Name: Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Öğrenin mikropipet yöntemiyle canlı yapışkan hücrelerde çekirdek mekaniğini incelemeyi. Bu teknik NIH-3T3 ve Hutchinson-Gilford progeria hücrelerinde nükleo-sitoiskelet bütünleşmesini ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH R01 EB014869 tarafından desteklenmiştir.

1. hücre görüntüleme için hazırlanması
Not: Doğrudan gücü probun (DFP) herhangi bir yapisan hücre türü için kullanılabilir. Burada, NIH 3T3 fare fibroblastlar modeli hücre satır olarak bu iletişim kuralı için kullanılır.
<ol><li>Kültür NIH 3T3 fibroblast hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 donör Sığır serum ve % 1 ile DMEM) penisilin-streptomisin 35-mm cam alt çanağı kadar istenen confluency. 37 ° C ve % 5 CO2hücreleri korumak.<ol>
<li>Tüm 35-mm cam alt yemekler 5 µg/mL fibronektin (veya benzer ECM protein) ile NIH 3T3 hücreleri görüntüleme için tohum önce kat emin olun. Not: Tam hücreleri yaymak gerekir ve yemek için deneme üzerinde yapışık. DFP yöntemin işe yaraması confluency açısından herhangi bir kısıtlama yoktur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deney hemen önce hücreleri iki kez tam büyüme orta ile tek bir yıkama ardından PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Tam büyüme orta 3 mL Cam alt yemek için ekleyin.</li>
</ol>2. mikroskobu ve resim alma
Not: Bir ters floresans mikroskobu (veya eşdeğeri) ile üreticinin önerilerini göre yan kol için yüklü micromanipulator. Mikroskop da 37 ° C sıcaklıkta ve % 5 CO2 düzeyinde korumak için çevre bir odası ile outfitted. Bir micromanipulator ve microinjector için mikroskop bağlı gereklidir de. Bir petrol daldırma 40 x / 1.3 NA veya 60 x / 1,49 NA (ya da eşdeğer hedefleri) deneyler için tavsiye edilir. Mikroskop bir titreşim yalıtım masaya monte edilmelidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> Resim 1 . Nükleer deformasyon ve mikroskop odaklanarak A. en büyük nükleer deformasyon ve nükleer deformasyon gevşeme. En büyük nükleer deformasyon hesaplamadan önce nükleer şekillerin arka kenarları ilk deforme çekirdeği çeviri için düzeltmek için çakıştı. Micropipette ipucu dekolmanı Şu anda çekirdeğin şekli ilk nükleer şeklin üzerine çekerek önce overlaid. Alan iki şekil arasındaki farkı Δ ölçülmüştürbir1. En büyük nükleer deformasyon ΔA1 orijinal nükleer alanına göre bölünmüş olarak tanımlanmıştır. Benzer şekilde, ikinci bir parametre, ΔA2, son kararlı duruma nükleer şekli özgün nükleer şeklindeki micropipette dekolmanı sonra overlaying tarafından tanımlı. B. hücre uçak A'da odaklanmak ve odak düzlemi micropipette ipucu bulmak için uçak B kadar hareket ettirin. Görüntüleme sırasında micropipette sağa (turuncu ok yönünü) çevrildi. Bu rakam Neelam ve arkdeğiştirildi. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>Üreticinin iletişim kuralı başına microinjector açın.</li>
	<li>Bir daldırma yağ damlalık kullanmak, Daldırma yağ objektif lens üzerinde tek bir damla uygulanır.</li>
	<li>Çanak sıkıca çanak tutucusuna klamp ve çanak tutucu sahne alanı'na yük. Not: Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 deneme boyunca muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Hücreleri (Uçak A, Şekil 1B) odak haline getirmek için hedefi yüksekliğini ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop sahne alanı ilgi bir hücreyi bulmak için hareket ederler.</li>
	<li>Oyun çubuğu damlalıklı tutucu üst konuma taşımak için micromanipulator üzerinde döndürün. 0.5 µm çapı uç micropipette damlalıklı tutucu üzerine yükleyin.<ol>
<li>Micropipette için hücre adezyon önlemek için oda sıcaklığında 0.3 mg/mL PLL-g-PEG çözüm 1 h için micropipette ucuyla önceden tedavi. Yapışma için emme herhangi bir baskı olmadan çekirdeği için micropipette dokunmadan da çekirdek uzak micropipette çeviri sınayın. Yapışma yokluğu nükleer deformasyon ve çeviri tam bir eksikliği ayırt edilebilir. Not: Lütfen paketi açmak için üretim önerileri uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Objektif odak düzlemi uçak A ve uçak b hücrenin üstüne üzerinde daha iyi denetim ayarlayarak yükseltmek (Şekil 1B, bkz: adım 2.4).</li>
	<li>Micromanipulator kaba denetimine ayarlayın. Tamamen odak haline gelene kadar micropipette micropipette, siluet için izleyerek micropipette uçak B aşağı yavaşça.</li>
	<li>Micropipette ipucu odak olduğunda, micromanipulator iyi denetimine ayarlayın.</li>
	<li>(Uçak A, Şekil 1B) hücrenin Ekvator uçak amaca daha düşük ve micropipette yaklaşık 15 µm (Şekil 1B, kesik micropipette) Uçak A yukarıda için daha düşük.</li>
	<li>Tazminat basınç (Pc) istenilen basınç için microinjector olarak ayarlayın; Basıncı dengelemek için birkaç saniye bekleyin. Not: Optimum basınç ayar noktası hücre türüne ve denemenin belirli hedeflere göre değişir. Çoğu durumda, 300 hPa iyi bir başlangıç noktası olur.</li>
	<li>Micropipette micromanipulator panelde temiz ayarı kullanarak ve hava kabarcıkları micropipette ucundan ortaya emin olmak için kontrol tıkalı değil emin olun.</li>
	<li>Ucu ucunu hafifçe nükleer yüzey dokunuyor kadar yavaş yavaş micropipette düşürerek hücreye yerleştirin. Not: ne zaman micropipette düşürücü, micropipette ucunu silüeti odak haline gelir olarak açık olacak. Micropipette çekirdek dokunamaz önce objektif odak yükseltmek ve micropipette çekirdeği (aynı x-y koordinatı, daha yüksek z-uçak) ile hizalayın. Odak (uçak A, Şekil 1B) çekirdeği Ekvator uçağa geri dönmek ve yavaş yavaş micropipette ucunu alt.</li>
	<li>Bir mühür micropipette uç ve nükleer membran arasında böylece atmosfer micropipette Tüp sonuna açılış mikroenjeksiyon sisteminden basınç kaynağı tüp keserek oluşturun. Bu adım bir negatif basınç nükleer yüzeyde eşit Pc oluşturur.</li>
	<li>Mikroskoplar resim koleksiyonu yazılımı ile görüntüleri elde etmek. AVI-edinme (video) veya nd-edinme (görüntüleri) görüntü collection yazılım ayarlayın. Not: yazılım edinme herhangi bir görüntüleme için gerçek zamanlı video görüntüleme veya Hızlandırılmış görüntü satın almalar ile bir kısa süre aralığı ayarlayın.</li>
	<li>Kanal görüntüleme karşılık gelen floresan için geçiş (Yani, GFP, RFP, vb) ve görüntüleme başlar.</li>
	<li>Micropipette İpucu (sağa doğru Şekil 1B) hücre gövdesinden çekin çevirmek kadar çekirdek micropipette ayırır. Not: ucu pozitif x-yön boyunca (görüş alanı sağa) çekin. Programlanmış ve bilgisayar tarafından kontrol çekme oranı veya joystick el ile hareket edebilir. Biz çekerek arasında herhangi bir korelasyon bulunmadı oranı ve nükleer deformasyon15 zorlamak için öncelikle elastik bir yanıt düşündüren.</li>
</ol>3. veri analizi
<ol><li>Herhangi bir temel görüntü işleme yazılımı ile görüntü analizi gerçekleştirin. Nükleer deformasyon ölçüde uzunluğu zorlanma (Ɛ) ya da (Şekil 1A) alan zorlanma sayılabilir. Denklem 1, kullanarak uzunluğu zorlanma ölçmek nerede L ve M0 temsil eden en fazla deformasyon ve ilk konum, çekirdeği uzunlukları sırasıyla. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(Denklem 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

(Çekirdek nerede sitoiskeleti bilgisini iletmiyor) her iki izole çekirdeği gerektirdiğinden sitoiskeleti çekirdekle mekanik entegrasyonu ölçme micropipette aspirasyon16gibi en yeni yöntemleri için bir meydan okuma olduğunu veya çekirdekleri askıya alınmış hücrelerindeki (hücre dışı güçleri, çekiş güçleri gibi eksik durumda). Güç çekirdeğine hücre yapışık bir membran17,18biaxial baskı uygulayarak uygulanmış; Ancak, bu teknik çekirdeği teşki...

Patolojiler kanser gibi nükleer şekli ve yapısı1,2, genellikle bir 'yumuşama' çekirdek3,4tarafından yayımlanır değişiklikleri içerir. Nükleer mekanik deformasyon direnci genellikle izole çekirdeği5' e bir kuvvet uygulayarak karakterize.
Hücre çekirdeğinde tatlı sitoiskeleti için bağlayıcı Nucleoskeleton ve sitoiskeleti (LINC) karmaşık6,7,8,9tarafından bağlanır. Sonuç olarak, çekirdek mekanik sitoiskeleti ile ve hücre-terkedilemeyen yapışıklıklar, hücre dışı matriks ile entegre edilmiştir. Mekanik yapışık hücreleri içinde çekirdek sondalama mekanik Bu entegrasyon içgörü sağlayabilir. Micropipette aspirasyon10,11ve atomik kuvvet mikroskobu12,13,14çekirdeği canlı hücreler içinde işlemek için yöntemler içerir. Biz son zamanlarda bir yaşam yapisan hücre15çekirdeğinde doğrudan mekanik Kuvvetleri uygulandığı bir doğrudan kuvvet sonda (DFP) nitelendirdi.
Burada, mikroskobu tesislerinde doğrudan yapisan bir hücre çekirdeğinde için bilinen, nano ölçekli mekanik kuvvet uygulamak için yaygın olarak kullanılabilir bir mikroenjeksiyon sistemi kullanan yordamı anahat. Bir femtotip (0.5 µm çapı micropipette tıp) monte ve bir tüp tarafından mikroenjeksiyon sisteme bağlı. Kültür çanak yüzeyine göre 45 ° açıyla konumlandırılmış uç, bitişik kadar nükleer yüzeye indirilir. Tüp sonra bağlantısı kesilen ve nükleer yüzeyinde negatif bir emme basınç oluşturur ve nükleer yüzeye karşı micropipette ipucu mühürler atmosfere açtı. Çeviri micropipette uç çekirdeği deforme ve sonunda (büyüklüğü yük bağlı olarak), micropipette ilişkisi kesildi. Bu dekolmanı çekirdek ve hücre, tarafından sarf geri yükleme (dirençli) kuvvetleri micropipette tarafından uygulanan emiş gücü eşit oluşur. Çözümleme yapılır çekirdeği, deplasman ölçerek uzunluğu zorlanma (denklem 1) veya alan zorlanma (Şekil 1A).

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>durduruldu, mevcut eşdeğer model: InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Mevcut model FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Fluor yağa daldırma 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF yağa daldırma 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Donör Sığır Serumu (DBS)</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3 serumu</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Eagle's (DMEM)</td> <td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 ortamı</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Modifikasyonu&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 orta takviye</td></tr><tr><td>Daldırma Yağı Tipi LDF Floresan Olmayan</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>Objektif lens için daldırma yağı&nbsp;</td></tr></tbody></table>

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Çekirdeği mekanik özellikleri mekanik Kuvvetleri hücrelerinde üretilen onun yanıt belirler. Çekirdek ile sitoiskeleti tatlı sürekli olduğundan, yöntemleri mekanik davranışını yapisan hücrelerdeki soruşturma için ihtiyaç vardır. Burada, doğrudan gücü probun (DFP) doğrudan bir yaşam yapisan Hücre çekirdeğinde kuvvet uygulamak için bir araç olarak tartışmak. Emme nükleer yüzeye dar bir micropipette ekleyin. Micropipette deforme ve çevirmek çekirdek neden olan çekirdek uzak çevrilir. Geri yükleme kuvvetleri emiş gücüne eşit olduğunda, çekirdek ayırır ve Melosun rahatlatır. Emiş basıncı kesin olarak bilindiğinden, güç nükleer yüzeyi bilinir. Bu yöntem nano ölçekli güçleri deforme ve yapışık Hücre çekirdeğinde çevirmek için yeterli ve kuvvetler direnmeye çekirdek etkinleştirmek hücre iskeleti elemanlar ortaya koymuştur. DFP hücresel ve nükleer bileşenleri nükleer mekanik özellikleri canlı hücreler'katkılarıyla incelemek için kullanılabilir.

Şekil 2A bir NIH 3T3 fare fibroblast çekirdeği zorlayarak gösterir. Micropipette ucunu sağa çevrilir, çekirdeği deforms ve sonunda micropipette ucundan ayırır. Çekirdek uzunluğu suşu emiş gücü (Şekil 2B) ile artacaktır görülmektedir. Çekirdeği (kenar çekerek micropipette) ön kenarındaki nükleer bir çıkıntı oluşturan ve trailing edge özgün konumundan yerinden olduğunu. Çıkıntı uzunluğu çekirdeği ve çevredeki sitoplazma arasında sı...

Bu protokol için doğrudan bir yaşam Hücre çekirdeğinde kontrollü bir kuvvet uygulamak için micropipette yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil sorgulama yaşayan, yapisan hücredeki nükleer mekanik özellikleri sağlar.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Bu yöntem, nükleer mekanik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, bir hücredeki çekirdeği deforme etmek için gereken kuvvet nedir? Hücresel ve nükleer bileşenlerin deformasyona karşı nükleer dirence katkıları nelerdir?Ya da hücresel yapılarla nükleer eşleşme hücre tipine göre değişir mi? Bu tekniğin temel avantajı, canlı bir yapışık hücrede bütünleşen nükleo-hücre iskeletini deforme etmek için sondalama kuvveti uygulamamıza izin vermesidir. Bu yöntem, NIH-3T3 hücrelerindeki nükleer mekanik özellikler hakkında bilgi sağlamak için kullanılmış olsa da, Hutchinson-Gilford progerial hücrelerinde nükleer mekanik özelliklerin araştırılması gibi herhangi bir yapışık hücre tipine de uygulanabilir.Bu işleme başlamak için, 35 milimetrelik bir cam alt tabağı mililitre fibronektin başına 5 mikrogram ile kaplayın. Daha sonra, %10 donör sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin ile takviye edilmiş DMEM'deki NIH 3T3 fibroblast hücrelerini, kaplanmış tabak üzerinde 37 santigrat derecede istenen birleşmeye kadar kültürleyin. Deneyden hemen önce, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından tam büyüme ortamı ile tek bir yıkama yapın.Daha sonra, bir cam alt tabağa üç mililitre tam büyüme ortamı ekleyin. Bu prosedürde, mikroenjektörü açın. Bir daldırma yağ damlalığı kullanarak, objektif merceğine bir damla daldırma yağı sürün.Ardından, tabağı tabak tutucuya sıkıca sıkıştırın ve tabak tutucuyu sahneye yükleyin. Hücrelerin deney boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulması gerektiğini lütfen unutmayın. Ardından, hücreleri odak noktasına getirmek için hedefin yüksekliğini ayarlayın.İlgilendiğiniz bir hücreyi bulmak için mikroskop aşamasını hareket ettirin. Mikromanipülatörü kullanarak pipet tutucuyu en yüksek konuma getirin. Ardından, ucu 0,5 mikrometre çapında olan mikropipeti pipet tutucusuna yükleyin.Ardından, hassas kontrolü ayarlayarak objektif odak düzlemini A düzleminin üzerine ve hücrenin üst kısmını B düzlemine yükseltin. Ardından, mikromanipülatörü kaba kontrol konumuna ayarlayın. Mikropipet tamamen odaklanana kadar mikropipetin siluetini izleyerek mikropipeti yavaşça B düzlemine indirin.Mikropipet ucu odaklandığında, mikromanipülatörü hassas kontrole ayarlayın. Daha sonra, hedefi hücrenin ekvator düzlemine indirin ve mikropipeti bunun yaklaşık 15 mikrometre üzerine indirin. Mikroenjektör üzerindeki dengeleme basıncını istenen basınca ayarlayın.Basıncın dengelenmesi için birkaç saniye bekleyin. Pipet ucunun kırık veya tıkalı olup olmadığını kontrol etmek önemlidir, aksi takdirde kuvvet ölçümü yanlış olur. Mikromanipülatör panelindeki temizleme ayarını kullanarak mikropipetin tıkanmadığından emin olun ve mikropipet ucundan hava kabarcıklarının çıktığından emin olun.Ardından, mikropipet ucunu nükleer yüzeye hafifçe temas edene kadar hücreye sokun. Basınç besleme tüpünü mikroenjeksiyon sisteminden ayırarak mikropipet ucu ile nükleer membran arasında bir sızdırmazlık oluşturun, böylece mikropipetin ucunu atmosfere açın. Bu adım, nükleer yüzey üzerindeki dengeleme basıncına eşit bir negatif basınç oluşturur.Ardından, görüntü toplama yazılımını açın. Görüntü toplama yazılımında video için bir AVI alımı veya görüntüler için ND alımı ayarlayın. Ardından, ilgili floresan görüntüleme kanalına geçin ve görüntülemeye başlayın.Mikropipet ucunu, çekirdek mikropipetten ayrılana kadar hücre gövdesinden uzaklaştırın. Bu şekil, bir NIH 3T3 fare fibroblast çekirdeğinin zorlanmasını göstermektedir. Mikropipet ucu sağa doğru hareket ettikçe, çekirdek deforme olur ve sonunda mikropipet ucundan ayrılır.Çekirdeğin uzunluk geriniminin, artan emme kuvveti ile arttığı görülmektedir. Çekirdeğin ön kenarı nükleer bir çıkıntı oluşturur ve arka kenar orijinal konumundan yer değiştirir. Çıkıntının uzunluğu, arka kenar yer değiştirmesinden çok daha büyüktür, bu da çekirdek ile çevreleyen sitoplazma arasında sıkı bir entegrasyon olduğunu düşündürür.Nükleer ön kenarın ve nükleer arka kenarın gevşemesi için zaman ölçekleri kısadır. Çekirdek içi ve hücre iskeleti yapılarının çekirdeğin deformasyona karşı direncine katkısını belirlemek için doğrudan kuvvet probu kullanıldı. Floresan görüntüler, belirtilen durumda çekirdeğin üst üste binmesinden önce ve sonra gösterdi.F-aktin bozulması veya mikrotübül bozulmasından sonra nükleer deformasyon veya translasyonda önemli bir fark bulunmamakla birlikte, siRNA bazlı knockdown yoluyla menten ekspresyonunun azaltılması, önemli ölçüde daha fazla nükleer translasyon ve deformasyon ile sonuçlandı. Bu, fibroblastlardaki menten ara filamentlerinin, çekirdeğin yerel kuvvete direnmesine yardımcı olan ana hücre iskeleti elemanı olduğunu düşündürmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı bir yapışık hücrede çekirdeğe kontrollü ve bilinen bir kuvvetin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

a-direct-force-probe-for-measuring-mechanical-integration-between

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz, küresel ya da lokalize gerginlik uygulama yanıt tek, yaşayan yapışık hücrelere kaynaklı nükleer ve iskelet deformasyonları ölçmek için, iki bağımsız, mikroskop tabanlı araçlar sunuyoruz. Bu teknikler, nükleer sertliği belirlemek için (yani, deformabilitesi) ve, çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet iletim prob kullanılır.

Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Bu makalede, bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini görüntülemek için DNA tabanlı gerilim problarını kullanmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, reseptör kuvvetlerini gerçek zamanlı olarak &gt;4.7pN'yi haritalayabilir ve zaman içinde kuvvetleri entegre edebilir.

Bağışıklık Hücreleri Tarafından Geçici Piconewton Reseptör Kuvvetlerini Haritalamak için DNA Gerilim Probları

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla hücre çekirdeğine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için yeni bir protokol sunmaktadır.

Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

HCN kanalları ve bunların yardımcı alt birimi arasındaki etkileşim Majör Depresif Bozukluk bir tedavi hedefi olarak tespit edilmiştir. Burada, bu protein-protein etkileşimi, küçük molekül inhibitörleri belirlemek için bir floresan polarizasyon tabanlı bir yöntem sunulmuştur.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Öğrenin mikropipet yöntemiyle canlı yapışkan hücrelerde çekirdek mekaniğini incelemeyi. Bu teknik NIH-3T3 ve Hutchinson-Gilford progeria hücrelerinde nükleo-sitoiskelet bütünleşmesini ölçer.

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

Daha fazla video keşfet