Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mekanik gerilmenin hücre mekanobiyolojisi üzerindeki rolünü neredeyse gerçek zamanlı olarak gözlemlemektir. Bu, önce hücrelerin büyütüldüğü ve gerildiği esnek zarlara sahip bir sistem inşa edilerek elde edilir. İkinci adım olarak, membran gerilimi ile motor sayımlarını kalibre etmek için membranı gerin.

Daha sonra, fare akciğer epitel hücreleri gerilir ve çekirdekler görüntülenir. Membran gerilmesinin hücrelere iletildiğini göstermek için, sedyeler daha sonra tek tek hücrelerin gerilmeden önce ve sonra sertliğini ölçmek için nano girinti için A FM'ye dahil edildi. Sonuçlar, uygulanan esneme nedeniyle hücreler üzerinde doğrudan hasar olduğunu göstermektedir.

Ayrıca floresan görüntülemeye dayalı olarak, reaktif oksijen türlerinin üretiminin esneme ile arttığı gösterilmiştir. Bu yöntem, epitel hücrelerinin mekanik ventilasyon ile yaralanıp yaralanamayacağı gibi akciğer mekanik biyolojisi alanındaki önemli soruları cevaplayabilir. Bu yöntem, akciğer hücresi, mekanik biyoloji hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca karaciğer veya büyüme plakası dilimleri gibi diğer yumuşak dokulara da uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, atomik kuvvet mikroskobu gibi bu deneylerde kullanılan alışılmadık araç kombinasyonu nedeniyle mücadele edeceklerdir. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hücre kültüründe kullanılmak üzere modifiye edilmiş kollajen kaplı bir PDMS membranı hazırlayın. Daha sonra, fare akciğer epitel hücrelerini steril, esnek kollajen kaplı bir zar üzerine kuyu başına 2,5 milyon hücrede tohumlayın.

Hücreleri, hücreler akıcılığa ulaşana kadar iki gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ardından, herhangi bir ön gerilim istenmiyorsa, yapının merkezinden 20,5 milimetre uzakta, altı kelepçe tırnağının her birine iki delik açmak için 1,5 milimetrelik bir biyopsi zımbası kullanın. Ve hücre kültürü ortamını çıkarın.

Mekanik aktüatörün sıfır gerinim konumunda olduğundan emin olun ve membranı, zımba delikleri pimler ve kelepçelerle aynı hizaya gelecek şekilde sedye üzerine yerleştirin. Üst kelepçeleri yerine yerleştirin ve ardından vidaları farklı tarafları değiştirerek birer birer sıkın. Cihazı mikroskop aşamasına yerleştirmeden önce bir mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin.

Cihazı ışık yolu üzerinde ortalayın. Ardından, cihazı sahneye sabitleyin. Hedef giriş bloğundaki mikroskobun bir kademe kontrolörü ile mekanik cihazın düzlem ve dikey konumlarını ayarlayarak zara odaklanın.

Uygulanması istenen gerinim seviyesine karşılık gelen bir motor sayım değeri girin. Ardından, alan mikroskop objektifine göre kayabileceğinden, germeden önce ve sonra aynı alanı gözlemlemek için hız giriş bloğundaki değeri 10 RPM veya daha düşük bir değere ayarlayın ve germe sırasında mikroskop aşamasını ayarlamak gerekebilir. Her şey ayarlandıktan sonra, git'e tıklayın.

Atomik kuvvet mikroskobunda ayarlamalar yaparak başlayın. A FM kafasının yüksekliğini Z yönündeki maksimum konumuna yükseltin. Ardından, bir FM konsolunun numuneye temas ettiği düzlemi kaldırmak için bacakların üzerine uzatıcılar yerleştirin.

Ardından, A FM tarayıcı plakasını ve istenen hedefi mikroskoptan çıkarın. Objektife bir ara parça ekleyin ve ardından tekrar mikroskoba monte edin. Ardından tarayıcı plakasını tekrar A FM'e yerleştirin. Ara parçanın yüksekliği, hedefe ve belirli bir FM kurulumuna bağlı olacaktır, ancak gözlem planı Z yönünde kaydırılacağından, optik görüntüleme isteniyorsa ara parçanın kullanılması gerekir.

Ardından, A FM yazılımını, optik mikroskop yazılımını ve floresan ölçümleri için ışık kaynağı da dahil olmak üzere gerekli tüm ışık kaynaklarını başlatın. A FM'deki canlı hücrelerin elastik modülünü ölçmek için nanometre başına 200 pico newton veya daha az sertliğe sahip bir konsol kirişine sahip bir çip monte edin. Ardından lazeri hizalayın, ardından cihaza bir cam kapak askısı takın ve üreticinin önerilerine göre konsol sertliğini kalibre etmek için kullanın. Membranı germe cihazına monte etmeden hemen önce, duvarları yaklaşık bir milimetre yüksekliğe kadar kesin.

Bu, membran duvarları ile yük hücresi arasında yaşanan paraziti azaltır. Daha sonra hücre kültürü ortamını çıkarın ve zarı mekanik cihaza monte edin. Yazılımı kullanarak adaptörle birlikte mekanik cihazı tarayıcıya yerleştirin.

Nano girintiden önce zarı istenen çekme gerinim seviyesine kadar gerin. Hücrelerin susuz kalmamasını sağlamak için üzerine 0,5 mililitre veya daha az ortam ekleyin, ancak aynı zamanda bir FM tarayıcıya veya mikroskoba zarar verebilecek bir dökülmeyi önlemeye de dikkat edin. Ardından konsol kirişini membran ile birleştirin.

İlgi alanlarını taramak için belirli A FM cihazının protokolünü izleyin. Zar üzerine ekilen hücrelere %20'lik bir suş uygulandığında, hücreler %20 yer değiştirdi Burada belirtildiği gibi, hücrelerin reaktif oksijen türlerinin üretimi üzerindeki etkisi, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi kümülatif bir mitokondriyal süperoksit sensörü kullanılarak bronşiyal epitel hücrelerinde ölçüldü. Mekanik esneme yokluğunda, ROS üretimi, tek bir %17'lik esneme uygulandığında ve sürdürüldüğünde 60 dakika boyunca önemli ölçüde artmadı.

Mekanik sedyenin atomik kuvvet mikroskobuna dahil edilmesiyle 60 dakika daha devam eden mitokondriyal ROS'ta bir artış oldu. Elastik modül, fare akciğer epitel hücrelerinin %10'luk gerilme gerilmesinden önceki ve sonraki haritaları burada belirtilen bölgelerden elde edildi. 40 x 40 mikrometrelik bir alan üzerinde 300 ayrı zorlanmış sapma eğrisi kaydedildi ve gerinim uygulamasıyla yüksek modüllü bölgelerin lokalizasyonunda bir değişiklik gösterildi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre germe 15 dakika içinde yapılabilir. Bir FM nano girinti iki saat sürebilirken, düzgün bir şekilde çalışın Bu prosedürü denerken, sonuçlar veriler rapor edilmeden önce ajitasyon ve uzun süreli oda havasına maruz kalmaktan olumsuz etkilenebileceğinden, hücreleri dikkatli ama hızlı bir şekilde ele almayı unutmamak önemlidir. Bir FM ile çalışmanın son derece zor olabileceğini unutmayın.

Bu işlem yapılırken tüm sıvıların tarayıcıdan uzak tutulması gibi önlemler alınmalıdır.