Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Daha önce yapışık hücrelere mekanik zorlanma uygulamak için bir cihaz tasarladık. Mevcut çalışmada, substratum geometrisini yeniden tasarladık ve bu gerinim hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kurulum özelleştirilmiş. Bu hücre germe sisteminin en büyük avantajı, gerinim hücrelerinin 100x'inde yüksek çözünürlüklü hücre altı görüntüleme sağlamasıdır.

Substratum imalatını gösteren Vicki, laboratuvarımdan araştırma görevlisi. Eşlik eden metin protokolü ile birlikte takip ederek tek iyi polidimetilsiloksane kalıp tasarlayarak başlayın. Daha sonra, tek kullanımlık bir fincan bir parçası kür ajan ile bir polidimethylsiloxane baz 20 parça karıştırın.

Bir kez karıştırılır, karışımı kabarcıklar kaldırmak için 0,8 bar 30 dakika bir vakum de-gasser polidimethylsiloxane karışımı yerleştirin. Sonra, kalıp ve çanak içine polidimethylsiloxane karışımı dökün. 30 dakika boyunca 0,8 bar vakum tekrar gaz gidererek bu aşamada herhangi bir ek kabarcıklar çıkarın.

Gaz giderme tamamlandığında, numuneleri 80 derecede bir tesviye masasında iki saat pişirin. Daha sonra, dikkatle fırından örnekleri çıkarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bir bıçak ile kenarları kesin ve yavaşça tedavi poliditilsiloxane soyma.

150 milimetre çapında polidimethylsiloxane, bir marker ile iki santimetre ızgara iki santimetre çizin. Her kare içinde, her tarafta 0,5 santimetre lik bir marj bırakarak, bir santimetre kare bir santimetre çizin. Dikkatle çizgiler boyunca kesmek ve kare bölmeleri elde etmek için bir bıçak kullanın.

Daha sonra, dört saat boyunca% 100 aseton içinde kuluçka tarafından örnekleri temizleyin, ek dört saat için% 100 etanol, ve daha sonra dört saat otoklavlı suda. Temizlenmiş numuneleri 150 milimetre çapındaki plastik bir tabağın içine parafin film destek kağıdına yerleştirin ve numuneyi dört saat boyunca 80 derecelik bir fırında kurulayın. Bittiğinde, parafin film ile yemekleri mühür ve daha fazla kullanıma kadar soğuk bir odada saklayın.

Progenitor hücreleri hazırlamak ve çoğalma orta onları askıya. PdL kaplı plastik yüzeyler üzerine santimetre kare başına 35,000 hücre yoğunluğunda bu hücreleri tohum. Çoğalma ortamının hacmini yüzey alanının 10 santimetre karesi başına üç mililitreye ayarlayın.

Daha düşük bir ortam hacmi yüzey gerilim kuvvetlerinden kaynaklanan hücre kümelenmelerine yol açarken, tabaklarda daha yüksek bir ortam hacmi ortamın dökülmesine neden olabilir. Tohumlama dan sonra üçüncü gün, hücreleri hasat ve bir hemositometre kullanarak saymak. Daha sonra, tohum 35, 000 hücre polidimethylsiloxane plaka başına 700 mikrolitre proliferasyon orta ile.

Daha sonra, üreticinin yönergelerini izleyerek hücrenin histon H2B komplekslerini yeşil floresan proteinle etiketlemek için plazmik bir yapı ekleyin. 24 saat sonra, polidimethylsiloxane örneklerini tek eksenli gerinim cihazına gerilecek hücrelerle monte edin. Daha sonra, tüm örneklerdeki ortamı farklılaşma ortamına çevirin.

Zorlanmamış hücre bölmesi uzunluğunu ölçün ve hücre bölmesi uzunluğunu istenilen miktarda gerilme yle artırmak için sahne mikrometre vidasını çevirin. Gerilmiş ve gerilmemiş polidimethylsiloxane örneklerini görüntülemeye kadar 37 santigrat derecede kuvözde bırakın. Kuvöz sıcaklığını 37 dereceye ayarlayarak mikroskop inkübatörünü canlı görüntülemeye hazırlayın.

Daha sonra, 100x petrol daldırma hedefini merkezi konuma getirin, çünkü nesnel dönüş daha sonra erişilemeyecektir. Bir kez pozisyonda, objektif sökmek ve objektif bir halka ile birlikte vida, böylece objektif hücrelere yakın getirilebilir. Sonra, objektif yağ bir damla ekleyin.

Özel baskılı tutucu kullanarak, pencerenin çevresinde vakum gresi ile tutucuyu katlayın ve tutucunun üst yüzeyine sıfır numaralı kalınlıkta cam kapak kaydırın. Plastik pencereyi mikroskop aşamasına bantlayın. Daha sonra, bir Z çeviri sahnesini mikroskop aşamasına vidala ve en üstteki Z konumuna taşıyın.

Görüntülenecek gerilmiş polidimethylsiloxane plaka dan orta 500 mikrolitre çıkarın ve beyaz plastik pencerede cam kapak üzerine bu orta ekleyin. Daha sonra, polidimethylsiloxane plakadan kare bölmeyi dikkatlice ayırmak için bir çift steril cımbız kullanın. Gerinim cihazını, hücrelerin yukarı, beyaz plastik pencerenin üzerinde bakacak şekilde dik bir pozisyonda tutun ve gerinim cihazını dikkatlice tersine çevirin, böylece hücreler aşağı bakacak şekilde cam örtünün ortasına herhangi bir ekstra ortamın düşmesine izin verin.

Gerinim cihazının alt kısmını, yerinde tutmak için çift taraflı bant kullanarak Z çeviri aşamasına yerleştirin. Parlak alan altında göz parçası üzerinden bakarken, çok yavaş gerinim cihazı aşağı getirmek ve hücrelere odaklanmak için hedef yukarı taşımak. Z çeviri aşamasının düşürülmesi ile hedefin yükseltilmesi arasında dönüşümlü olarak bu odaklama adımını yavaşça gerçekleştirin.

Z çeviri aşaması çok fazla düşerse, hücreler sıkıştırAbilir ve dolayısıyla ölebilir. Eğer hedefi çok yükseltirsek, cam kapak kaymasını kırabilir ve ortamın sızdırılmasına neden olabilir. 488 nanometre uyarma epiflorescence kullanarak, bir floresan çekirdeği olan bir hücre bulmak için X ve Y yönde polidimethylsiloxane plaka tarayın.

Ayrıca, parlak alan altındaki örneğe bakarken hücrenin uygun bir morfolojiye sahip olduğundan emin olun. Toplam 30 dakika boyunca 488 nanometre dalga boyu uyarma ve parlak alan uyarma ile hücrenin geniş alan veya açık iğne deliği görüntülerini kare başına 30 saniyearalıklarla kaydedin. Polidimethylsiloxane substratumun yeniden tasarlanmış geometrisi ve bu videoda gösterilen görüntüleme kurulumu hücreler ile amaç arasındaki mesafeyi en aza indirir.

Bu, 100x yağ daldırma amacı kullanarak floresan etiketli hücre çekirdeklerinin zaman atlamalı görüntüleme sağlar. Nükleer dalgalanmaları ölçmek için önce nükleer alanı zamana karşı planla. Daha sonra, üçüncü dereceden bir polinom kullanarak verilerin detrend'ini verin.

Ve son olarak, artık dalgalanmaları çizin ve kalan dalgalanmaların standart sapmasını hesaplayın. Oligodendrocyte progenitor hücrelerinin nükleer dalgalanmaları, %10'luk bir çekme gerilimi ile ve %10 çekmesüz diferansiyasyonun kimyasal indüksiyonunu takiben, sadece kimyasal indüksiyonla nükleer dalgalanmaların genliği 48 saatte önemli bir düşüş gösterdiğini göstermektedir, ancak 24 saat değil. Diğer taraftan, kimyasal indüksiyon %10 çekme gerilimi ile birlikte 24 saatte önemli bir azalma gösterdi ve 48 saat daha fazla azalma olmadan sabit kaldı.

Unutulmaması gereken en önemli şey, seçilen hedefin çalışma mesafesinin hücre bölmesi derinliğine ve kapak kaymasının kalınlığına eşit veya daha büyük olması gerektiğidir. Substratum, önceki ve sonraki veri kümesi türü deneysel hatadan kaynaklanan gürültüyü azalttığından, zorlanma uygulamasından önce ve sonra aynı hücrenin görüntülenmesikolaylaştıracak bir ızgara yı dahil edecek şekilde yeniden tasarlanabilir. Bu görüntüleme kurulumu kullanılarak, protein lokalizasyonu veya hücresel bileşenlerin dinamiği gibi yapışık canlı hücrelerdeki birçok hücre altı fenomen, mekanik zorlanmanın uygulanmasından saniyeler sonra görüntülenebilir.