Hemorajik Inme patolojik sonuçlarını Incelemek için zebrafish larva kullanma
June 5th, 2019
Burada insan intrakerebral kanama (Ich) bağlamında, zebra balığı larvalarda beyinde kanama sonrasında beyin yaralanması, lokomotor açıkları ve nöroinflamasyonu ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Bu yöntem, hemorajik inme sonrasında beyinde kana hemen hücresel yanıt eğitimi için ücretsiz bir ön klinik yaklaşım sağlar, hangi biz hastalar için mevcut özel ilaçlar var çok ciddi bir durum. Kemirgen modellerinin aksine, zebra balığı larvalarının şeffaflığı, floresan mikroskopi kullanarak canlı hayvanların beyinlerindeki hücresel tepkileri gerçek zamanlı olarak gözlemlememizi sağlar. Başlamak için, bir erkek ve bir ila iki dişi yetişkin zebra balığı ndan üretilen üreme kutularında doğal yumurtlama tüm döllenmiş embriyoları toplamak için bir çay süzgeci kullanın.
Standart E3 embriyo ortamı içeren her Petri kabına 100 embriyo aktarın. 28 santigrat derecede kuluçka ve standart kurallara göre sahne. Döllenmeden altı saat sonra, pasteur pipeti kullanarak ölü ve döllenmemiş embriyoları yemekten çıkarın ve bulaşıkları kuvöze geri koyun.
24 saat sonra, parlak alan stereo mikroskop altında, Atorvastatin tedavisi için embriyoları decorionate keskin ultra ince diseksiyon forsepsi kullanın. Sonra iki temiz Petri yemekleri, bir tedavi ve kontrol için diğer E3 embriyo orta 30 mililitre ekleyin. Tedavi çanak embriyo su 60 mikrolitre çıkarın ve larva kanamalı% 80 elde etmek için 0.5 milimolar Atorvastatin 60 mikrolitre ekleyin.
Pasteur pipeti kullanarak, her çan ağa mümkün olduğunca az su 100 embriyo transfer. İki tabak 28 santigrat derece kuluçka. Gübrelemeden 50 saat sonra herhangi bir zamanda, mikroskop altında, kanamalı balıkları kanamasız popülasyonlardan dikkatlice ayırmak ve larvaları taze E3 ortam içeren yeni yemeklere aktarmak için pasteur pipetkullanın.
Daha kolay kanama pozitif larvaayırmak için, kırmızı kan hücrelerinde floresan protein ifade pigment veya balık olmadan balık kullanabilirsiniz. Üçüncü gün, floresan mikroskop ekranında floresan proteinin ekspresyonunu sağlamak için larvalar kullanılır. Daha sonra anestezi için %0,2 MS-222 içeren E3 ortamile hafif sac montaj odasını doldurun.
Pasteur pipeti kullanarak, 1-6 larva içeren tek bir damlacığı montaj için kuru petri kabı yüzeyine aktarın. Mümkün olduğunca çok sıvı kaldırmak için bir pipet kullanın. Larvalara 45 derece santigrat ısı bloğundan %1,5'lik düşük erime agarose'u ekleyin ve larvaları baş yukarı çekmek için 800 mikrometrelik bir kapiller kullanın.
Konumlandırma doğru değilse, larvaları agarose'dan uzaklaştırın ve tekrar monte edin. Kapiller soğumaya bırakın ve sonra ışık levha odasına takın. ZEN görüntüleme yazılımında larvaları yönlendirmek için sürekli basın ve göz merceği arasında kafanın z-yığın görüntülerini elde etmek için elde edin.
İşlem sekmesinde, her z yığınından maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntüsü oluşturun. Motilite testi için rastgele seçmek için, anesteziden sonra 24 larvayı taze E3 ortama aktarın ve hayvanların anesteziden kurtulmasını bekleyin. Larvalar anesteziden tamamen iyileştikten sonra, son kesme transferi ile bir pipet kullanarak metilen mavisi olmadan E3 ortamına geri kazanılmış larvalar.
24 kuyu plakası kuyubaşına bir mililitrede bir larva plakası. Plakayı kamera odasına yükleyin. EthoVision XT izleme yazılımında, spontan yüzme ve deneme hareketini 10 dakika artırmak için beyaz ışık ürktülü rutini ayarlamak için deneme ayarlarını ayarlayın.
96 ve 120 saat post-fertilizatin de lokomotion tsay tekrarlayın. Transgenik ubiquitin salgılanan Annexin V M venöz muhabir hattı kullanılarak beyin hücresi ölümünün değerlendirilmesi, yeşil floresan parlak alan görüntüleri ile gösterilen tüm kanamasız larvalarda bulunmayan kanamalı larvalarda kesin ölüm hücre kümeleri ile sonuçlanır Parlak alan görüntüleri beyin kanamalarının varlığını göstermektedir. Kanamalı larvalar için hem Atorvastatin hem de kabarcık kafa modellerinde ölen hücreler gözlendi.
MPEG1 pozitif makrofajların morfolojisi intraserebral kanama pozitif larvalarda hücreler aktif yuvarlak amipoid şekil olarak benimsemiştir. Bu aktif yuvarlak hücreler intraserebral kanama pozitif larvalarda ölmekte olan hücreleri ifade eden ubikitin salgılanan Annexin V M venözlerin fagositik yanıtını göstermek için zaman içinde izlendi. Beyin kanaması intraserebral kanama negatif kardeş kontrolleri ile karşılaştırıldığında 72 ve 96 saat post-fertilizasyon de motilite önemli bir azalma ile ilişkilidir.
Döllenme sonrası 120 saat olan hareketlilik, temel seviyelere yakın bir düzeye geri kazanışır. Bu işlemin en önemli yönü iyice fenomeni ilerkileme tahlilleri geçmeden önce beyin kanamaları varlığı veya yokluğu için larva incelemek için emin olmaktır. Bu model aynı zamanda fenotip şiddetinin kanamadan sonra iyileşip iyileşmeyebileceğini belirlemek için ilaç taraması için de kullanılabilir, bu da gelecekte yeni ilaç adaylarını belirlememize yol açabilecek bir yaklaşımdır.
Bu teknik bize şimdiye kadar çok kötü üne sahip şimdi çalışma zor olmuştur bir zaman noktası sırasında beyinkanamasından hemen sonra hücresel yanıtları keşfetmek için izin verir. Bu protokolde tanımlanan reaktiflerin veya aletlerin hiçbiri özellikle tehlikeli olmamasına rağmen, kimyasallar, keskin ler veya lazerler kullanılarak her zaman standart bakım ve önlemler alınmalıdır.
Genel Bakış
Bu çalışma, intracerebral kanama (ICH) sonrasında beyin hasarı, lokomotor eksiklikler ve nöroinflamasyonu kantitif hale getirmek için bir protokol sunmaktadır. Bu kritik insan tıbbi durumu, zebra balığı larvalarında gerçekleştirilmektedir. Zebra balığı larvalarının şeffaf yapısını kullanarak, hemorajik inme sonrası canlı beyin modelinde hücresel yanıtların gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesi mümkündür.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nöroinflamasyon
- İnme Sonrası İyileşme
Arka Plan
- Intracerebral kanama (ICH), spesifik tedavi yokluğunda ciddi bir tıbbi durumdur.
- Zebra balığı larvaları, beyin yanıtlarını incelemek için şeffaflıkları nedeniyle yenilikçi bir model olarak kullanılır.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, beyin hasarı sonrası hücresel dinamiklere ilişkin içgörüler sağlar.
- Çalışma, beyindeki nöroinflamasyon ve diğer hücresel yanıtları değerlendirmek için floresan mikroskopi kullanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Hemorajik inmeye karşı hücresel yanıtı incelemek için bir klinik öncesi model geliştirmek.
- ICH'nin lokomosyon ve nöroinflamasyon üzerindeki etkilerini araştırmak.
- ICH'nin etkilerini azaltmak için potansiyel ilaç adaylarını keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Ana platform olarak, hücresel yanıtları görüntülemek için floresan mikroskopi kullanılmaktadır.
- Biyolojik model olarak zebra balığı larvaları kullanılmaktadır, özellikle indüklenen kanama sonucu beyin hasarı üzerinde odaklanılmaktadır.
- Ana zaman dilimleri, embriyo toplama, tedavi uygulama ve belirli döllenme sonrası saatlerde gerçekleştirilen görüntülemeyi içerir.
- Kritik aşamalar, lokomosyonun izlenmesini ve nöroinflamasyon yanıtlarının birkaç gün boyunca değerlendirilmesini içerir.
Ana Sonuçlar
- Önemli hücresel yanıtlar gözlendi, bunlar arasında kanamalı larvalarda ölmekte olan hücre kümeleri de bulunmaktadır.
- Kanama sonrası lokomosyonda azalma, 120 saat sonra kısmi iyileşme ile birlikte belirlendi.
- Aktifleşen makrofajlar, ICH yanıtı ile ilişkili morfolojik değişiklikler gösterdi.
- Bu model, inme için potansiyel terapötik müdahalelerin değerlendirilmesini sağlar.
Sonuçlar
- Bu araştırma, ICH ve hücresel etkilerini incelemek için bir zebra balığı modeli kurmaktadır.
- Yaklaşım, beyin kanaması sonrası sonuçları iyileştirmek için ilaç tarama çabalarını kolaylaştırabilir.
- Genel olarak, beyin hasarı sonrası hücresel dinamiklerin ve potansiyel iyileşme mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Zebrafish larval models address a critical gap in hemorrhagic stroke research by enabling real-time visualization of cellular responses to intracerebral hemorrhage, a process difficult to capture in opaque mammalian systems. This approach supports early target validation and mechanistic de-risking by quantifying neuroinflammation, cell death, and functional deficits in a disease-relevant in vivo system. The model’s compatibility with live imaging and motility assays provides predictive confidence for screening therapeutic candidates aimed at mitigating hemorrhage-induced pathology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immediate cellular responses to blood in the brain, supporting target validation in hemorrhagic stroke pathways.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through conserved pathological phenotypes such as dying cell clusters and macrophage activation, which mirror human ICH responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative readouts of locomotor dysfunction and neuroinflammation, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Supports assay reproducibility and scalability via staged larval populations and automated tracking (e.g., EthoVision XT), enhancing throughput for lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity by recapitulating key ICH consequences—neuroinflammation, cell death, and motor deficits—enabling preclinical validation of mechanism-based interventions.
- Operational Value: Allows longitudinal assessment from 72 to 120 hours post-fertilization, supporting risk-adjusted advancement decisions based on phenotypic recovery or persistence.
Pipeline & Workflow Integration
The zebrafish larval ICH model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a bridge between mechanistic insight and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time imaging of Annexin V-positive dying cells and MPEG1 macrophage morphological shifts following hemorrhage.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable motility assays at 96 and 120 hpf, providing scalable, reproducible behavioral endpoints for compound screening.
- Analytics: Yields measurable outputs including fluorescence intensity of cell death reporters, macrophage morphology changes, and locomotion tracking data, enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by modeling conserved human ICH pathologies, supporting biomarker-aligned target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for mechanistic screening and target de-risking across multiple therapeutic modalities due to its non-terminal, quantifiable readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of hemorrhage-induced neuroinflammation and cell death.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined staging (e.g., 24 hpf decoronation, Atorvastatin treatment) and blinded hemorrhage sorting before phenotypic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early efficacy signals in a disease-relevant system, reducing late-stage biological risk in stroke drug development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that improve hemorrhage phenotypes, informing advancement based on functional recovery and cellular rescue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, embryonic staging, and fluorescent microscopy for live imaging.
- Dependent on instrumentation including light sheet or fluorescence microscopes, agarose mounting systems, and automated behavior tracking tools (e.g., EthoVision XT).
- Necessitates cross-team standardization in hemorrhage scoring and larval separation to ensure phenotypic assay validity.
- Involves adaptation considerations for pigment-free or transgenic reporter lines to enhance hemorrhage detection and signal clarity.
- Limited by larval size and throughput constraints compared to higher vertebrates, though offset by rapid generation times and optical accessibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Day 0: Egg Production and Collection
1:11
Day 1 - 2: Atorvastatin Treatment and ICH- and ICH+ Populations Separation
2:22
Day 3 - 5: Cell Death, Leukocyte Analysis and Motility Assay
4:24
Results: Intracerebral Hemorrhage (ICH) in Zebrafish Larvae
5:39
Conclusion
