Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi

Terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin tarafından alınır. Yöntemimizi kullanarak, antikorlar kan-beyin bariyerini geçici olarak açarak beyne iletilir. Bu teknik, antikorları fare beynine noninvaziv bir şekilde iletmemizi sağlar.

Bir hücre sayacı kullanarak mikro kabarcıkların kalite kontrolünü gerçekleştirmek için, mikro kabarcık çözeltisini amalgatörden çıkarın ve mikro kabarcık çözeltisi şişesinin septumunu delmek için 19 gauge bir iğne kullanın. 100 mikrolitre mikro kabarcıkları beş mililitre filtrelenmiş akış çözeltisinde seyreltmek için 19 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın ve 100 mikrolitre seyreltilmiş mikro kabarcık çözeltisini bir küvette 10 mililitre filtrelenmiş akış çözeltisinde pipetleyin. Küveti hücre sayacı platformunda yerine kilitleyin ve numune alımı için 30 mikronluk bir açıklığın kullanılacağından emin olun.

Yazılımda, standart çalışma yöntemini yükleyin ve standart çalışma yöntemini ve konsantrasyonu düzenle'yi seçin. Seyreltme için 5.000 kez girin ve uygula'yı ve Tamam'ı tıklayın. Uygun bir dosya adı seçmek için bilgileri düzenle'yi tıklayın. Önizleme'yi seçin ve mikro kabarcık numune konsantrasyonunun %10'dan az olduğunu doğrulayın Numune alımına başlamak için başlat ve Tamam'ı seçin.

Ölçümden sonra, hücre sayacının açıklığını filtrelenmiş akış solüsyonu ile durulayın. Seyreltilmiş mikro kabarcık çözeltisinin küvetini bir su banyosunda 30 saniye boyunca sonikleştirin. Sonicated mikro kabarcık çözeltisini gösterildiği gibi ölçün ve verileri boş olarak etiketlemek için bilgileri düzenle'yi tıklayın.

Boşluğu ölçtükten sonra, mikro kabarcık olmayan parçacıkları dışlamak için son okumayı ilk okumadan çıkarın. Bölümleri floresan anti-fare IgG antikoru ile etiketlemek için, üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında 647 dakika boyunca 0.1 molar sodyum bikarbonat tamponunda Alexa Flour 15 ile bir miligram fare IgG antikorunu etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, floresan etiketli antikor çözeltisini bir spin kolonuna yükleyin ve antikoru santrifüjleme ile saflaştırın.

Daha sonra protein konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Odaklanmış taramalı ultrason sistemini kurmak için, ultrason odağını su bolusunun tabanının dokuz milimetre altına yerleştirmek için su bolusuna beş milimetrelik bir boşluk ekleyin. Su bolusunu yaklaşık 300 mililitre gazı alınmış deiyonize su ile doldurun ve halka şeklindeki diziyi doldurulmuş su bolusuna yerleştirin.

Yüzeyde hava kabarcığı olmadığını kontrol etmek için bir diş aynası kullanın ve uygulama yazılımını başlatın. Dalga biçimi menüsünde, dalga biçimi görev döngüsünü ayarla'yı seçin ve darbe tekrarlama frekansını 10 Hertz'e, görev döngüsünü %10'a, odağı 80 milimetreye, merkez frekansını bir megahertz'e, genliği 0,65 megapaskal'a ve mekanik indeksi 0,65'e ayarlayın. Dalga biçimini tanımlamak ve dalga biçimini hafızada saklamak için set'e basın.

Tedavi planını seçtikten sonra, hareket denetleyicisi penceresindeki tarama sekmesini açın ve X boyutunda hareket için başlatma, durdurma ve artırma değerlerini ve Y yönündeki hareket için başlatma, durdurma ve artırma değerlerini girin. Tedavi bölgelerinin eylemlerini tanımlamak için olaya tıklayın ve komut dosyası düzenleme penceresini açın. Her tedavi bölgesinde seçilen sırayla yürütülecek eylemlerin bir listesini seçin ve hareket türünü raster ızgara olarak ayarlayın.

Olaylar sekmesinde eylem ekle'yi seçin ve taşımayı eşzamanlı olarak başlat tetikleyici ARB bekle ve durdur tetikleyici ARB eylemlerini komut dosyası paneline taşıyın. Ardından bekle eylemine tıklayın ve 6.000 milisaniyelik bir bekleme süresi seçin. Bir hayvanı analize hazırlamak için, anestezi uygulanmış bir farede ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, başın merkezini etiketlemek için kalıcı bir işaretleyici kullanın, ardından küçük bir kantarın dibine alt kesik olacak şekilde plastik sargı yapıştırın ve tartı teknesini ultrason jeli ile doldurun.

Odaklanmış ultrason tedavisi için, mikro kabarcıkların şişesini ters çevirin ve farenin vücut ağırlığının gramı başına bir mikrolitre çözeltiyi 29 gauge insülin şırıngasına yavaşça yükleyin. Şırıngaya 100 mikrolitre floresan etiketli antikor ekleyin ve antikoru ve şırınga içindeki mikro kabarcıkları karıştırmak için şırıngayı başparmak ve işaret parmağı arasında nazikçe ters çevirin ve yuvarlayın. Fareye dikkatlice ve yavaşça retro-orbital olarak 150 mikrolitre mikro kabarcık ve antikor çözeltisi enjekte edin ve iki dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın.

Oftalmik merhem sürün, ardından fareyi baş tutucuya yerleştirin ve burnunu tutucuya sabitleyin. Küçük ultrason jeli dolgulu tartı teknesini başınızın üzerine yerleştirin ve su bolusunu, tartı teknesi içindeki ultrason jelinin üzerine oturana kadar indirin. Ardından, dönüştürücü odağını kafanın merkezinde görsel olarak hizalamak için joystick'i kullanın.

Zamanlayıcı kapandığında, yazılımın hareket sekmesinde kaynağı sıfırla'yı seçin ve tam bir tarama seçin. Tedavi tamamlandığında, hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün ve fareyi ısıtılmış bir kurtarma odasına yerleştirin. Burada, mikro kabarcıklar doğru şekilde üretildiğinde elde edilebilecek boyut ve konsantrasyonun kültür sayacı ölçümlerinden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmektedir.

Beyin tarafından antikor alımı, bir kızılötesi tarayıcı veya bölümlerin floresan mikroskobu kullanılarak tüm beyin veya doku bölümlerinde kolayca görüntülenebilir. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, antikorun verilmesinden sonra mikroglianın daha fagositik hale gelip gelmediğini belirlemek için mikroglia belirteçleri için temsili boyama kullanılabilir. Özellikle retro-orbital enjeksiyonları gerçekleştirirken ve dönüştürücüyü farelerin başlarının üzerine uygularken hayvanların refahını ve güvenliğini sağlamak önemlidir.

Bu yöntem, hipokampus, korteks veya bireysel beyin yarım küreleri gibi beynin farklı bölgelerini hedeflemek için çeşitli tarama modellerinin uygulanmasına izin verir. Bu teknik, kan-beyin bariyerine nüfuz eden yeni tedaviler ve ilaçlar geliştirmek ve kan-beyin bariyeri oluşumu ve açılma mekanizmasını incelemek için kullanılabilir.