Name: Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan İn Vitro Transaktivasyon biyolojik tayinler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin, su örneklerinde endokrin aktif kimyasalları tespit etmek için reseptör tabanlı hücre testlerini kullanarak hızlı ve standartlaştırılmış bir protokol geliştirmeyi. Bu yöntem, su kalitesi izleme çalışmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman, Devlet Su Kaynakları Kontrol Kurulu tarafından sağlanmıştır (10-096-250 ve 14-090-270 sayılı Anlaşmalar). S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi ve J. Printen'e teşekkür ederiz. Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmez ve ticari isimlere atıfta bulunulması onay anlamına gelmez.

1. Toplama ve Proses Suyu Numune (Escher ve ark Modifiye. 9) <ol><li> Çevrede su numunesi ile en 1 g sodyum azid ve 50 mg askorbik asit ihtiva eden bir temizleme 1 L amber cam şişe doldurun. 72 saat sonra 4 ° C saklayınız numune ve proses. NOT: Sodyum azit çok zehirlidir ve dikkatle ele alınması gerekir. koruyucu giysiler (göz / yüz, eldiven, giysi) kullanın ve düzgün işleyen bir duman başlığı içinde tartın. tartmak için metal bir spatula kullanmayın. </li><li> 1.6 uM cam elyaf filtre ile ve daha sonra 5-10 ml / dakika bir akış hızında, bir ön şartlandırılmış Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) kartuşundan örnek geçirin. akış hızını kontrol etmek için vakum pompasının basıncı ayarlayın. </li><li> Vakum, 15 dakika boyunca kartuş kurutun. </li><li> 10 ml aseton içindeki ardından 10 ml metanol, kartuşu Zehir: heksan (1: 1, hac / hac). </li><li> Yüksek saflıkta, hafif bir azot akımı altında yaklaşık 1 ml&#39;ye elüat konsantre edilir. çözücüdimetilsülfoksid (DMSO) 500 ul ekleyerek ve aşağı 500 ul özü buharlaştırılması ile değişimi. </li><li> Bir amber cam bir numune alıcı viale aktarın özü. -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Deney Özgü Referans Kimya ve Su Özü dilüsyonları hazırlayın <ol><li> Kalibrasyon eğrisi için 9 dilüsyonları hazırlayın. <ol><li> % 100 DMSO içinde deney özel bir referans kimyasal bir stok çözeltisi yapın. nihai konsantrasyon ER analizi için 2 uM 17β-estradiol ve GR analizi için 100 uM deksametazon olmalıdır. -20 ° C&#39;de stok solüsyonları saklayın. </li><li> steril bir tüp içinde deney ortamı 285 ul uygun referans kimyasal stokunun 15 ul ekleyin (tüp # 1). Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından örnek karıştırın. </li><li> 8 ek borular (borular # 2-9) &#39;de deney ortamı içinde,% 5 DMSO içeren bir çözeltiye 200 ul ekle. </li><li> küvet ile tüp # 2 tüp # 1 100 ul tablet aktarınE # 9, 3 katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirmek için. Her bir seyreltilmiş örnek bir tümbölen alınarak ve aşağıdaki borunun eklemeden önce bir pipet ile iyice karıştırılması gerekir. </li></ol></li><li> deney ortamı 190 ul DMSO içerisinde 10 ul karıştırılmasıyla bir çözücü kontrol örneği hazırlayın. </li><li> Her su ekstraktı için dört dilüsyonları hazırlayın. <ol><li> birinci tüp içinde, deney ortamı 95 uL su özütü 5 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Diğer üç tüplerde deney ortamı içinde,% 5 DMSO, 50 ul ekle. </li><li> sonraki bir tüpten çözeltisi 50 ul transfer ile 2 kat seyreltme gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 3. FRET Biyoassay Davranış Hücre Süspansiyon Hazırlamak <ol><li> üreticinin talimatlarına göre analiz, belirli bir ortam hazırlar. Deney ortamı, 4 ° C&#39;de saklanır ve kullanılmadan önce bir su banyosunda 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılmalıdır. </li><li> kriyojenik serbest üzerinden ER veya GR bölünme-tutuklanan hücrelerin bir şişe alınzer yumuşak çalkalama ile 2 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içinde flakon yerleştirerek hücrelerin hızlı bir şekilde eritin. % 70 etanol ile şişeyi arındırmak ve Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yerleştirin. </li><li> aseptik teknikler kullanılarak şişe açılır ve deney ortamında 10 ml hücre transfer edin. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> steril bir cam pipet kullanılarak süpernatan aspire ve deney ortamında 6 ml hücre pelletini. </li><li> Bir canlı bir boya çözeltisi 5 ul hücre süspansiyonu 5 ul karıştırın ve bir sayma bölmesine bir kısım ilave edin. </li><li> ışık mikroskobu ya da otomatik hücre sayacı kullanılarak canlı hücre sayısını ve hücre süspansiyonu, canlı hücrelerin yoğunluğunu tahmin ediyoruz. Deney ortamı, ml başına 550.000 canlı hücreler bir son yoğunluk elde etmek gerektiğinde seyreltilir. </li></ol> 4. Plaka 96-kuyu Siyah Duvar Clear-alt Plate Hücreler ve seyreltilmiş Su Extract ekle <ol><li> bir tabak oluşturunHer su ekstraktı için 9-nokta denemesi özel kalibrasyon eğrisi, QA / QC örnekleri ve çoklu dilüsyonları içeren düzen. 96 oyuklu bir plaka taslağına bir örnek, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> tekrarlanan hücresiz kontrol oyuklarına deney ortamı 90 ul ekle. </li><li> steril pipet haznesindeki hücre süspansiyonu dökün ve çok kanallı pipet kullanılarak kuyu hücre süspansiyonu 90 ul ekle. </li><li> Uygun oyuklara kademe 2 sırasında hazırlanan seyreltilmiş numunelerin 10 ul ekle. oyuk başına nihai DMSO konsantrasyonu% 0.5 düzeyinde olmalıdır. </li><li> Bir kapak plakası kapatılır ve 16 saat 37 ° C&#39;de bir% 5 CO2 inkübatöründe yerleştirin. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" /> Şekil 1: a. 96 oyuklu plaka taslağına Örnek çok-yuvalı plaka bir deney, belirli bir kalibrasyon eğrisi, 3 tip içerecek şekilde tasarlanmıştırQA / QC kontrolleri ve su ekstraktı başına 4 dilüsyonları (medya sadece DMSO içinde temiz bir ortamda hücreler ve hücreler orta çivili). Her kontrol ve su ekstresinin seyreltme üçlü kuyular analiz edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 5. Yükleme Çözüm hazırlayın ve her Şey ekle <ol><li> İnkübasyondan sonra, plaka, oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Bu FRET Biyolojik deney için, 5.6 ile 5.2, doğrudan ışık olmadan yapılmalıdır yineleyin. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir 6x yükleme çözeltisi hazırlayın. </li><li> her bir kuyunun 6x yükleme solüsyonu 20 ul ekleyin. </li><li> seyreltilmiş, su Sitotoksisitenin değerlendirmek için her bir oyuğa Hücre canlılığı reaktifi 10 ul ekle. </li><li> alüminyum yapışkan film ile plaka mühür. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li></ol> 6. ölçün Sitotoksisite ve Endokrin Etkinlik Tepki <ol><li> Üreticinin talimatları izleyerek alt-okuma yetenekleri ile mikroplaka okuyucu ayarlayın. </li><li> FRET transaktivasyon Biyoassay, mavi floresan (409/460 nm, uyarma (Ex) / emisyon (Em) dalga boyu) ve yeşil (409 Ex / 530 Em nm) kanalları ölçün. </li><li> sitotoksisite deneyi için 560 Ex / 590 Em nm&#39;de floresan ölçmek. </li></ol> 7. Veri Kalitesinin belirleme QA / QC Çekler değerlendirin <ol><li> ve hücreler sadece (temiz analiz ortamında hücreleri) kontrol hücre içermeyen (sadece medya) ortalama ham floresan karşılaştırın. Ortam sadece arka plan flüoresan hücrelerin sadece kontrol cevabına kıyasla en az% 25 daha düşük olması gerekir. </li><li> Ham FRET veri işlemek. hem &#39;blue&#39; ve &#39;yeşil&#39; veri setleri için de içeren tüm hücreden hücre içermeyen kontrol çukurlarında ortalama floresan çıkarmak. hesaplamakHer deneysel kuyu için mavi / yeşil oranı. </li><li> DMSO kontrolleri ile sadece hücreler-ve hücrelerin mavi / yeşil oranını karşılaştırın. bu denetimlerin floresan değerleri% 15 Bağıl Standart Sapma (RSD) içinde olmalıdır. </li><li> bir günlük moleküler kütleye (M log) olarak ifade numune konsantrasyonuna karşı mavi / yeşil oranı olarak tahlil özel kalibrasyon eğrisi çizilir. Eğim, R 2 hesaplayın ve EC 50 (% 50 etki konsantrasyonu) oturum açın. Kalibrasyon parametreleri Tablo 1 &#39;de listelenen beklenen aralıkta olmalıdır. </li><li> tüm üçlü kuyular için RSD hesaplayın. çoğaltır arasında değişkenlik% 20 daha az olmalıdır. </li><li> sitotoksisite verileri (560 EX / 590 Em nm), tüm hücre içeren kaynaklardan gelen hücre içermeyen kontrol ortalaması (örneğin, ortam geri plan) çıkarılır. </li><li> Her numune için ortalama arka plan çıkarılır floresan hesaplayın. DMSO kontrolü bir yüzdesi olarak ortaya çıkan floresan verilerini çizilir. Numune seyreltileri olmamalıhücreleri yalnızca DMSO kontrollere göre% 20&#39;den fazla, hücre ölüm sergiler. </li></ol> 8. Veri Analizleri <ol><li> Asgari kalibrasyon tepki artı yanıt ortalamanın iki standart sapma olarak Algılama (LOD) tahlil Sınırı hesaplayın. </li><li> Bir doz tepkisini gösteren örnekler için AK 50 türetmek &#160; Referans kimyasal 10 ve% 50 etki konsantrasyonları arasındaki kalibrasyon eğrisinin lineer regresyonunun eğim ile su ekstresi. </li><li> / EC sayılı su numunesi 50 referans kimyasal BEQ = EC 50: formülü kullanarak Biyoanalitik Eşdeğer Konsantrasyon (BEQ) hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ToxCast+program+for+prioritizing+toxicity+testing+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals.</a> Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).</li>
<li>Reif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+profiling+and+prioritization+of+environmental+chemicals+using+ToxCast+data%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data.</a> Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).</li>
<li>Maruya, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiered%2C+integrated+biological+and+chemical+monitoring+framework+for+contaminants+of+emerging+concern+%28CECs%29+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Environ.+Assess.+Manag%22%5BJournal%5D)">A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems.</a> Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiple+hormonal+activities+in+wastewater+effluents%2C+surface+water%2C+using+a+panel+of+steroid+receptor+CALUX+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+in+vitro+bioassays+to+measure+estrogenic+activity+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).</li>
<li>Jarosova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Europe-wide+survey+of+estrogenicity+in+wastewater+treatment+plant+effluents%3A+the+need+for+effect-based+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).</li>
<li>Sonneveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+screening+models+for+androgenic+and+estrogenic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities.</a> Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).</li>
<li>Piersma, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alternative+in+vitro+test+battery+for+detecting+reproductive+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants.</a> Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).</li>
<li>Escher, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+organic+micropollutants+in+wastewater%2C+recycled+water+and+drinking+water+with+in+vitro+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Prioritization+of+the+endocrine+disruptor+screening+program+universe+of+chemicals+for+an+estrogen+receptor+adverse+outcome+pathway+using+computational+toxicology+tools%22">Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools</a>. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+wastewater+and+recycled+water+quality%3A+a+comparison+of+lines+of+evidence+from+in+vitro%2C+in+vivo+and+chemical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses.</a> Water Res. 50, 420-431 (2014).</li>
<li>Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+budget%3A+accounting+for+glucocorticoid+bioactivity+and+fate+during+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).</li>
<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genomics+profiling+of+environmental+chemical+modulation+of+human+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors.</a> Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).</li>
<li>Mehinto, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+in+vitro+bioassays+for+screening+of+endocrine+active+chemicals+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water.</a> Water Res. 83, 303-309 (2015).</li>
<li>Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrutinizing+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+wastewater+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).</li>
<li>Tang, J. Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+characterization+of+urban+stormwater+with+bioanalytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools.</a> Water Res. 47, 5594-5606 (2013).</li>
<li>Scott, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+endocrine+activity+in+Australian+rivers+using+chemical+and+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).</li>
<li>Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminants+of+emerging+concern+in+municipal+wastewater+effluents+and+marine+receiving+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).</li>
<li>WateReuse Research Foundation (WRRF). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Direct+potable+reuse%3A+a+path+forward%22">Direct potable reuse: a path forward</a>. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+application+of+bioanalytical+tools+as+surrogate+measure+of+chemical+contaminants+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water.</a> Water Res. 49, 300-315 (2014).</li>
<li>Schriks, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+glucocorticoid+activity+in+various+surface+waters+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands.</a> Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).</li>
<li>Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glucocorticoid+receptor+agonist+in+effluents+from+sewage+treatment+plants+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tot.+Environ%22%5BJournal%5D)">Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan.</a> Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).</li>
<li>Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effects+of+effluents+from+sewage+treatment+works%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works.</a> Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).</li>
<li>Kidd, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+a+fish+population+after+exposure+to+a+synthetic+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).</li>
<li>Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+estrogen+and+androgen+receptor+activities+in+200+pesticides+by+in+vitro+reporter+gene+assays+using+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells.</a> Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).</li>
<li>Kugathas, S., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glucocorticoids+in+the+environment%3A+First+results+on+their+potential+impacts+on+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish.</a> Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+high-throughput+reporter-gene+assays+to+detect+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).</li>
<li>Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+designer+drugs%3A+when+transformation+may+not+eliminate+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk.</a> Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu 17β-estradiol (E2), ng / L konsantrasyonlarda 23,24 de, bu maddeler için garanti tarama çevresel estrojenler iyi belgelenmiş gücü. Bu çalışmada, atık su Pis su ER tepkisi (BEQ aralığı: 2,3-17 ng E2 / L) E2 / L ng 4 0.5 &lt;yüzey suyuna (için BEQs ise, Avustralyalı atıksu arıtma tesislerinin 20 ikincil atık bildirilen biraz daha yüksek oldu ) E2 ng 11 / L) 16 yerde yüzey ve yağmur suyu (&lt;1 için rapor aralığında idi. yüzey suyu numunelerinde ölçülen ER aktivitesinin düşük seviyelerde...

Mevcut su kalitesi izleme doğru ve kesin yaban hayatı ve insanlar maruz kalma bir vekil olarak kimyasal kirleticilerin oluşumunu ölçmek için yeteneği esas alınmaktadır. Ancak, bu kimyasal-by-kimyasal izleme ve değerlendirme paradigma Karşı karşıya olduğumuz sürekli değişen kimyasal evren ayak uydurmak mümkün değil. Biz kader ve sentetik ve doğal kimyasalların etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek, biz biyolojik etkileri beklenen hitap eden ölçüm araçları aramaya devam, ve aynı zamanda bu kimyasal üretim, kullanım ve çevre girdi değişikliklere karşı bağışık bulunmaktadır. Bu tür araçlar bilinmeyen ya da yeni kimyasallar ve dönüşüm ürünleri, dikkatimizi hak edip anlamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, suda mevcut kimyasallar kompleks karışımlar zayıf tek tek kimyasal izleme ile ele alınmaktadır. Böylece, daha iyi adrese yüzey suları tha bu sorunları mevcut izleme araç kutusunu modernizasyonu sorunuyla karşı karşıyat tedavi atiksuyun ve kentsel / yağmursuyu ikinci tur atılmasını alırsınız. Son yıllarda, biyoanalitik teknikler su kalitesi değerlendirmesi için tarama araçları olarak söz göstermiştir. Bilinen yoluyla hareket eden kimyasallara tepki özellikle, in&#39;vitro biyoanalizlere olarak, eylemin 1,2 spesifik modları çevresel izleme topluma 3 büyük ilgi görmektedir. Sayısız araştırmalar içme, yüzey ve Atıksuların 4 -6 endokrin aktivitesini ölçmek için in vitro biyoanalizlere istihdam var. Ayrıca, biyo-deneylerde bir dizi molekül başlatma olaylar (örneğin, reseptör aktivasyonu), potansiyel olarak istenmeyen sonuç yolu ile zararlı etkileri ile bağlantılı olabilir 7,8 analiz hedef alır. Su kalitesi değerlendirmesi için bioscreening evrimi açısından değerlendirilmiştir edilerek in vitro biyoassay uç noktaları farklı yüzlerce nispeten hızlı olmuştur onlarınyarar 9,10. Şu anda, Biyoanalizlerin sadece bir avuç su kaliteleri 5,6 arasında ayrım yeteneği gösterirken (laboratuarlar içinde) iyi ölçüm hassasiyeti elde gösterilmiştir. Özellikle muamele edilmiş atık suyun, östrojenler ve glukokortikoid steroid oluşumu başarılı olmuştur nitro trans aktivasyon 11,12 kullanarak oluşturmaktadır. kimin hücre hatları tescilli (ve dolayısıyla yaygın olarak kullanılabilir değil) Ancak bugüne kadar birçok çalışma istihdam var biyoassayler, sürekli bakım ve manipülasyon, ya da her ikisi gerektirir. Sonuç olarak, yetenek topluluk engellenmiş kalır su kaynaklarına bu tarama teknolojisini transfer etmek sonuçta, protokolleri standardize laboratuvarlar arası kalibrasyon egzersizleri, ve. ABD ToxCast programı ile incelenen in vitro biyo-deneyler arasında en az bir teslimatçı &quot;dondurma ve çözme, kullanımı kolay 13 ticari olarak temin edilebilir4; biçimleri. Bu takım durdurulmuş hücreli &quot;setleri&quot; tedavi 14 farklı seviyelerde ifade eden sudan ekstre kimyasal aktivitesinin ölçülmesi sağlam olması gösterilmiştir. satıcı protokolleri bireysel kimyasalların veya karışımların biyo ekrana mevcut olmasına rağmen onlar su numunelerinin uygulanabilir önce, bazıları değişiklik gerektirir. Arıtılmış atıksu çıkış 15, yağmursuyu akış 16, alıcı sular 17,18 ve daha yakın dönüştürülmüş su 19,20 su kalitesi, topluluğun ilgileneceği olan sulu ortam asal örnekleridir. Bu çalışma, ticari olarak mevcut kullanarak su örneklerinde endokrin aktivitesini ölçmek için tek bir standart protokol sunar, bölünme-tutuklandı in vitro trans biyo-deneylerde. Biz tw için tepki arka doz cevap verebilen ve tekrarlanabilirlik kapsamlı bir değerlendirme ile protokol sağlamlığını gösterdiÖzellikle faiz Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör transaktivasyonunun (ER ve GR, sırasıyla) o bitiş noktaları. protokol Kaliforniya&#39;da tatlı su sistemlerinden tedavi atiksuyun ve yüzey suyunun ekran örneklerine uygulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>GeneBLAzer ER alfa DA test kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>K1393</td><td>Kiti, ER bölümü tutuklanmış (DA) hücreleri ve LiveBLAzer FRET yükleme kitini içerir.</td></tr><tr><td>GeneBLAzer GR DA test kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>K1391</td><td>Kiti, GR bölümü tutuklanmış (DA) hücreleri ve LiveBLAzer FRET yükleme kitini içerir.</td></tr><tr><td>PrestoBlue hücre canlılık reaktifi&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi, PBS Sigma-Aldrich'te %0,4</td><td>&nbsp;</td><td>T8154</td><td>ThermoFisher'da da mevcuttur</td></tr><tr><td>Corning 96 kuyulu siyah duvar, şeffaf tabanlı plaka</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Ayrı ayrı sarılmış, kapaklı steril</td></tr><tr><td>Whatman cam elyaf filtreler, GF/A, 1.6 ve mikro; M</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1820025</tr><tr><td>Mikroplaka alüminyum sızdırmazlık filmi</td><td>E & K Scientific</td><td>T592100</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 6 cc kartuş, 200 mg sorbent</td><td>Suları</td><td>WAT106202</td><td></td></tr><tr><td>17&beta; Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E2758</td><td>CAS # 50-28-2</td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A61-100</td><td>Ayrıca Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Deksametazon&nbsp'de</td> de mevcuttur;<td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D4902</td><td>CAS # 50-02-2</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td>Moleküler dereceli</td></tr><tr><td>Çözücüler (aseton, heksan, metanol)</td> <td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC sınıfı</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich & nbsp;</td><td>S2002</td><td>Kimyasal oldukça toksiktir ve dikkatli kullanılmalıdır. Koruyucu giysi kullanın ve çeker ocak altında tartın. Ayrıca EMD Millipore'da da mevcuttur.</td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı veya hemositometre</td><td>Çeşitli*</td><td></td> <td>Tedarikçiler arasında Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich ve ThermoFisher bulunur.</td></tr><tr><td>Sınıf II biyolojik güvenlik kabini</td><td>Çeşitli*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatör</td><td>Çeşitli*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik dondurucu&nbsp;</td><td>Çeşitli*</td><td></td><td>Sıvı nitrojen depolama dewar önerilir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Floresan mikroplaka okuyucu</td><td>Çeşitli*</td><td></td><td>&nbsp; Okuyucunun alt okuma özelliklerine sahip olması gerekir.</td></tr><tr><td>* Önerilen kaynak yoktur, bu ekipmanın seçimi bütçeye, kullanım sıklığına ve laboratuvar alanına bağlıdır.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

su kullanımı endokrin aktivitesi tarama piyasada satılan<em&gt; İn vitro</em&gt; transaktivasyon biyolojik tayinler

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro trans biyoanalizlere Bununla birlikte onların benimsenmesi ve yaygın uygulama nedeniyle standart yöntem ve sağlam, kullanıcı dostu teknoloji kullanılabilirlik eksikliği kısmen engellemiştir edilmiştir, su kalitesi izleme araçları olarak söz göstermiştir. Bu çalışmada, piyasada mevcut, bölünme-tutuklandı hücre hatları kantitatif çevresel kalite uzmanları ilgilendiren su örneklerinde bulunan kimyasalların endokrin faaliyeti taranması için kullanılmıştır. Kapsamlı kalite güvence / kalite kontrol dahil tek, standart bir protokol (QA / QC) denetler hücre tabanlı Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) testi kullanılarak (sırasıyla, ER ve GR) Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör aktivitesi için geliştirilmiştir. Kaliforniya (ABD) tatlı su sistemlerinden tedavi belediye atık suyun ve yüzey suyunun numuneleri, katı faz ekstraksiyon kullanılarak çıkarılan ve standardize proto kullanarak endokrin aktivitesi için analiz edildiCol. Arka plan ve bitiş noktası özgü referans kimyasallar için doz-yanıt güvenilir ölçümü için gerekli gördüğü QA / QC kurallarına araya geldi. Yüzey su örnekleri için biyoassay tarama yanıtı büyük ölçüde saptanabilir değildi. Bunun aksine, ikincil arıtma tesisleri atık örnekleri ER 392 ng deksametazon GR / L ve 17 ng 17β-estradiyol / L&#39;ye kadar, tahmini biyo-analizi eşdeğer konsantrasyonlarda (BEQs) ile en yüksek ölçülebilir aktiviteye sahiptir. bir tersiyer atık su örneği için biyolojik yanıtın, tedaviden sonra endokrin aktif kimyasalların daha düşük bir bakiye gösteren ikincil atık için ölçülen daha düşüktü. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilir kullanan nitro trans biyo-deneylerde, bölme durdurulmuş hücreli &quot;setleri&quot;, su içinde endokrin aktivitesi için taranması için adapte edilebileceğini göstermiştir.

Bu çalışmada, tedavi belediye atiksuyun 4x 24 saat kompozit numuneler, Güney Kaliforniya&#39;da tatlı su sistemlerinden yüzey sularının 6 kapmak örnekleri ve ultra saf su içeren bir alan boş bu protokolü göstermek için seçildi. 4 atık örneklerinin 3 konvansiyonel aktif çamur atıksu arıtma tesislerinde ( &quot;ikincil atık&quot;), ve kum / karbon filtrasyon eklendi sonrası biyolojik arıtma ( &quot;üçüncül atık&quot;) ile gelişmiş atık su arıtma tesisi dördüncü birinden idi. Yüzey suyu num...

Arıtılmış atık su ve yüzey (alıcı) suyu dahil olmak üzere su örneklerinin organik ekstraktlarında endokrin aktiviteyi taramak için bir protokol, ticari olarak temin edilebilen bölme tutuklu ("dondur ve çözdür") in vitro transaktivasyon biyotahlilleri kullanılarak uyarlanmıştır.

Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan<em&gt; İn Vitro</em&gt; Transaktivasyon biyolojik tayinler

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Bu standartlaştırılmış prosedürün genel amacı, ticari olarak mevcut, reseptör tabanlı hücre deneyleri kullanarak su örneklerini endokrin aktif kimyasallar açısından taramaktır. Bu yöntem, su kalitesi izleme alanındaki "endokrin aktif kimyasallar örnekte gerçekten mevcut mu?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir grup endokrin aktif bileşiği mevcut kimyasal yöntemlerden çok daha hızlı analiz edebilmesidir.Bu teknik, endokrin bozucu kimyasalların varlığından kaynaklanan su kalitesi sorunlarının teşhis edilmesine yardımcı olabilir. Bu yöntem suyla etkileşime giren kirleticiler hakkında bilgi sağlar, ancak tortu ve dokular gibi diğer çevresel matrislere de uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniği ilk kez deneyen kişiler, pipetleme tekniklerini kullanırken yüksek hassasiyet gerektirdiği için zorlanabilirler.Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı üzere, su örneğini analize özgü besiyeri ve referans kimyasalın stok çözeltileri ile hazırlayın. Analize özgü besiyerini uzun süreli saklama için dört santigrat derecede muhafaza edin. Ardından, steril bir tüp içindeki 285 µL analiz besiyerine uygun referans kim

screening-for-endocrine-activity-water-using-commercially-available

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Bu makalede, zebra balığı embriyoları kimyasal toksisite taraması için kullanılmıştır. Kimyasal toksisite, fenotip okumaları ile ilişkilidir. Numune protokolü, kimyasal toksisite taramasının gerçekleştirilmesine yönelik metodolojik bir yaklaşımı göstermektedir.

Embriyo Bazlı Kimyasal Toksisite Ekranı: Zebra Balığı Embriyolarının Geliştirilmesi Üzerindeki Etkilerin Değerlendirilmesi

Bu videoda, bitki türevli bileşiklerin östrojenik aktivitesini belirlemek için hücre bazlı bir raportör testi açıklanmaktadır. Östrojen benzeri aktiviteye sahip bir bileşik, östrojen reseptörlerine bağlanmasını taklit eder ve aşağı akış raportör enzim gen transkripsiyonunu yönlendirir. Raportör enzim, bileşiğin östrojenik aktivitesini gösteren bir reaksiyonda biyolüminesans üretir.

Fitoöstrojen Östrojenik Aktiviteyi Taramak için Östrojen Reseptör-Raportör Aktivite Testi

Otomatik ve minyatür bir sistem kullanılarak su örneklerinden östradiolün ekstraksiyonu ve ön konsantrasyonu için bir protokol sunulmuştur.

Küçük Kirleticilerin İmmünolojik Analizi Su Örneklerinin Otomatik Katı Faz Ekstraksiyon Basit Bir Yöntem

Bu el yazması, bir saha taşınabilir elektrikli hücre-substrat empedans sensöründe kullanılmak üzere Gökkuşağı alabalığı solungaç epitel hücreleri ile akışkan biyoçiplerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.  Sensörle hızlı bir içme suyu toksisitesi testi yapmak için protokol de açıklanmıştır.

Hazırlık ve Test zehirlilik için hızlı değerlendirme İçme Suyu Örnekleri için RTgill-W1 Hücreleri ile akışkan bioçipler Empedans tabanlı

Endokrin Bozucu Bileşikler (EDC) Akuatik çevre için önemli bir risk oluşturmaktadır. Belediye atıksu arıtma tesisleri yüzey sularının östrojenik etki gücüne önemli katkıda bulunmaktadır. Bu yazıda verilen metodoloji EDC kaldırılması ile ilgili etkinlik ve atıksu arıtma süreçlerinin uygunluğunun değerlendirilmesi için izin verir.

Atıksu Arıtma Süreçlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi için Kimya ve Ekotoksikolojik Yöntemlerinin bir pil kullanılması östrojenik Potency çıkarmak

Bu madde miktarının ligandlar kişisel bakım ürünlerinde (PCPs) östrojen reseptörleri alfa (ERα) ve/veya beta (ERβ) bağlamak için bir en iyi duruma getirilmiş Maya östrojen ekran sunar. Yöntem iki Renkölçer substrat seçenekleri, bir altı gün buzdolabında kuluçka kullanılmak üzere lisans dersleri ve veri analizi için istatistiksel araçlar içerir.

Kişisel bakım ürünleri için lisans öğretim laboratuvar bir maya östrojen ekran optimize kullanarak östrojenik ligandlar saptamak

Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Kantitatif yapı-aktivite ilişkisi (QSAR) modellemesi toksikolojik taramada biyoinformatik destekli bir yöntemdir. Bu protokol, sucul ortamlarda endokrin bozucuların (ED' lerin) risklerinin nasıl hesaplanabildiğini göstermektedir. OECD QSAR Toolbox'ı kullanan protokol, balıktaki ED'lerin toksisitesini analiz etmek için silico bir test uygular.

Endokrin Bozucuların Hesaplamalı SuToksikolojisi için Silico Modelleme Yöntemi: QSAR Toolbox Kullanarak Yazılım Tabanlı Bir Yaklaşım

Burada zebra balığı embriyoları Tg (vtg1: mCherry) östrojenik etkilerinin tespiti için kullanımı için ayrıntılı bir protokol dür. Protokol, balığın yayılmasını ve embriyoların tedavisini kapsar ve endokrin bozucu bileşiklerin (EDC) neden olduğu floresan sinyallerin saptanması, belgelenmesi ve değerlendirilmesini vurgular.

Endokrin Bozan Bileşiklerin Östrojenik Etkilerini Test Etmek Için Tg(Vtg1:mcherry) Zebrabalığı Embriyolarının Kullanılması

Ticari olarak mevcut bir östrojen reseptörü β muhabir testlerini, insan ve insan dışı primat gıdaları östrojenik aktivite için taramak için optimize ettik. Bilinen östrojenik insan gıda soyasının yüksek olduğunu, diğer gıdaların ise hiçbir aktivite göstermediğini göstererek bu tahlilini doğruladık.

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Tiroid Hormon Etki Göstergesi fare modeli, endojen düzenleyici mekanizmasını kullanarak lokal tiroid hormon etkisinin dokuya özgü nicelleştirilmesini sağlamak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, modelin tiroid hormon ekonomisi ile etkileşime giren endokrin bozucu kimyasalları hem ex vivo hem de in vivo metodolojilerle karakterize etmek için uygun olduğu gösterilmiştir.

Tiroid Hormon Etki Göstergesi Fare ile Endokrin Bozucu Kimyasal Etkilerin İn vivo Karakterizasyonu

Öğrenin, su örneklerinde endokrin aktif kimyasalları tespit etmek için reseptör tabanlı hücre testlerini kullanarak hızlı ve standartlaştırılmış bir protokol geliştirmeyi. Bu yöntem, su kalitesi izleme çalışmalarında değerli bilgiler sunar.

Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan

Daha fazla video keşfet