Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Bu testi, bitkisel gıdaların hayvanlarda fizyolojik süreçlerin yanı sıra davranış ve üreme başarısını etkileyebilecek fitosteriodlar içerip içermediğini değerlendirmek için kullanıyoruz. Bu tahlil, bitkilerin biyolojik aktiviteye sahip östrojenik bileşikler üretip üretmediğini belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem başlangıçta tıptaki uygulamalar için ksenoöstrojen aktivitesine sahip ilaçları taramak için geliştirilmiştir.

Örneğin, hücre çoğalmasını inhibe etmek. Bunu, primat ekolojisi ve evrimi hakkında bilgi vermek için kullanıyoruz. Kontaminasyona karşı çok hassas olduğu için bu testi denemeden önce temiz bir ortamda aseptik teknikle çalışma pratiği yapmak önemlidir.

Taze bitki öğelerini liyofilizatör ile dondurarak kurutarak başlayın, ardından 0,85 milimetre elekli bir öğütme değirmeni kullanarak ince bir şekilde öğütün. Öğütülmüş numuneleri ekstraksiyona kadar karanlıkta torbalarda saklayın. Bitkilerdeki herhangi bir potansiyel fitosteroidi çıkarmak için, kurutulmuş numuneyi uygun büyüklükte bir şişeye, ardından HPLC dereceli metanole ekleyin.

Bitki metanol çözeltisini alüminyum folyo ile örtün ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde üç gün boyunca 100 RPM'de dönecek şekilde ayarlayın. Üç gün sonra, süpernatı boşaltmak ve bir damla filtreleme sistemine sokmak için filtre kağıdı kullanın. Bitki ekstraktını koyulaşana kadar döner bir buharlaştırıcı ile kurutun, ancak 300 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeye dökülebilir.

Numuneyi 50 mililitrelik bir şişeye dökün ve büyük şişeyi az miktarda metanol ile durulayın, ardından metanol tamamen buharlaşana kadar numuneyi küçük şişede kurutmaya devam edin. İşiniz bittiğinde, numune kalıntısını analitik bir terazi ile tartın ve kütleyi kaydedin. Bitki ekstraktını DMSO'da 0.1 gram ekstrakt konsantrasyonunda iki mililitre DMSO'ya çözün ve homojenize olana kadar vorteksleyin.

DMSO kendi başına toksik değildir, ancak diğer maddelerin zarları geçmesine izin veren bir araçtır. Bitkilerimizin toksik kimyasallar içerip içermediğini bilmediğimiz için, hepsi tehlikeliymiş gibi muamele görür. Solüsyonun cilde temas etmesine izin vermeyin, kirlenmişse eldivenleri değiştirin ve kalın, yakın burunlu ayakkabılar ve laboratuvar önlükleri giyin.

Numuneyi kullanıma hazır olana kadar kehribar cam şişelerde dört santigrat derecede saklayın. Numuneleri vorteksleyin, daha sonra% 0.8'lik bir DMSO çözeltisi elde etmek için 496 mikrolitre bileşik tarama ortamına her numuneden dört mikrolitre ekleyin. Önceden ısıtılmış bir hücre geri kazanım ortamı tüpünün dış yüzeyini %70 etanol ile dezenfekte edin ve 10 mililitre ortamı çözmek için donmuş raportör hücrelerden oluşan bir tüpe aktarın.

Raportör hücrelerin tüpünü kapatın ve beş ila 10 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Hücreleri su banyosundan aldıktan sonra, hücre agregalarını parçalamak ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin, ardından tüpün yüzeyini %70 etanol ile temizleyin. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre raportör hücre süspansiyonu dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın, ardından 100 mikrolitre numuneyi uygun kuyucuklara üç nükte halinde dağıtın.

Plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 22 ila 24 saat inkübe edin. Plaka inkübasyonunun bitiminden hemen önce, algılama substratını ve algılama tamponunu buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenene kadar düşük ışıklı bir alana yerleştirin, ardından çözeltileri karıştırmak için her bir tüpü nazikçe ters çevirin. Plaka inkübasyonu tamamlanmadan hemen önce, lusiferaz tespit reaktifi oluşturmak için algılama tamponunun tüm içeriğini algılama substratı tüpüne dökün.

Köpük oluşmaması için tüpü hafifçe karıştırın. Numune plakasının içindekileri uygun olmayan atık kabına atın ve son damlacıkları kuyucuklardan çıkarmak için temiz, emici bir kağıt havluya hafifçe vurun. Her bir oyuklu kuyucuğa 100 mikrolitre lusiferaz tespit reaktifi ekleyin ve tahlil plakasının oda sıcaklığında 15 dakika dinlenmesine izin verin, ardından 96 kuyulu bir plaka okuma luminometresi kullanarak lüminesansı ölçün.

İnsan diyetlerinde yaygın olarak bulunan 22 meyve ve sebze özütü östrojenik bileşiklerin varlığı açısından tarandı. Östrojenik aktivite, yüksek, orta, düşük veya hiç aktivite olmayan sıralı bir kalitatif şekilde sunulur. Organik ve organik olmayan soya fasulyesi yüksek aktivite seviyelerinde taranırken, diğer tüm meyve ve sebze ürünleri herhangi bir aktivite kaydetmedi.

Soya fasulyesi sonuçlarının standart eğri ile karşılaştırılması, bu konsantrasyonda yüksek östrojenik aktivite seviyelerine sahip olduklarını da göstermektedir. İzoflavonlar, daidzein ve genistein için bilinen güçlü bir kaynak olan soya fasulyesi özütü, maksimuma %50'lik bir sinyal veren seyreltmeyi belirlemek için daha fazla kullanıldı. Bu ekstrakt, standart seyreltme protokolümüzün yarısı kadar sinyal üretmek için 422 kat daha fazla seyreltme gerektirir.

Aktivite ile tanımlanan numuneler, aktif kimyasalları tanımlamak için kütle spektrometresi ile analiz için gönderilebilir. Antagonist bir yöntem kullanarak, bitki besininin endojen östrojenlerin bağlanmasını ve aktivitesini azaltan kimyasallar içerip içermediğini de belirleyebiliriz. Bu teknik, primat diyetlerinde östrojenik gıdaların ne kadar yaygın olduğunu ve ayrıca fitoöstrojen tüketiminin, tahlil dışkı hormonu analizleri ve saha verileriyle birleştirildiğinde fizyolojiyi ve davranışı nasıl etkilediğini anlamamızı sağlar.