Örnek çıkarma ve eşzamanlı Kromatografik Nefelometri doksorubisin ve ilaç kombinasyonu dağıtımında nano tanecikleri tümörü taşıyan fareler takip Mitomycin C

Bu analitik protokolün genel amacı, polimer-lipid hibrit nanopartiküller tarafından birlikte verilen iki anti-kanser ilacı Doksorubisin ve Mitomisin C'yi ve Doksorubisin'in metaboliti Doksorubisinol'ü basit ve sağlam bir ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi kullanarak biyolojik matrislerde aynı anda ekstrakte etmek ve niceliklendirmektir. Bu yöntem, ilaç kombinasyonlarının nanofarmakokinetiğine dayalı etkili bir nanocarry sisteminin nasıl tasarlanacağı gibi nanotıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, HPLC'nin mobil fazını değiştirmeye gerek kalmadan aynı biyolojik matriste üç ilaç bileşiğinin aynı anda kantitasyonuna izin

Bu nedenle, bu yöntem primer meme tümörlerinde Doksorubisin, Mitomisin C ve Doksorubisinol'ün biyolojik davranışları hakkında fikir verebilir. Benzer ilaçlarla tedavi edilen diğer kanser türlerine de uygulanabilir. Etkili numune hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir.

Bu işleme başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tam kanı, ana organları ve meme tümörünü toplayın ve dondurun. Dondurulmuş dokuları hızlı bir şekilde tartın ve ağırlığı laboratuvar not defterine kaydedin. Ardından, bunları 13 mililitrelik yuvarlak tabanlı konik bir tüpe aktarın.

Ardından, bir ila beş mililitre buz gibi soğuk Hücre Lizis tamponu ekleyin. Elektrikli bir el homojenizatörü kullanarak, dokuyu 18.000 rpm'de buz üzerinde yukarı ve aşağı strok hareketiyle homojenize edin. Bundan sonra, homojenizatörün 10 milimetre testere dişi jeneratörü probunu damıtılmış deiyonize su ile yıkayın.

Probu% 70 etanol ile yıkayın ve ardından tekrar damıtılmış deiyonize su ile yıkayın. 50 mikrolitre doku homojenatı veya tam kanı 1.5 mililitrelik bir polipropilen mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, mililitre başına 2.000 nanogramlık beş mikrolitre iç standart 4-MethylUmbelliferone ile spiker.

150 mikrolitre asetonitril ve 100 mikrolitre beş milimolar amonyum asetat içeren bir buz gibi soğuk ekstraksiyon çözücüsü ekleyin. Karışımı iki dakika boyunca kuvvetlice girdaplayın. 3.000 g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Bundan sonra, 200 mikrolitre süpernatanı taze, önceden soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Işıktan koruyarak süpernatanı 60 santigrat derecede buharlaştırmak için yavaş bir nitrojen gazı akışı kullanın. Daha sonra, kurutulmuş kalıntıyı 100 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ile sulandırın.

30 saniye boyunca kuvvetlice girdap. Beş dakika boyunca 3.000 g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı bir HPLC flakon ekine aktarın.

Numune şişelerini enjeksiyon için bir otomatik numune alma tepsisine yerleştirin. Başlamak için, HPLC mobil aşamasını metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Mobil faz bileşiminin başlangıç koşullarını %16,5 H2O ve %83,5 asetonitril olarak ayarlayın.

İzokratik Akış Hızını dakikada 1.0 mililitre olarak ayarlayın. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi gradyan mobil faz koşulunu kullanarak ilaçları ayırın. Ardından, UV dedektörünü iki kanala ayarlayın: biri dahili standart 4-MetilUmbelliferon için 310 nanometrede ve diğeri Mitomisin C için 360 nanometrede. Bundan sonra, floresan dedektörünün ilk kanalını 365 nanometrelik bir uyarma dalga boyuna ve 4-MetilUmbelliferone için 445 nanometrelik bir emisyon dalga boyuna ayarlayın.

İkinci kanalı 480 nanometrelik bir uyarma dalga boyuna ve Doksorubisin ve Doksorubisinol için 560 nanometrelik bir emisyon dalga boyuna ayarlayın. Başlamak için, 15 mikrolitre numune enjekte etmek için otomatik numune alma cihazını kullanın. Programlanan gradyan mobil faz bileşimi, asetonitril bileşimini sıfırdan 18 dakikaya çıkararak otomatik olarak değişir.

18 dakika sonra, mobil faz durumu başlangıç durumuna yeniden getirilir ve bir sonraki enjeksiyon için yeniden dengelenir. Her numune çalıştırıldıktan sonra, ilaç bileşiklerinin tepe noktalarını ve alıkonma sürelerini not edin. Ardından, ilaç bileşikleri için eğrinin altındaki tepe alanını entegre etmek için HPLC yazılımını kullanın.

Metin protokolünde belirtildiği gibi, ilaç geri kazanım yüzdesini ve her bir ilaç bileşiği ile dahili standart arasındaki eğri oranının altındaki alanı hesaplayın. Bu prosedürde, iki antikanser ilacı, Doksorubisin ve Mitomisin C, Doksorubisin metaboliti, Doksorubisinol ile birlikte biyolojik girişim olmadan tespit edilir. HPLC analizi, her ilacın diğerlerinden iyi bir şekilde ayrıldığını göstermektedir.

Geliştirilen HPLC yöntemi, hem tam kanda hem de çeşitli biyolojik matrislerde incelenen ilaçların her biri için gün içi ve gün arası hassasiyet ve doğrulukta %15'ten daha az varyasyon gösterir ve bu da mükemmel tekrarlanabilirliği gösterir. Doksorubisin ve Mitomisin C'nin uzun dolaşımlı veya pegile nanopartikül bazlı birlikte verilmesinin farmakokinetik ve biyo dağılımı daha sonra belirlenir. Kanda, zaman içinde polimer-lipid hibrid nanopartiküller tarafından verilen ilaç konsantrasyonlarının, eşdeğer serbest ilaç çözeltilerinden en az altı kat daha yüksek olduğu görülmektedir.

Ortotopik bir meme tümöründe, polimer-lipid hibrid nanopartiküller, sinerjik ilaç oranlarında Doksorubisin ve Mitomisin C'yi birlikte verebilir. Serbest ilaç çözeltisi ile karşılaştırıldığında, nanopartiküllerin tümör birikiminin arttığı görülmektedir. Bu, nanopartiküllerin tümörün gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkilerinden yararlanmasına izin veren uzun süreli sistematik dolaşımdan kaynaklanmaktadır.

Geliştirilmiş Tümör Apoptozu ile birlikte 24 saat boyunca meme tümöründe kantitatif olarak belirlenen daha fazla Doksorubisinol oluşumu, ilaç biyoyararlanımının etkili bir nanopartikül formülasyonu tasarlamada kritik olduğunu göstermektedir. Bu HPLC yöntemini kullanarak, polimer-lipid hibrit nanopartiküllerin in vivo olarak kanser hücrelerine sinerjik ilaç kombinasyonunu hassas bir şekilde iletebildiği ve bunun da kemoterapinin iyileşmesine yol açabildiği başarıyla gösterilmiştir. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık iki saat içinde yapılabilir.

Potansiyel ilaç tahribatını en aza indirmek için, bu prosedürü denerken doğrudan güneş ışığından kaçınmayı ve numuneyi buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nanotıp alanındaki araştırmacının ilaç kombinasyonunun nanofarmakokinetiğini keşfetmesinin ve kanser tedavisi için etkili nanopartikül formülasyonunu daha iyi tasarlamasının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, ilaç kombinasyonunu yükleyen nanopartikül içeren çok çeşitli biyolojik numuneler üzerinde Doksorubisin, Mitomisin C ve Doksorubisin metaboliti olan Doksorubisinol'ün aynı anda nasıl ekstrakte edileceğini ve tespit edileceğini anlamalısınız.

Antikanser ilaçları ve asitle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu protokolü uygularken her zaman eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü giymek gibi güvenlik önlemlerinin uygulanması gerektiğini unutmayın.