Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

Bu yöntem, nükleer mekanik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, bir hücredeki çekirdeği deforme etmek için gereken kuvvet nedir? Hücresel ve nükleer bileşenlerin deformasyona karşı nükleer dirence katkıları nelerdir?

Ya da hücresel yapılarla nükleer eşleşme hücre tipine göre değişir mi? Bu tekniğin temel avantajı, canlı bir yapışık hücrede bütünleşen nükleo-hücre iskeletini deforme etmek için sondalama kuvveti uygulamamıza izin vermesidir. Bu yöntem, NIH-3T3 hücrelerindeki nükleer mekanik özellikler hakkında bilgi sağlamak için kullanılmış olsa da, Hutchinson-Gilford progerial hücrelerinde nükleer mekanik özelliklerin araştırılması gibi herhangi bir yapışık hücre tipine de uygulanabilir.

Bu işleme başlamak için, 35 milimetrelik bir cam alt tabağı mililitre fibronektin başına 5 mikrogram ile kaplayın. Daha sonra, %10 donör sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin ile takviye edilmiş DMEM'deki NIH 3T3 fibroblast hücrelerini, kaplanmış tabak üzerinde 37 santigrat derecede istenen birleşmeye kadar kültürleyin. Deneyden hemen önce, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından tam büyüme ortamı ile tek bir yıkama yapın.

Daha sonra, bir cam alt tabağa üç mililitre tam büyüme ortamı ekleyin. Bu prosedürde, mikroenjektörü açın. Bir daldırma yağ damlalığı kullanarak, objektif merceğine bir damla daldırma yağı sürün.

Ardından, tabağı tabak tutucuya sıkıca sıkıştırın ve tabak tutucuyu sahneye yükleyin. Hücrelerin deney boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulması gerektiğini lütfen unutmayın. Ardından, hücreleri odak noktasına getirmek için hedefin yüksekliğini ayarlayın.

İlgilendiğiniz bir hücreyi bulmak için mikroskop aşamasını hareket ettirin. Mikromanipülatörü kullanarak pipet tutucuyu en yüksek konuma getirin. Ardından, ucu 0,5 mikrometre çapında olan mikropipeti pipet tutucusuna yükleyin.

Ardından, hassas kontrolü ayarlayarak objektif odak düzlemini A düzleminin üzerine ve hücrenin üst kısmını B düzlemine yükseltin. Ardından, mikromanipülatörü kaba kontrol konumuna ayarlayın. Mikropipet tamamen odaklanana kadar mikropipetin siluetini izleyerek mikropipeti yavaşça B düzlemine indirin.

Mikropipet ucu odaklandığında, mikromanipülatörü hassas kontrole ayarlayın. Daha sonra, hedefi hücrenin ekvator düzlemine indirin ve mikropipeti bunun yaklaşık 15 mikrometre üzerine indirin. Mikroenjektör üzerindeki dengeleme basıncını istenen basınca ayarlayın.

Basıncın dengelenmesi için birkaç saniye bekleyin. Pipet ucunun kırık veya tıkalı olup olmadığını kontrol etmek önemlidir, aksi takdirde kuvvet ölçümü yanlış olur. Mikromanipülatör panelindeki temizleme ayarını kullanarak mikropipetin tıkanmadığından emin olun ve mikropipet ucundan hava kabarcıklarının çıktığından emin olun.

Ardından, mikropipet ucunu nükleer yüzeye hafifçe temas edene kadar hücreye sokun. Basınç besleme tüpünü mikroenjeksiyon sisteminden ayırarak mikropipet ucu ile nükleer membran arasında bir sızdırmazlık oluşturun, böylece mikropipetin ucunu atmosfere açın. Bu adım, nükleer yüzey üzerindeki dengeleme basıncına eşit bir negatif basınç oluşturur.

Ardından, görüntü toplama yazılımını açın. Görüntü toplama yazılımında video için bir AVI alımı veya görüntüler için ND alımı ayarlayın. Ardından, ilgili floresan görüntüleme kanalına geçin ve görüntülemeye başlayın.

Mikropipet ucunu, çekirdek mikropipetten ayrılana kadar hücre gövdesinden uzaklaştırın. Bu şekil, bir NIH 3T3 fare fibroblast çekirdeğinin zorlanmasını göstermektedir. Mikropipet ucu sağa doğru hareket ettikçe, çekirdek deforme olur ve sonunda mikropipet ucundan ayrılır.

Çekirdeğin uzunluk geriniminin, artan emme kuvveti ile arttığı görülmektedir. Çekirdeğin ön kenarı nükleer bir çıkıntı oluşturur ve arka kenar orijinal konumundan yer değiştirir. Çıkıntının uzunluğu, arka kenar yer değiştirmesinden çok daha büyüktür, bu da çekirdek ile çevreleyen sitoplazma arasında sıkı bir entegrasyon olduğunu düşündürür.

Nükleer ön kenarın ve nükleer arka kenarın gevşemesi için zaman ölçekleri kısadır. Çekirdek içi ve hücre iskeleti yapılarının çekirdeğin deformasyona karşı direncine katkısını belirlemek için doğrudan kuvvet probu kullanıldı. Floresan görüntüler, belirtilen durumda çekirdeğin üst üste binmesinden önce ve sonra gösterdi.

F-aktin bozulması veya mikrotübül bozulmasından sonra nükleer deformasyon veya translasyonda önemli bir fark bulunmamakla birlikte, siRNA bazlı knockdown yoluyla menten ekspresyonunun azaltılması, önemli ölçüde daha fazla nükleer translasyon ve deformasyon ile sonuçlandı. Bu, fibroblastlardaki menten ara filamentlerinin, çekirdeğin yerel kuvvete direnmesine yardımcı olan ana hücre iskeleti elemanı olduğunu düşündürmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı bir yapışık hücrede çekirdeğe kontrollü ve bilinen bir kuvvetin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.