, fibroblastların kolajen jelile büzüştürebilmeleri için kolajen lifleri fibroblastlerin varlığında yeniden yapılandırılır.Üçüncü adımda, son aşama olarak tümör hücreleri matrisin üzerine yerleştirilir. Tümör hücrelerinin matris içerisine invazyonuna olanak sağlamak amacıyla, hava-sıvı ara yüzeyini oluşturmak için matris bir metal ızgara üzerinde inkübe edilir. Nihayetinde, tümör hücresi invazyonu ve farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimler dahil olmak üzere matris sentezi ve hücre göçünü analiz etmek için immünohistokimyasal boyama ve floresan mikroskopi uygulanabilir.Bu nedenle bu yöntem, invazyon ve metastazın yanı sıra tümör gelişiminin incelenmesi için idealdir. Karmaşık üç boyutlu bir yapıda farklılaşma, hücre sağkalımı ve hücre büyümesi gibi süreçleri gözlemleyebiliriz. Özellikle, tümör hücrelerinin invazyonun temel olayları sırasında stroma ile nasıl etkileşime girdiğini inceleyebiliriz.Kanser metastazının kendisinin en erken aşamalarından biri, cilt implantlarından fibroblast kültürleri oluşturmaktır. İlk olarak, bir Petri kabının tabanına penisilin, streptomisin ve fungi zone ile desteklenmiş MEM'den birkaç damla yerleştirin. Ardından, bir insan ön kolundan alınan dört milimetrelik punch biyopsileri kaba yerleştirin.Son olarak, 24 numara bir bistüri ucuyla petri kabının tabanına bastırıp sallayarak biyopsiyi küçük parçalara ayırın. Doku bulamacını 25 santimetrekarelik bir doku kültürü flakonuna yerleştirin. Ardından, dokunun üzerine primer fibroblast büyüme medyumu dökün.Bu miktar flask yüzeyini kaplamak için yeterlidir, ancak dokunun yüzmesini sağlamak için yetersizdir. Flasku, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de üç gün boyunca inkübe edin ve ardından üç günlük başka bir inkübasyon süresinin ardından üç mililitre primer fibroblast büyüme medyumu ekleyin. Medyumu taze primer fibroblast büyüme medyumu ile değiştirin.Hücreler neredeyse konfluen hale geldiyse, taze besiyeri içeren yeni flasklara birle dört oranında pasajlanabilirler. Sıçan kuyruklarını %70 Ethanol ile yıkayarak başlayın; kuyrukların tendonlarını temizlemek için 0,5 molar asetik asit şişesini dört derece Celsius'ta soğutun. İlk olarak, her bir sıçan kuyruğunun derisini soyun.Ardından, tendonu kuyruğun proksimal bölgesinin merkezinden ayırın. Son olarak, dişli pens kullanarak tendonu kuyruğun distal bölgesine doğru çıkarın. Tendonlar çıkarıldıktan sonra, cam bir erlenmayer içerisine 250 mililitre 0.5 molar asetik asit ekleyin.Tendon çıkarıldıktan sonra, 48 saat boyunca dört derece Celsius'ta karıştırarak 250 mililitre asit başına bir gram tendon ekstrakte edin. Asit ve tendon çözeltisini dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca 7.500 ×g hızında santrifüjleyin ve ardından peleti atın. Daha sonra, süpernatanta eşit hacimde ağırlık/hacim oranında %10 NaCl ekleyin ve ikinci karıştırma adımından sonra 30 ila 60 dakika daha karıştırın.Çözeltiyi çöktürün. Bu kez 10,000 ×g'de santrifüjleyin, süpernatantı atın ve çökeleği 0.25 molar asetik asit içerisinde 4 °C'de 24 saat boyunca daha fazla karıştırarak yeniden çözün. Ardından, kolajen çözeltisini yaklaşık 17.5 milimolar asetik asitten oluşan 6 litrelik çözeltinin altı ila sekiz kez değiştirilmesiylele diyalize edin.Diyalizden sonra kolajeni 1,5 saat boyunca 30,000 ×g'de pelletleyin. Son olarak, süpernatanı steril bir şişeye aktarın ve kolajen konsantrasyonunu önceden soğutulmuş 0,5 mM asetik asit ile yaklaşık iki mg/mL olacak şekilde ayarlayın, ardından kolajeni buz üzerinde muhafaza edin. İlk olarak, konfluen primer fibroblastlar içeren üç adet T 75 flask seçin.Bir kap FCS'yi soğuması için dört derece Celsius'a koyun. Ardından, önceden hazırlanmış 75 mililitre sıçan kuyruğu kolajenini, önceden soğutulmuş 100 mililitrelik steril bir cam şişeye ekleyin. Sonra, karışımı karıştırırken dokuz mililitre 10 XMEM ekleyin.Son mililitreye yaklaşırken yavaşlayarak altı mililitre 0,22 normal sodyum hidroksit ekleyin. Nihai rengin turuncu ile pembe arasında olduğundan emin olun. Trypsin fibroblastları ayırır ve ardından hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 ×g'de pelletleyin.Santrifüj sırasında 35 milimetrelik plastik kapları hazırlayın. Pelleti 10 mililitre ön soğutmalı FCS içinde yeniden süspande edin ve fibroblastları hemen kolajene ekleyin. Karıştırın ve yaklaşık 2,5 mililitre kolajen-fibroblast karışımını mümkün olduğunca hızlı bir şekilde her bir 35 milimetrelik kaba ekleyin.Hava kabarcıklarının oluşmasını ve kolajenin donmasını önleyin. Kolajenin gevşek bir jel oluşturmasına izin vermek için kapları 10 dakika boyunca inkübatörde bekletin ve ardından her bir kaba bir mililitre fibroblast büyüme ortamı ekleyin. Daha sonra, bir pipet kullanarak kolajen fibroblast matriksini kabın kenarlarından ayırın ve kapları tekrar inkübatöre yerleştirin.Ertesi gün, kaplara bir mililitre daha Fiberblast büyüme besiyeri ekleyin. Ardından, sonraki yaklaşık sekiz gün boyunca gün aşırı besiyerini değiştirin. Bu süre zarfında, bir sonraki adıma geçmeden önce her bir kolajen fibroblast matrisi çapının yaklaşık 3,5 santimetreden yaklaşık 1,5 santimetreye kadar büzülmüş olması gerekir; tüm pensleri ve ekipmanları etanol ile sterilize edin.Ardından, sterilize edilmiş küt uçlu pensler kullanarak, katlanmadığından emin olarak büzülmüş bir matriksi 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna nazikçe taşıyın. Daha sonra, incelenecek hücrelerin bulunduğu bir flaskı seçin, hücreleri daha önce olduğu gibi tripsinize edin ve pelletleyin, ardından hücreleri medyuma yeniden süspande edin; hücre süspansiyonundan bir mililitreyi matriksin üzerine ekleyin ve hücreler matriksin üstünde neredeyse konfluansa ulaşana kadar büzülmüş matriksi inkübatöre yerleştirin. Tripodların oluşturulması için önceden kesilmiş paslanmaz çelik ızgaraların otoklavlanmasından yaklaşık üç ila beş gün sonra, kullanmadan önce altı santimetrelik plastik bir kaba steril bir ızgara yerleştirin ve ızgarayı kaplayacak kadar büyüme medyumu ekleyin.Hava-sıvı ara yüzeyinin oluşturulması, bu prosedürün en hassas kısmıdır. Matris ızgara üzerine yerleştirilmeli ve ardından, matrisin alt kısmının hâlâ kısmen daldırılmış kalması ve alttan beslenmeye devam etmesi için ortam yavaşça aspire edilmelidir. Bu işlem, bir kemotaktik gradyan oluşturarak üstteki hücrelerin matrisin içine invazyon yapmaya başlamasını sağlar.Bu düzendeki hücre davranışı daha sonra 21 gün veya daha uzun bir süre boyunca değerlendirilebilir. Izgara üzerine bir matriks yerleştirin. Ardından, matriksin alt kısmı medya ile temas edene kadar ancak medya tarafından örtülmeyecek şekilde medyayı nazikçe aspire edin.Hava-sıvı arayüzü bundan sonra buradaki sahneye benzer görünmelidir. Ardından, infiltre edilmiş bir matrisi düz bir yüzeye aktarın. Matrisi yeni bir bisturi ile ikiye bölün ve ardından matrisi bisturi ile kaldırarak %4 PFA içerisine aktarın.Matrisi oda sıcaklığında gece boyunca sabitleyin. Takip eden iki şekilde, pankreatik duktal adenokarsinom hücreleri veya P DAC hücreleri organotipik bir matris üzerine tabaka halinde yerleştirilmiştir. İlk şekilde, non-invaziv P dac hücreleri matrisin üzerinde bir tabaka halinde görülebilirken; ikinci şekilde, matrise infiltre olmuş invaziv P dac hücreleri gözlemlenmektedir. Burada, fibroblastlarla kontraksiyon geçirmiş kolajen dermal bileşen üzerinde stratifiye bir epidermis gösteren canlı bir deri eşdeğeri görülebilir. Yeşil renkteki invaziv PD hücrelerinin, PDX hücrelerinin organotipik matrise invazyonunu teşvik eden kırmızı renkteki fibroblastlarla etkileşime girdiği görülmektedir.Burada tekrar yeşil renkte gösterilen invaziv PD hücreleri, ikinci harmonik üretimi kullanılarak görüntülenen kolajen matris içerisinde görselleştirilmiştir ve mor renkte gösterilmiştir; matris degradasyon bölgeleri, mor matris içindeki koyu delikler şeklinde görünmektedir. Bu Şekil C 8 1 61'de, fibroblast tarafından kasılmış kolajen dermal eşdeğerini istila eden melanoma hücreleri gösterilmiştir; ayrıca bu analiz sırasında floresan proteinlerin temel süreçlerinin davranışı da incelenmektedir. Hücre proliferasyon markerlarını ve hücre sağkalımındaki farklılıkları vb. incelemek için bu analizi immünohistokimyasal boyama ile birlikte kullanabilirsiniz.

organotypic-collagen-i-assay-malleable-platform-to-assess-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde...

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Bu protokol, lifleri bir 3D kollajen hidrojel (kalınlığı &lt;250 μm) hizalamak için uzatma gerinim (germe) oluşturmak için sıvı akış yönü boyunca değişen geometriye sahip bir mikroakışkan kanalın kullanımını göstermektedir. Ortaya çıkan hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır ve uzatma gerinim hızından etkilenir.

Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri

Burada, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü

Bu protokol, A549 alveolar epitel hücreleri ve MRC-5 akciğer fibroblastlarından organoid üretimini, hücre dışı matris hidrojel iskelesi üzerinde üretmeni, ardından 3D kolajen jellerine gömülüp hücre germe biyoreaktör kullanılarak mekanik gerilmeye maruz kalmayı ve alveolar mekanobiyoloji araştırmasını sunmaktadır.

Mekanik Hücre Esneme Biyoreaktörü kullanarak 3D Kolajen Gömülü A549/MRC-5 Alveolar Organoidlerin Üretimi

Keşfedin, organotipik kollajen matrisi kullanarak tümör hücrelerinin invazyon ve migrasyon davranışlarını 3 boyutlu ortamda nasıl analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, kanser metastazı ve tümör-stroma etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Daha fazla video keşfet