Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt İn Vitro Modeller

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı matris birikimini geliştirmek ve makromoleküler kalabalıklama kullanarak mevcut 2B ve 3B cilt modellerini iyileştirmektir. Kalabalıklaşma, yoğunlaştırılmış bir zaman diliminde hücre kaynaklı matrislerin ve olgun organotipik kültürlerin oluşumunu iyileştirir. Bu yöntem, doku mühendisliği alanındaki temel soruları cevaplayabilir, çünkü cilt ve diğer dokuların biyomühendisliği için hücre kaynaklı hücre dışı matrisler üretmenin gelişmiş yollarını sunar.

Bu tekniğin ana avantajı, hücre kaynaklı matrislerin ve organotipik deri yapılarının, bu kültürlere makromoleküler kalabalıklama uygulanırken önemli ölçüde yoğunlaştırılmış bir zaman diliminde oluşturulabilmesidir. Girişim yansıma mikroskobu tekniği, antikor boyamaya ihtiyaç duymadan toplam hücre dışı matris birikimini görselleştirmenizi sağlar. Bu tekniklerin uygulamaları, deri hücreleri tarafından hücre dışı matriks birikimi çalışmalarından, özellikle daha iyi deri eşdeğerlerinin üretilmesi ve greftleme için doku kültürü ile iyileştirilmiş yara tedavilerine kadar uzanacaktır.

Başlamak için, 50.000 primer fibroblast, primer keratinosit veya her ikisinin bir ko-kültürünü, bir mililitre orta pro kuyuda, 24 oyuklu bir plakanın kuyularına tohumlayın. Hücrelerin gece boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörde yapışmasına izin verin. Ardından, eski ortamı atın ve makromoleküler kalabalıklar ve 100 mikromolar askorbik asit içeren bir mililitre taze ortamla değiştirin.

Kültürleri altı gün boyunca kuluçkaya yatırın ve ortamı her iki günde bir değiştirin. Metin protokolüne göre immünofloresan ve Western blotlama yapın. Hücreden türetilmiş bir matris yapmak ve kullanmak için, hücreleri az önce gösterildiği gibi moleküler kalabalıklar ve askorbik asit ile altı gün boyunca kültürledikten sonra, hücre katmanlarını iki kez yıkamak için önce 1X PBS kullanarak hücreden türetilmiş bir matris elde etmek için hücre katmanlarını hücreden arındırın.

PBS'yi aspire edin ve ardından 250 mikrolitre% 0.5 sodyum deoksikolat ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Hücre lizatını aspire edin, daha sonra 250 mikrolitre daha %0.5 sodyum deoksikolat ekleyin ve 10 dakikalık inkübasyon ve aspirasyonu iki kez daha tekrarlayın. Hücreden türetilmiş matrisi iki kez yıkamak için damıtılmış su kullanın.

Suyu aspire edin ve ardından 1X PBS ekleyin. Matrisi bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. İkincil bir hücre süspansiyonu hazırlamak için, PBS'yi matristen aspire edin ve örneğin F matının üzerine 50.000 keratinosit tohumlayın.

Hücrelerin gece boyunca yapışmasına izin verin. Hücreden türetilmiş bir matris üzerinde girişim yansıma mikroskobu veya RIM gerçekleştirmek için, metin protokolüne göre bir kon-fokal mikroskop kullanarak görüntü elde edin. Bir hücre kültürü ekinde kapsüllenmiş fibroblastlar içeren bir kollajen jeli dökmek için, 10 mililitre sıçan kuyruğu kollajen tip birini soğuk bir behere alikot edin.

Asidik kollajeni nötralize etmek için bir mililitre soğuk DMEM ve 0.5 mililitre bir molar sodyum hidroksit ekleyin. Sonra 0.5 mililitre fibroblast süspansiyonu ekleyin. Soğuk bir pipet kullanarak, 12 mililitre çözeltiyi altı oyuklu bir kültür plakasındaki hücre kültürü eklerine eşit şekilde bölün.

Jeli 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat inkübe edin. Jel katılaştıktan sonra, fibroblast ortamına veya FM'ye daldırın. Daha sonra 24 saat inkübe ettikten sonra FM'yi aspire edin. Hücre kültürü ekinin içine iki mililitre ve hücre kültürü ekinin dışına iki mililitre ekleyerek eski FM'yi değiştirmek için makromoleküler kalabalıklar içeren dört mililitre taze ortam kullanın. 24 saatlik bir inkübasyonun ardından, keratinositleri trysonize etmek için% 0.125 tripsin hile maddesi kullanın.

Hücreleri yerinden çıkarmak için şişenin kenarlarına hafifçe vurun ve tripsini nötralize etmek için serum içeren ortam ekleyin. Hücreleri saydıktan sonra, bir keratinosit süspansiyonu hazırlayın. Daha sonra, ortamı hücre kültürü eklerinden aspire edin ve keratinositleri jelin üstüne ekleyin.

Jeli bir saat inkübe edin. Keratinositler jel yüzeyine bağlandıktan sonra, hücreyi jel kültürü ekinin içine daldırmak için iki mililitre KSFM veya CTN-57 serumsuz ortam kullanın ve hücre kültürü ekinin dışına iki mililitre FM ekleyin. 24 saatlik bir inkübasyonun ardından, eski ortamı atın ve makromoleküler kalabalıklar içeren yeni ortamla değiştirin.

Batık kültürde yedi gün sonra, kültürü bir hava-sıvı arayüzüne yükseltmek için, kültür ekini derin bir kuyu plakasına aktarın. Hücre kültürü ekinin dışına 10 mililitre tabakalaşma ortamı ekleyin ve ekin içini kuru tutun. Son olarak, kültürleri kuluçkaya yatırın ve ortamı 14 gün boyunca her üç günde bir değiştirin.

Bunları metin protokolüne göre hasat edin ve işleyin. Burada gösterildiği gibi, makromoleküler kalabalıklaşma, fibroblastların kontrol kültürlerine kıyasla daha fazla hücre dışı matris veya ECM biriktirmesine izin verdi. Sekülerleşme üzerine, fibroblastların kollajen bir, kollajen dört ve fibronektinin ana depozitörleri olduğu açıktı.

Bu rakam, kollajen yedi'nin ana depozitleri olan keratinositlerden ziyade fibroblastlar olduğunu göstermektedir ve bu, in vitro olarak başarılı kollajen yedi birikiminin ilk raporudur. RIM kullanılarak, hücreden türetilmiş matrisin tam kapsamı yakalandı. RIM görüntüsünün antikor boyaması ile kaplanması, toplam ECM miktarına göre o ECM bileşeninin nispi miktarını gösterir.

3D in vitro cilt modelinde, makromoleküler kalabalık veya MMC, olgun bir organotipik cilt ko-kültürü elde etmek için kültür süresini beş haftadan üç haftaya kısalttı. Burada görüldüğü gibi, H ve E boyama ile, üç haftada, MMC'li kültür, plörestratifiye bir epidermis ve bir stromol sırt dermisinden oluşuyordu. Ek olarak, kalabalık hücre kültürlerinin dermalepidermal bileşkesinde, kontrol kültürlerinde zayıf ve sivilceli bir kollajen yedi immün boyamaya kıyasla yoğun ve sürekli kollajen yedi immünoboyama tespit edildi.

Transmisyon elektron mikroskobu ayrıca MMC ile oluşturulan organotipik kültürlerde ankraj fibrillerinin varlığını gösterir ve fonksiyonel kollajen yedi gösterir. Hücreden türetilmiş matrisler, hücre dışı matrisin karmaşıklığı korunduğundan ve hücrelerin kendileri tarafından üretildiğinden, alternatif bir iskele olarak ikincil hücre tohumlama amaçları için kullanılabilir. Makromoleküler kalabalıklaşma altında oluşturulan organotipik deri kültürleri, bir stromal sırt dermisi, bir majör dermalepidermal bileşke ve bir plörestratifiye epidermis içerdiğinden geliştirilmiş bir 3D deri modeli olarak kullanılabilir.

Makromoleküler kalabalıklarla oluşturulan organopik veya cilt eşdeğeri kültürler, greft başarısını artırması muhtemel olan daha iyi gelişmiş bir dermalepidermal bileşkeye sahip oldukları için deri greftleme için de kullanılabilir. Gelişmiş hücre dışı matris birikimine ek olarak, reaktif miktarını artırmak zorunda kalmadan, hız sınırlı reaksiyonları geliştirmek için diğer in vitro sistemlere makromoleküler kalabalık uygulanabilir. Örneğin, polimeraz zincir reaksiyonları.