Name: Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Keşfedin mekanik gerilme altında canlı hücre görüntüleme yöntemini fare akciğer epitel hücreleri kullanarak. Bu protokol, hücre mekanobiyolojisini gerçek zamanlı gözlemleyerek hasar ve sertlik değişikliklerini analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, desteklerinden dolayı Memphis Üniversitesi&#39;nde Teknoloji Fedex Enstitüsü&#39;ne teşekkür isterim. Yazarlar Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer) Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü&#39;nde kıdemli tasarım proje grubunun öğrencileri kabul etmek istiyorum, motor kontrolü için University of Memphis Mühendislik Teknolojisi bölümünden Daniel Kohn Hücre kültüründe yardım ettikleri için, Dr. Bin Teng ve Bayan Charlean Luellen. Bu eser K01 HL120912 (ER) ve R01 HL123540 (CMW) tarafından desteklenmiştir.

Tutma Hücre Kültürü Medya Kuyu Walls (nihai ürün için Şekil 1D bakınız) Membran 1. İnşaat <ol><li> Kollajen I ile kaplanmış polidimetilsiloksan (PDMS) yaprak kullanarak, neşter veya bir kalıp esnek membran hatlarını kesti. </li><li> Depolanması için bir 60 mm Petri kabı, her membran yerleştirin. </li><li> Duvarların Oluşturma: <ol><li> B (sertleştirici) elastomer elastomer A: 1 ağırlık oranında, bir 10 PDMS karıştırın. </li><li> 50 ml tüpler içine tam olarak karıştırılır PDMS 5 ml dökün. </li><li> Yatay bir hibridizasyon fırında sertleşmemiş PDMS ile 50 ml&#39;lik tüpler yerleştirin. </li><li> Kür süresinde 8 rpm&#39;de kaplamak için tüplerin iç duvarları rotor işlevini kullanın. Oda sıcaklığında, PDMS tam 2 gün içinde tedavi edilecek. </li><li> Steril hücre kültürü kaputu tüpten PDMS çıkarın. </li><li> Yeni bir jilet kullanarak, bölümlerde yüksekliği 4 mm içine PDMS silindir bölümlemek. </li><li> Membran wa olarak görev yapacak bölümleri, koyunlls, izin vermeden bir Petri kabı kabına duvarları buruşuk olmak. </li></ol></li><li> Petri kabındaki iki korurken, bir zar üzerinde PDMS bir duvar seçin ve merkezi. </li><li> Tutkal olarak kullanılmak üzere, duvarın dış çevre üzerinde (1 oranında 10) hafifçe sertleşmemiş PDMS yerleştirin. Bu sıvı tutmak için olmadığı duvar ve zar arasındaki boşluk oluşmasını önler. </li><li> Her petri çanağı tamamlanmış membran içeren ve tedavi etmek için 24 saat boyunca 70 ° C&#39;de bir fırın içinde kapalı bir yer. </li></ol> Kalibrasyon için Kelepçe Yerinden veya Radyal Büyüme (Şekil 2) Motorlu Münavebesindeki 2. Korelasyon <ol><li> Motorun kontrol yazılımını başlatın. </li><li> Motor yazılımı manuel ayarını kullanarak cihazın kelepçeleri yerinden. </li><li> Mesafeyi ölçün ve kelepçeler minimum ve maksimum deplasman hem de kelepçeler karşıt arasındaki motor sayısı konumunu kaydedin. </li><li> D yüzde değişim hesaplayınMotor sayımı (~ 0-75k sayımları) &#39;in bir fonksiyonu olarak kelepçeler arasında istance. Bu membran üzerinde elde edilen maksimum potansiyel gerginlik gösterecektir. </li></ol> Fare Akciğer Epitel Hücre Hattı Stretch 3. Uygulama (MLE12) <ol><li> Oyuk başına esnek bir zar üzerinde 2.500.000 hücreleri (Aşama 1) Tohum MLE12 hücreler iki gün içinde birleşmiş olması. tohum yoğunluğu farklı hücre tipleri için farklı olabilir. </li><li> Mekanik aktüatör tamamen rahat bir konumda olduğundan emin olun. <ol><li> Hücre kültürü ortamı çıkarın. </li><li> Altı kelepçenin her iki delikler, 1.5 mm biyopsi kalıplar kullanılarak membran çıkıntıları (Şekil 1D bakınız). deliklerin radyal yerleştirme membran deneyimleri başlangıçta ön gerilim miktarını belirler. Hiçbir ön gerilim isteniyorsa membran sekmelerde 20.5 mm yarıçapında delikler. </li><li> Delikli delik kelepçeler içinde iğne ile sıraya ile sedye üzerinde membran yerleştirin.Yerde üst kelepçeleri yerleştirin. Vidaları zaman alternatif tarafta bir tane sıkın. </li><li> 1 ml hücre kültür ortamı ekleyin. </li></ol></li><li> Işık yolu ile membran orta merkezleme mikroskop sahnede cihazı yerleştirin. </li><li> Sahneye cihazı sabitlemek için bant veya mıknatısları (mümkünse) kullanın. Bir kez, sabit, mikroskop aşamasında kontrol ünitesi ile mekanik bir cihazın düzlem (zara paralel) ve dikey (z-yönü) kontrol eder. </li><li> Manuel motor dönüş 20 konumunu ve hızını kontrol ederek üretici tarafından sağlanan yazılım ile streç uygulayın. </li></ol> Mitokondriyal reaktif oksijen türlerinin 4. Ölçüm (ROS) <ol><li> Hücreler birleştiklerinde, sonra, doğrudan hücrelerde mitokondriyal süperoksit göstergesi (5 uM nihai konsantrasyon) ile RT DMEM 1-2 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Yıkama Hücreler nazikçe tampon maddesi ile üç defa bir su banyosu içinde ısıtılmıştır37 ° C. </li><li> Hemen dik konfokal mikroskop altında zaten yerinde sedyeye (Adım 2.2) esnek membran yerleştirin. </li><li> Fenol-kırmızı içermeyen ortamda ve HEPES 25 mM DMEM 1 ml ilave edilir. </li><li> 510/580 nm uyarım / emisyon filtreleri ayarlayın. </li><li> Görüntü birden alanlar her 15 dk mitokondriyal süperoksit üretiminin istenilen zaman ders oluşturmak için. </li><li> Çekilen görüntülerin itibaren, rekor floresan yoğunluğu floresan yoğunluğu miktarının yeteneğine sahip yazılımı kullanarak her zaman aralığında histogramlar. </li></ol> Streç ve Atomik Kuvvet Mikroskobu 5. Uygulama (AFM) Not: Bu adımlarda, belirli bir AFM ve optik mikroskop kombinasyonu (Şekil 4 ve Malzeme Listesi) için verilmiştir. <ol><li> Deney için AFM hazırlayın. <ol><li> Z-doğrultusunda maksimum pozisyona AFM baş yüksekliğini artırın. </li><li> AFM ayakları üzerine genişleticiler koyUçağı kaldırmak hangi AFM konsol temas örnek de. Numune ve AFM kafası mekanik bir cihaz yüksekliğine uyacak kaldırılması gerekir. </li></ol></li><li> (Varsa) optik mikroskop hazırlayın. <ol><li> AFM tarayıcı plakasını sökün. İstenilen hedefe çıkarın. </li><li> Amaç için bir ayırıcı ekleyin. aralama yüksekliği objektif ve belirli AFM set-up bağlı olacaktır, ancak gözlem uçağı sedye ve adaptör yüksekliği (Şekil eşit miktarda z-yönünde kayma olacağından optik görüntüleme isteniyorsa gerekli olduğunu 5A). AFM genellikle cihazın üzerinde bir optik yolundan düşük büyütme görüntüleme sağladığını unutmayın. </li><li> Konumu istenen amaç geri monte edin. AFM geri tarayıcıyı yerleştirin. </li><li> AFM yazılımını başlatın. Floresan ölçümleri için ışık kaynağı dahil gerekli bütün ışık kaynakları başlatın. </li><li> Bir konsol kiriş ile bir çip monte olduğunuarzu edilen ölçümler için uygundur. Canlı hücrelerin elastik modülü ölçerken 200 pN / nm ya da daha az sertlik tercih edilmektedir. </li><li> Lazer hizalama ve cihaz üzerine monte edilmiş bir cam lamel üzerinde üreticinin önerilerine göre konsol sertliği kalibre. </li></ol></li><li> Aşama 1 &#39;de olduğu gibi bir zar hazırlama, ancak şu değişiklikler yapılmıştır. <ol><li> Hemen germe aygıtının için membran takmadan önce, yüksekliği yaklaşık 1 mm duvar kesti. Bu membran duvar ve yük hücresi arasında yaşanan girişimi önler. </li><li> 3.2.1-3.2.3 tarif edildiği gibi mekanik bir cihaz ile ilgili membran monte edin. </li><li> Bir dökülme durumunda AFM tarayıcı zarar görmesini önlemek için hücre kültürü ortamı çıkarın. </li><li> Çift bir adaptör (Şekil 5A) ile bir cihaz. Tarayıcının adaptörle mekanik cihaz yerleştirin. </li><li> İstenen gerilme gerinim seviyesine membran gerin. </li></ol></li><li&gt; Gergin hücrelerin Nano-girinti. <ol><li> Nedeniyle dökülme için AFM tarayıcı veya mikroskop zarar görmesini önlemek için hücreler üzerinde medya sınırlı (&lt;0.5 ml) hacmi ekleyin. </li><li> Membran ile konsol kiriş Engage. </li><li> Ilgi alanları taramak için belirli AFM cihazının protokolünü izleyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+new+opportunities+in+lung+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology.</a> J Biomech. 43, 99-107 (2010).</li>
<li>Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+CM+%22Comprehensive+Physiology%22">Comprehensive Physiology</a>. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Sensitivity+and+Mechanotransduction+during+Heart+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development.</a> Current Biology. 24, R495-R501 (2014).</li>
<li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475, 316-323 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell-surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force-induced+signal+transduction+in+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical force-induced signal transduction in lung cells.</a> Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).</li>
<li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in mechanotransduction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).</li>
<li>Chapman, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cyclic+opening+and+closing+at+low-+and+high-volume+ventilation+on+bronchoalveolar+lavage+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Car+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines.</a> Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).</li>
<li>Tschumperlin, D., Margulies, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+deformation-induced+injury+of+alveolar+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro.</a> Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).</li>
<li>Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+failure+in+ventilator-injured+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular stress failure in ventilator-injured lungs.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).</li>
<li>Roan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+alters+the+mechanical+properties+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).</li>
<li>Gamerdinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+load+and+mechanical+integrity+of+lung+cells+-+Experimental+mechanostimulation+of+epithelial+cell-+and+fibroblast-monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).</li>
<li>Hayashi, K., Naiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+remodeling+of+vascular+wall%3B+biomechanical+response+to+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).</li>
<li>Villemure, I., Stokes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+mechanics+and+mechanobiology.+A+survey+of+present+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding.</a> J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).</li>
<li>Waters, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+impose+prescribed+homogenous+strains+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells.</a> J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).</li>
<li>Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+simultaneous+live+cell+imaging+during+uni-axial+mechanical+strain+or+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression.</a> J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).</li>
<li>Dassow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+measure+mechanical+properties+of+pulmonary+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).</li>
<li>SmartMotor User's Guide v523. , Animatics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf ">http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf </a> (2011).</li>
<li>Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).</li>
<li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> J Physiol. 552, 335-344 (2003).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+single+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Pouvreau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+mouse+skeletal+muscle+are+produced+by+discrete+arrays+of+active+mitochondria+operating+coherently%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Yalcin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+on+epithelial+cell+injury+during+cyclic+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).</li>
<li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+claudin+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4.</a> J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).</li>
<li>DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+magnitude+and+frequency-dependent+actin+cytoskeleton+remodeling+in+alveolar+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Mekanik streç sırasında canlı hücre görüntüleme için benzersiz bir cihaz geliştirildi; ve bu cihaz, akciğer epitelyal hücre mechanobiology incelemek için bir protokol kullanılmıştır. Ön çalışmalarda, tek tutulan streç bronşiyal epitel hücrelerde mitokondrial süperoksid üretimini uyardığı tespit edildi. Buna ek olarak, mekanik zorlanma artmış seviyeleri alveolar epitel hücrelerinin bir tek tabaka bütünlüğü doğrudan bozukluklara sebep olduğu gösterilmiştir. Bu ön deneyler için, aygıt önce kali...

Hücreler, bir çok dokuda mekanik yüklere maruz kalır ve bu, mekanik uyarma gen ekspresyonu, büyüme faktörleri, sitokinler, ya da hücre dışı matrisin yeniden verildiği şekillerindeki değişiklikleri teşvik etmek ve 1-4 hücre iskeletinin gösterilmiştir. Bu tür mekanik uyarıcılara karşı hücre içi sinyallere mechanotransduction 5-7 işleminde meydana gelir. Solunum sisteminde, mechanotransduction bir sonucu, reaktif oksijen türlerinin (ROS), siklik bir çekme gücü mevcudiyetinde pulmoner epitel hücrelerinde 8,9 ve pro-inflamatuar sitokinlerin 10 artıştır. Güçlü kanıtlar ayrıca aşırı gerilim soyu hücrelerinin 11-14 biyokimyasal yanıtların yanı sıra, alveol epiteline yaralanması doğrudan yol açtığını göstermektedir. Odak Burada mekanik deformasyon akciğer hücrelerinin yanıtı esas olmasına rağmen, mechanotransduction neden yollar bas önemli bir rol oynardamar tonusu 15 düzenlenmesinde ve büyüme plağının 16 geliştirilmesi dahil olmak üzere insan vücudunda birçok dokuda, bir ic fonksiyonu. mechanotransduction artan ilgi kültürlenmiş hücreler ve doku için fizyolojik olarak ilgili mekanik yüklerin uygulanması için çok sayıda cihazı geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. Özel olarak, doku tarafından yaşanan mekanik yüklenme ortak bir biçimi olan bir çekme gücü, uygulama tertibatının 11,17-19 popülerdir. Ancak, mevcut cihazların çoğu ya doku mühendisliği uygulamaları için biyoreaktör olarak tasarımlanmış veya streç ile gerçek zamanlı görüntüleme için elverişli değildir. Bu nedenle, mechanotransduction arasında yolların araştırılmasını kolaylaştırmak için gerilim hücre ve dokuları görselleştirmek araçları ve yöntemlerinin geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Burada, bir düzlem mekanik germe cihazı tasarlanmıştır ve protokoller m uygulamak için geliştirilmiştirultiple dokulara soyunun formları ve hücreler, gerçek zaman (Şekil 1A-D), biyokimyasal ve mekanik yanıtların görüntüleme imkan verir. Cihaz, esnek bir membran kavramak ve yaklaşık% 20 (Şekil 1B) bir düzlemsel radyal distansiyon yukarı uygulamak için çevresel olarak yerleştirilmiş olan eşit aralıklı kelepçeler kullanılmaktadır. Motor (Şekil 1C) inkübatör dışına yerleştirilmiş ve motor satıcı tarafından sunulan özel yazılım tarafından kontrol edilir ise çalıştırma tertibatı, uzun bir zaman süresi için bir hücre kültürü inkübatöründe yerleştirilebilir. kas gerginliği ve gevşeme eşit altı sedye kelepçeler sürüş bir iç cam döner lineer sürücü bağlanır. Mekanik cihaz ek olarak, özel esnek zarların mekanik bir sistemde kullanılmak üzere ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü hazır zarlarından oluşturulmuştur. Yaklaşık bir çapı olan, dairesel sonra duvar (28 mm) yapılmıştır ve hücreler, sadece iyi tarif edilen suş profili bu bölgede kültürlenebilir böylece esnek bir zar üzerine bağlanmıştır. Harekete geçirme cihazı içinde bu membranların yerleştirilmesi, esnek bir zarın merkezinde tek tip ve izotropik streynini sağlayabilir olup olmadığını belirlemek için, sonlu eleman analizi, ticari olarak temin edilebilen yazılımı (Şekil 1E-F) kullanılarak yapıldı. Esnek zar simetrik sınır koşulları ve örgü için tüm dörtgen elemanlar kullanan ile modellenmiştir. Şekil 1F gösterilen maksimum asal zorlanma kontur arsa görülen eş halkalar zorlanma izotropik dağılımını göstermektedir. membran tarafından hissedilen gerginlik yükleme (Şekil 2) vasıtasıyla işaretler görüntüleri kaydedilerek sürekli olarak ölçüldü. Şekil 2B, radyal ve eksenel yönde ölçülen ortalama membran soyu yaklaşık doğrusal olduğunu göstermektediruygulanan motoru ile ilgili olarak% 20 oranında bir maksimum doğrusal suşu kadar sayar. Geri dinlenme pozisyonuna geri çekilmesi sırasında ölçülen kıyasla distansiyon sırasında ölçülen gerilme düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu. Daha sonra, özel bir esnek zar üzerinde kültürlenmiş insan bronşiyal epitel hücreleri (16HBE) ve bunların çekirdeklerinin değiştirme ölçüldü. Bütün hücre yer değiştirmesi, bir dijital mikroskop ile kaydedilen faz kontrast görüntüleri ile ölçüldü ise 16HBE hücrelerinin floresan etiketli (DAPI) çekirdekler, konfokal mikroskop altında bir 20x objektif kullanılarak görüntülendi. Şekil 3&#39;te görüldüğü gibi, çekirdek yer değiştirmesi ile ölçülen gerilme, up ~% 20 lineer streyn zar üzerinde işaretlerin yer değiştirmesi ile ölçülen benzer olmuştur. Bu membranların uygulanan gerilme yapışık hücrelere iletilen olduğunu doğrulamaktadır. Geleneksel mikroskop özel cihazın kullanımını anlatan protokolleri ve atomik kuvvet mikroskopE, aşağıdaki adımlarda verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34: 3400 Serisi</td><td>MOOG Animatik</td><td>SM3416D</td><td>Entegre motor, kontrolör, amplifikatör, kodlayıcı ve iletişim veriyolu</td></tr><tr><td>Flexcell Membran (Kollajen I kaplı)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3.5"&nbsp; x&nbsp; 5.25 inç&nbsp; x&nbsp; 0.020 "</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning Şirketi</td><td></td><td>10:1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td>DAPI lekesi</td></tr><tr><td>MitoSOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Tiron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7389&nbsp;</td><td>Mitokondriyal süperoksit etiketi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td>süperoksit inhibitörü</td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td>Görüntüleme için bir alan oluşturmak için herhangi bir santrifüj tüpü kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>Fare Akciğer Epitel Hücreleri&nbsp;</td></tr><tr><td>16HBE hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2741</td><td>İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri</td></tr><tr><td colspan="4">AFM Girinti Deneyleri</</td></tr><tr><td>Nano Girintili</td> Bütçe Sensörleri için strong>konsol <td>kirişleri</td><td>Si-Ni30</td><td></td></tr><tr><td>AFM&nbsp;</td><td>İltica Araştırma</td><td>MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>Olympus mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>20X ve 40X objektifli ters mikroskop.</td></tr><tr><td>AFM Bacak Uzatıcılar</td><td>İltica Araştırması</td><td>Mevcut değil</td><td>AFM mikroskop</td></tr><tr><td colspan="4">Sonlu Elemanlar Analizleri</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskoplar</td></tr><tr><td>Digital mikroskop</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>EVOS XL</td><td>Çekirdek Başlangıçta kendi başına ayakta duran bir şirket, şimdi Life Technologies'e ait.</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>2 fotonlu dik mikroskop</td></tr></tbody></table>

mekanik stretch sırasında canlı hücre görüntüleme

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Şu anda hücrelerin ve dokuların mekanik uyaranlara nasıl tepki verdiğini anlamaya yönelik önemli bir ilgi var, ancak mevcut yaklaşımlar, canlı hücrelerde veya canlı dokularda gerçek zamanlı olarak yanıtları ölçme yetenekleri açısından sınırlıdır. Konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile görüntüleme yapılırken elastik bir substrat üzerinde büyüyen canlı hücreleri veya dokuları şişirmek için bir hücre aktüatörünün kullanılmasıyla bir protokol geliştirilmiştir. Ön çalışmalar, insan bronşiyal epitel hücrelerinin tonik gerilmesinin mitokondriyal süperoksit üretiminde önemli bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu protokol kullanılarak, alveolar epitel hücreleri gerildi ve görüntülendi, bu da in vitro olarak bir akciğer hasarı formunu simüle eden aşırı şişkinlik ile epitel hücrelerine doğrudan hasar gösterdi. Gerilmiş hücreler üzerinde AFM nano girintisi yapmak için bir protokol de sağlanmıştır.

Reaktif Oksijen Türleri ve Deformasyon Daha önce yapılan çalışmalar, siklik streç 21 tepki olarak hava yolu ve alveolar epitel hücrelerinin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) artış göstermiştir. Reaktif oksijen türleri, molekülleri ve lipitler, proteinler, polisakkaritler, nükleik asitler, 22-24, yüksek reaktiviteye sahip moleküler oksijenden türemiş serbest radikalleri içerir. ROS, ortak bir hücre içi iyon kanalı fonksiyonu düzenleyen bir sinyal, protein kinaz ...

Canlı hücrelerdeki mekanik zorlanmaya gerçek zamanlı tepkilerin ölçülmesine izin vermek için özel bir motor tahrikli mekanik aktüatör kullanılarak yeni bir görüntüleme protokolü geliştirilmiştir. Mekanobiyoloji ile ilgili olarak, sistem konfokal veya atomik kuvvet mikroskobu ile neredeyse gerçek zamanlı görüntülemeye izin verirken %20'ye kadar suşlar uygulayabilir.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre mekanobiyolojisi üzerindeki mekanik gerilmenin rolünü gerçek zamanlıya yakın bir şekilde gözlemlemektir. Bu, öncelikle hücrelerin büyütüldüğü ve gerildiği esnek membranlara sahip bir sistem kurularak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, motor sayımlarını membran gerinimi ile kalibre etmek için membranı gerin.Ardından, fare akciğer epitel hücreleri gerilir ve çekirdekler görüntülenir. Membran gerinmesinin hücrelere iletildiğini göstermek amacıyla, gerilme öncesi ve sonrası bireysel hücrelerin sertliğini ölçmek için nano indentasyon işlemi için gericiler AFM'ye entegre edilmiştir. Sonuçlar, uygulanan gerilme nedeniyle hücrelerde doğrudan hasar olduğunu göstermektedir.Yine floresan görüntülemeye dayalı olarak, reaktif oksijen türleri üretiminin germe ile arttığı gösterilmiştir. Bu yöntem, epitel hücrelerin mekanik ventilasyonla zarar görüp görmeyeceği gibi akciğer mekanik biyolojisi alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu yöntem akciğer hücresi ve mekanik biyolojisine dair içgörüler sağlayabilir ve ayrıca karaciğer veya büyüme plağı kesitleri gibi diğer yumuşak dokulara da uygulanabilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, atom kuvvet mikroskobu gibi bu deneylerde kullanılan alışılmadık araç kombinasyonları nedeniyle zorluk çekebileceklerdir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde, hücre kültürüde kullanım için modifiye edilmiş kolajen kaplı bir PDMS membran hazırlayın. Ardından, fare akciğer epitelyal hücrelerini steril, esnek ve kolajen kaplı bir membran üzerine kuyu başına 2,5 milyon hücre olacak şekilde ekleyin.Hücreleri, konfluens seviyesine ulaşana kadar 37 °C ve %5CO2'de iki gün boyunca inkübe edin. Daha sonra, ön gerilme istenmiyorsa, konstrüktün merkezinden 20,5 mm uzaklıkta olacak şekilde, altı kenet sekmesinin her birine 1,5 mm'lik bir biyopsi punch'ı ile ikişer delik açın. Ardından hücre kültürü ortamını uzaklaştırın.Mekanik aktüatörün sıfır gerilme konumunda olduğundan emin olun ve membranı, deliklerin pinler ve klemplerle hizalanacak şekilde gerdirici üzerine yerleştirin. Üst klempleri yerleştirin ve ardından vidaları, farklı taraflar arasında dönüşümlü olarak tek tek sıkın. Cihazı mikroskop tablasına yerleştirmeden önce bir mililitre hücre kültürü medyumu ekleyin.Cihazı ışık yoluna ortalayın. Ardından, cihazı sahneye sabitleyin. Hedef giriş bloğundaki mikroskop sahne kontrolörü ile mekanik cihazın düzlem içi ve dikey konumlarını ayarlayarak membran üzerine odaklanın.Uygulanması istenen gerinim seviyesine karşılık gelen bir motor sayım değeri girin. Ardından, gerilme sırasında alanın mikroskop objektifine göre kayma ihtimali olduğundan ve gerilme sırasında mikroskop tablasını ayarlamanın gerekebileceğinden dolayı, gerilme öncesi ve sonrasındaki aynı alanı gözlemlemek için hız giriş bloğundaki değeri 10 RPM veya daha düşük bir değere ayarlayın. Her şey ayarlandıktan sonra "go" butonuna tıklayın.Atomik kuvvet mikroskobunda gerekli ayarlamaları yaparak başlayın. AFM kafasının yüksekliğini Z yönünde maksimum konuma getirin. Ardından, AFM kantaleverinin numuneyle temas ettiği düzlemi yükseltmek için ayaklara uzatıcılar yerleştirin.Ardından, AFM tarayıcı plakasını ve istenen objektifi mikroskoptan çıkarın. Objektife bir ara parça ekleyin ve ardından objektifi tekrar mikroskoba monte edin. Sonra tarayıcı plakasını tekrar AFM'ye yerleştirin. Ara parçanın yüksekliği, objektife ve özel AFM kurulumuna bağlı olacaktır; ancak gözlem düzlemi Z yönünde kayacağı için optik görüntüleme isteniyorsa ara parça kullanılması gereklidir.Ardından, AFM yazılımını, optik mikroskop yazılımını ve floresan ölçümleri için kullanılan ışık kaynağı dahil olmak üzere gerekli tüm ışık kaynaklarını çalıştırın. Canlı hücrelerin elastik modülünü ölçmek için, 200 pico newtons per nanometers veya daha düşük sertliğe sahip bir konsol kirişli çipi AFM'ye yerleştirin. Daha sonra lazeri hizalayın, ardından cihaza bir cam lamel yerleştirin ve bunu üreticinin önerileri doğrultusunda konsol sertliğini kalibre etmek için kullanın. Membranı germe cihazına yerleştirmeden hemen önce, duvarları yaklaşık bir milimetre yüksekliğe gelecek şekilde kesin.Bu, membran duvarları ile yük hücresi arasında meydana gelen etkileşimi azaltır. Ardından hücre kültür medyasını uzaklaştırın ve membranı mekanik cihaza monte edin. Yazılımı kullanarak, adaptörü takılı olan mekanik cihazı tarayıcı üzerine yerleştirin.Nano indentasyondan önce membranı istenen çekme gerinme seviyesine kadar gerin. Hücreleri nemli tutmak için üzerlerine 0,5 mililitre veya daha az besiyeri ekleyin, ancak FM tarayıcıya veya mikroskoba zarar verebilecek dökülmelerden kaçınmaya dikkat edin. Ardından, konsol kolu (cantilever beam) membrana temas ettirin.İlgi alanlarını taramak için ilgili AFM cihazının protokolünü izleyin. Membran üzerine ekilen hücrelere %20 gerilme uygulandığında, burada belirtildiği gibi hücreler %20 oranında yer değiştirmiş; hücrelerin reaktif oksijen türlerinin üretimi üzerindeki etkisi, ekteki metin protokolünde açıklandığı üzere kümülatif bir mitokondriyal süperoksit sensörü kullanılarak bronşiyal epitel hücrelerinde ölçülmüştür. Mekanik gerilme yokluğunda, tek bir %17 gerilme uygulanıp korunduğunda, 60 dakika boyunca ROS üretimi anlamlı düzeyde artmamıştır.Mekanik gerdiricinin atom kuvvet mikroskobuna entegre edilmesiyle, mitokondriyal ROS'ta 60 dakika daha devam eden bir artış gözlendi. Fare akciğer epitel hücrelerinin %10 çekme gerilmesi öncesi ve sonrası elastik modül haritaları, burada belirtilen bölgelerden elde edildi. 40 x 40 mikrometrelik bir alan üzerinden kaydedilen 300 bağımsız zorlanmış sapma eğrisi, gerilimin uygulanmasıyla yüksek modüllü bölgelerin lokalizasyonunda bir değişim olduğunu göstermiştir.Hücre germe işlemi, bir kez uzmanlaşıldığında 15 dakikada tamamlanabilir. FM nano indentasyonunun düzgün bir şekilde gerçekleştirilmesi iki saat sürebilir. Bu prosedürü uygularken, veriler raporlanmadan önce hücrelerin çalkalanmasından ve oda havasına uzun süre maruz kalmasından sonuçlar olumsuz &quot;etkilenebileceği&quot; için hücrelerin dikkatli ancak hızlı bir şekildele taşınması gerektiğini unutmamak önemlidir. FM ile çalışmanın son derece zorlayıcı olabileceğini unutmayın.Bu prosedür uygulanırken, tüm sıvıların tarayıcıdan uzak tutulması gibi önlemler alınmalıdır.

live-cell-imaging-during-mechanical-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yaygın vücut mekanik kuvvetleri, hücre farklılaşması ve proliferasyonu etkisi olduğu anlaşılmaktadır. Burada esnek micropatterned yüzeylerde kültüre kök hücre, tek eksenli döngüsel çekme gerilme sağlamak için özel olarak inşa edilmiş biyoreaktör kullanımını gösteren bir video protokolü mevcut.

Devirli Tek Eksenli Gerilme kullanarak Kök Hücre Mekanik Uyarım

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Mekanik kuvvetler akciğer gelişimi ve akciğer hasarı önemli bir rol oynamaktadır. Burada, kemirgen fetal akciğer tip II epitel hücreleri ve fibroblastlar izole etmek ve bir kullanarak mekanik stimülasyonu almaları için bir yöntem...

Fetal Akciğer Hücrelerinde Mechanotransduction Okumak Deneysel Bir Sistem

Bu el yazması tek yönlü germe kullanarak yapışık hücreler ve dokular üzerindeki kuvvetleri uygulamak ya da serbest bırakmak için bir teknik sunuyor.

PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Bu makalede kompleks anizotropik çift eksenli mekanik deformasyona karşı tek bir hücre yanıtları araştırmak ve biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilen yeni bir germe platformu sunmak.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Burada, hücrelere izotropik ve tek eksenli dalga formları uygulayan, aynı zamanda ayarlanabilir sertliğe ve özelleştirilebilir protein matrislerine sahip substratlar üzerinde kültürü destekleyen yeni bir cihaz sunuyoruz. Bu basit ve ekonomik platform, araştırmacıların mekanik ipuçlarının hem temel çalışmalarda hem de hastalıkla ilgili bağlamlarda hücresel fonksiyonu nasıl düzenlediğini araştırmalarını sağlar.

In Vitro Hücresel Esneme ve Görüntüleme İçin Yeni Bir Platform

Keşfedin mekanik gerilme altında canlı hücre görüntüleme yöntemini fare akciğer epitel hücreleri kullanarak. Bu protokol, hücre mekanobiyolojisini gerçek zamanlı gözlemleyerek hasar ve sertlik değişikliklerini analiz etmenizi sağlar.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Daha fazla video keşfet