Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan İn Vitro Transaktivasyon biyolojik tayinler

Arıtılmış atık su ve yüzey (alıcı) suyu dahil olmak üzere su örneklerinin organik ekstraktlarında endokrin aktiviteyi taramak için bir protokol, ticari olarak temin edilebilen bölme tutuklu ("dondur ve çözdür") in vitro transaktivasyon biyotahlilleri kullanılarak uyarlanmıştır.

Bu standartlaştırılmış prosedürün genel amacı, ticari olarak temin edilebilen, reseptör bazlı hücre tahlillerini kullanarak endokrin aktif kimyasallar için su örneklerini taramaktır. Bu yöntem, su kalitesi izleme alanındaki endokrin aktif kimyasallar numunede gerçekten mevcut mu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir grup endokrin aktif bileşiği mevcut kimyasal yöntemlerden çok daha hızlı analiz edebilmesidir.

Bu teknik, endokrin bozucu kimyasalların varlığından kaynaklanan su kalitesi sorunlarının teşhisine yardımcı olabilir. Bu yöntem, sudaki kirleticiler hakkında bilgi sağlar, ancak tortu ve dokular gibi diğer çevresel matrislere de uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler zorlanabilir, çünkü pipetleme tekniklerini kullanırken yüksek hassasiyet gerektirir.

Bu prosedüre başlamak için, su numunesini, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, tahlillere özgü ortam ve referans kimyasalın stok çözeltilerinde hazırlayın. Tahlillere özgü ortamı uzun süreli depolama için dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, steril bir tüpte 285 mikrolitre tahlil ortamına 15 mikrolitre uygun referans kimyasal stoğu ekleyin.

Numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, tahlil ortamında 200 mikrolitre% 5 DMSO'yu sekiz ek tüpe ekleyin. Üç katlı bir seyreltme serisine başlamak için 100 mikrolitrelik bir alikotu birinci tüpten ikinci tüpe aktarın.

Seyreltilmiş numuneyi ikinci tüpte bir pipetle iyice karıştırın. Ardından, 100 mikrolitrelik bir alikotu ikinci tüpten üçüncü tüpe aktarın. Her tüp için bu işleme devam edin.

Ardından, 190 mikrolitre tahlil ortamında 10 mikrolitre DMSO'yu karıştırarak bir çözücü kontrol numunesi hazırlayın. Ardından, dört yeni tüp toplayın ve etiketleyin. İlk tüpe 95 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin.

Ardından, beş mikrolitre su özü ekleyin ve iyice karıştırın. Diğer üç tüpe tahlil ortamında 50 mikrolitre% 5 DMSO ekleyin. Ardından, 50 mikrolitre çözeltiyi bir tüpten diğerine aktararak iki kat seyreltme gerçekleştirin.

Kriyojenik dondurucudan bir şişe ER veya GR bölünmesi tutuklanmış hücre alarak başlayın. Şişeyi 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirerek hücreleri hızlı bir şekilde çözün ve iki dakika boyunca hafif bir çalkalama yapın. Ardından, şişeyi% 70 Etanol ile dekontamine edin.

İkinci sınıf bir biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Aseptik teknikler kullanarak şişeyi açın ve hücreleri 10 mililitre tahlil ortamına aktarın. Beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjleme tamamlandığında, süpernatanı aspire etmek için steril bir cam pipet kullanın. Daha sonra, hücre peletini altı mililitre tahlil ortamında yeniden askıya alın. Beş mikrolitre hücre süspansiyonunu beş mikrolitre hayati leke çözeltisi ile karıştırın.

Ardından, bir sayma odasına bir alikot ekleyin. Bir ışık mikroskobu veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın. Ardından, hücre süspansiyonundaki canlı hücrelerin yoğunluğunu tahmin edin.

Gerekirse, mililitre tahlil ortamı başına 550.000 canlı hücrelik bir nihai yoğunluk elde etmek için seyreltin. Dokuz noktalı tahlil, özel kalibrasyon eğrisi, QA/QC numuneleri ve her su ekstraktı için çoklu seyreltme içeren bir plaka düzeni oluşturarak başlayın. Replikasyon hücresi serbest kontrol kuyularına 90 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin.

Hücre süspansiyonunu steril bir pipetleme haznesine dökün. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak, diğer kuyucuklara 90 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Seyreltilmiş numunelerden 10 mikrolitre uygun kuyucuklara ekleyin.

Plakayı bir kapakla örtün. Ardından, plakayı 16 saat boyunca 37 santigrat derecede %5'lik bir C02 inkübatöre yerleştirin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, plakanın oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.

Daha sonra doğrudan ışık yokluğunda sonraki adımlar atılmalıdır. Üreticinin talimatlarına göre altı x yükleme çözümü hazırlayın. Ardından, her kuyucuğa 20 mikrolitre yükleme çözeltisi ekleyin.

Seyreltilmiş su ekstraktının sitotoksisitesini değerlendirmek için her oyuğa 10 mikrolitre hücre canlılığı reaktifi ekleyin. Plakayı alüminyum yapışkan film ile kapatın. Ardından, plakayı karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandıktan sonra, plakayı alt okuma özelliklerine sahip mikroplaka okuyucuya ekleyin. Floresanı ölçün ve verileri metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analiz edin. Bu çalışmada, arıtılmış belediye atık sularının dört adet 24 saatlik kompozit numunesi, Güney Kaliforniya'daki tatlı su sistemlerinden altı adet yüzey suyu numunesi ve ultra saf sudan oluşan bir alan boşluğu analiz edilmiştir.

10 temsili su örneğinin yedisinde ER aktivitesi tespit edilirken, dördünde GR aktivitesi tespit edildi. Östrojen reseptörü ve glukokortikoid reseptör deneyleri için QA/QC performans yönergeleri burada görülebilir. Sitotoksisite ve numune kesinliği için çalışma sonuçları, su numunesi ölçümlerini doğrulayan kabul kriterleri dahilinde oldukça iyi bir şekilde yer aldı.

En yüksek biyo-tahlil eşdeğer konsantrasyonları ikincil atık sularda bulunurken, üçüncül atık suyun GR aktivitesinin biyo tahlil tespit sınırının altında olduğu bulunmuştur. Benzer şekilde, çoğu yüzey suyu numunesi, tespit sınırının üzerinde hiçbir GR aktivitesi sergilemedi ve ikincil atık sulardan çok daha düşük ER aktivitesi seviyelerine sahipti. Atık su arıtma tesisi atık su örneklerinin çoğu, hem ER hem de GR biyo-tahlilleri için tespit sınırının üzerinde bir doz yanıtı gösterdi.

Göreceli zenginleştirme faktörüne karşı çizilen bu numunelerin ortalama mavi/yeşil floresan oranı için temsili sonuçlar burada görülebilir. Bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa 24 saat içinde yapılabilir. Bunu denerken, tüm QA/QC yönergelerini takip etmek önemlidir.

Bu teknik, yöneticilerin sudaki endokrin bozucu kimyasalları izlemek için alternatif yaklaşımları keşfetmelerinin yolunu açtı. Sodyum azid ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Düzgün çalışan bir çeker ocakta çalışmak gibi önlemler alınmalıdır.