Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi
18 Temmuz 2020
Burada sunulan, floresan etiketli antikorları iletmek ve mikroglia'yı aktive etmek için kan-beyin bariyerini (BBB) fokal olarak veya bir fare beyni boyunca geçici olarak açmak için bir protokoldür. Ayrıca histoloji ile antikorların ve mikroglia aktivasyonunun verilmesini tespit etmek için bir yöntem sunulmaktadır.
Terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin tarafından alınır. Yöntemimizi kullanarak, antikorlar kan-beyin bariyerini geçici olarak açarak beyne iletilir. Bu teknik, antikorları fare beynine noninvaziv bir şekilde iletmemizi sağlar.
Bir hücre sayacı kullanarak mikro kabarcıkların kalite kontrolünü gerçekleştirmek için, mikro kabarcık çözeltisini amalgatörden çıkarın ve mikro kabarcık çözeltisi şişesinin septumunu delmek için 19 gauge bir iğne kullanın. 100 mikrolitre mikro kabarcıkları beş mililitre filtrelenmiş akış çözeltisinde seyreltmek için 19 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın ve 100 mikrolitre seyreltilmiş mikro kabarcık çözeltisini bir küvette 10 mililitre filtrelenmiş akış çözeltisinde pipetleyin. Küveti hücre sayacı platformunda yerine kilitleyin ve numune alımı için 30 mikronluk bir açıklığın kullanılacağından emin olun.
Yazılımda, standart çalışma yöntemini yükleyin ve standart çalışma yöntemini ve konsantrasyonu düzenle'yi seçin. Seyreltme için 5.000 kez girin ve uygula'yı ve Tamam'ı tıklayın. Uygun bir dosya adı seçmek için bilgileri düzenle'yi tıklayın. Önizleme'yi seçin ve mikro kabarcık numune konsantrasyonunun %10'dan az olduğunu doğrulayın Numune alımına başlamak için başlat ve Tamam'ı seçin.
Ölçümden sonra, hücre sayacının açıklığını filtrelenmiş akış solüsyonu ile durulayın. Seyreltilmiş mikro kabarcık çözeltisinin küvetini bir su banyosunda 30 saniye boyunca sonikleştirin. Sonicated mikro kabarcık çözeltisini gösterildiği gibi ölçün ve verileri boş olarak etiketlemek için bilgileri düzenle'yi tıklayın.
Boşluğu ölçtükten sonra, mikro kabarcık olmayan parçacıkları dışlamak için son okumayı ilk okumadan çıkarın. Bölümleri floresan anti-fare IgG antikoru ile etiketlemek için, üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında 647 dakika boyunca 0.1 molar sodyum bikarbonat tamponunda Alexa Flour 15 ile bir miligram fare IgG antikorunu etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, floresan etiketli antikor çözeltisini bir spin kolonuna yükleyin ve antikoru santrifüjleme ile saflaştırın.
Daha sonra protein konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Odaklanmış taramalı ultrason sistemini kurmak için, ultrason odağını su bolusunun tabanının dokuz milimetre altına yerleştirmek için su bolusuna beş milimetrelik bir boşluk ekleyin. Su bolusunu yaklaşık 300 mililitre gazı alınmış deiyonize su ile doldurun ve halka şeklindeki diziyi doldurulmuş su bolusuna yerleştirin.
Yüzeyde hava kabarcığı olmadığını kontrol etmek için bir diş aynası kullanın ve uygulama yazılımını başlatın. Dalga biçimi menüsünde, dalga biçimi görev döngüsünü ayarla'yı seçin ve darbe tekrarlama frekansını 10 Hertz'e, görev döngüsünü %10'a, odağı 80 milimetreye, merkez frekansını bir megahertz'e, genliği 0,65 megapaskal'a ve mekanik indeksi 0,65'e ayarlayın. Dalga biçimini tanımlamak ve dalga biçimini hafızada saklamak için set'e basın.
Tedavi planını seçtikten sonra, hareket denetleyicisi penceresindeki tarama sekmesini açın ve X boyutunda hareket için başlatma, durdurma ve artırma değerlerini ve Y yönündeki hareket için başlatma, durdurma ve artırma değerlerini girin. Tedavi bölgelerinin eylemlerini tanımlamak için olaya tıklayın ve komut dosyası düzenleme penceresini açın. Her tedavi bölgesinde seçilen sırayla yürütülecek eylemlerin bir listesini seçin ve hareket türünü raster ızgara olarak ayarlayın.
Olaylar sekmesinde eylem ekle'yi seçin ve taşımayı eşzamanlı olarak başlat tetikleyici ARB bekle ve durdur tetikleyici ARB eylemlerini komut dosyası paneline taşıyın. Ardından bekle eylemine tıklayın ve 6.000 milisaniyelik bir bekleme süresi seçin. Bir hayvanı analize hazırlamak için, anestezi uygulanmış bir farede ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, başın merkezini etiketlemek için kalıcı bir işaretleyici kullanın, ardından küçük bir kantarın dibine alt kesik olacak şekilde plastik sargı yapıştırın ve tartı teknesini ultrason jeli ile doldurun.
Odaklanmış ultrason tedavisi için, mikro kabarcıkların şişesini ters çevirin ve farenin vücut ağırlığının gramı başına bir mikrolitre çözeltiyi 29 gauge insülin şırıngasına yavaşça yükleyin. Şırıngaya 100 mikrolitre floresan etiketli antikor ekleyin ve antikoru ve şırınga içindeki mikro kabarcıkları karıştırmak için şırıngayı başparmak ve işaret parmağı arasında nazikçe ters çevirin ve yuvarlayın. Fareye dikkatlice ve yavaşça retro-orbital olarak 150 mikrolitre mikro kabarcık ve antikor çözeltisi enjekte edin ve iki dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın.
Oftalmik merhem sürün, ardından fareyi baş tutucuya yerleştirin ve burnunu tutucuya sabitleyin. Küçük ultrason jeli dolgulu tartı teknesini başınızın üzerine yerleştirin ve su bolusunu, tartı teknesi içindeki ultrason jelinin üzerine oturana kadar indirin. Ardından, dönüştürücü odağını kafanın merkezinde görsel olarak hizalamak için joystick'i kullanın.
Zamanlayıcı kapandığında, yazılımın hareket sekmesinde kaynağı sıfırla'yı seçin ve tam bir tarama seçin. Tedavi tamamlandığında, hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün ve fareyi ısıtılmış bir kurtarma odasına yerleştirin. Burada, mikro kabarcıklar doğru şekilde üretildiğinde elde edilebilecek boyut ve konsantrasyonun kültür sayacı ölçümlerinden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmektedir.
Beyin tarafından antikor alımı, bir kızılötesi tarayıcı veya bölümlerin floresan mikroskobu kullanılarak tüm beyin veya doku bölümlerinde kolayca görüntülenebilir. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, antikorun verilmesinden sonra mikroglianın daha fagositik hale gelip gelmediğini belirlemek için mikroglia belirteçleri için temsili boyama kullanılabilir. Özellikle retro-orbital enjeksiyonları gerçekleştirirken ve dönüştürücüyü farelerin başlarının üzerine uygularken hayvanların refahını ve güvenliğini sağlamak önemlidir.
Bu yöntem, hipokampus, korteks veya bireysel beyin yarım küreleri gibi beynin farklı bölgelerini hedeflemek için çeşitli tarama modellerinin uygulanmasına izin verir. Bu teknik, kan-beyin bariyerine nüfuz eden yeni tedaviler ve ilaçlar geliştirmek ve kan-beyin bariyeri oluşumu ve açılma mekanizmasını incelemek için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, fare modellerinde geçici olarak kan-beyin bariyerini (BBB) açarak floresan işaretli antikorların ve mikroglianı aktive ederek beyne teslimatını kolaylaştıran bir yöntem sunar. Yöntem, beyinde antikor alımının noninvaziv teslimatını ve histolojik tekniklerle izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- İmmünoloji
- Terapi teslimi
Arka Plan
- Kan-beyin bariyeri, terapötik antikorların beyne alımını sınırlar.
- Mikroglia beyin bağışıklık tepkilerde kritik bir rol oynar.
- BBB açma ve antikor teslimi için mevcut yöntemler sınırlıdır.
- Floresan işaretleme, antikor alımının ve mikroglia aktivasyonunun görselleştirilmesine yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Antikor teslimi için BBB'yi geçici olarak açan bir protokol geliştirmek.
- Kontrollü bir deney ortamında mikrogliayı aktive etmek.
- Bu teslim yönteminin etkinliğini histoloji yoluyla değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Yöntem, fare beynine odaklı ultrason ve mikrokabarcık enjeksiyonu içerir.
- Kullanılan ana biyolojik model anestezi altındaki farelerdir.
- Önemli adımlar arasında mikrokabarcıkların ve antikorların hazırlanması ve dikkatli ultrason hedeflemesi bulunur.
- Floresan antikorlar arıtılır ve mikroglial hücrelerle etkileşimi ölçmek için görselleştirilir.
Ana Sonuçlar
- Teknik, beyne antikor teslimatını başarıyla gösterdi.
- Mikroglia, antikor uygulamasından sonra artan fagoositik aktivite gösterdi.
- Görselleştirme teknikleri, antikorların etkin lokalizasyonunu ve alımını doğruladı.
- Tarama kalıpları, belirli beyin bölgelerine hedeflenmeyi sağlayarak potansiyel terapötik uygulamaları genişletti.
Sonuçlar
- Bu çalışma, BBB boyunca terapötik antikor teslimatını artırmak için güvenilir bir yöntem sunar.
- İlaç geliştirme ve beyin mekanizmalarını anlama konusunda gelecekteki araştırmalara yeni yollar açar.
- Bulgular, bu yöntemin nörоиmmünolojik etkileşimler çalışmasındaki potansiyelini vurgulamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Focused scanning ultrasound (SUS) with microbubbles enables transient blood-brain barrier opening to enhance antibody delivery into the brain, addressing a key limitation in neurodegenerative disease therapeutics. This noninvasive approach improves target engagement and supports mechanistic de-risking by allowing quantitative assessment of antibody biodistribution and cellular uptake. The method provides predictive confidence in early discovery by validating brain penetration of antibody candidates before costly preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic antibody access to brain targets, supporting target validation in neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess antibody biodistribution and target engagement in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of antibody-delivered brain tissue for downstream histological and imaging assays.
- Operational Value: Standardizes delivery parameters to ensure consistent antibody exposure across experimental groups.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant antibody delivery to evaluate target modulation and pathway engagement in preclinical models.
- Operational Value: Enables region-specific delivery (e.g., hippocampus, cortex) to align with disease pathology and biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum by enabling early validation of antibody brain penetration, informing lead identification decisions, and supporting preclinical continuity through region-specific delivery and microglial activity readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody access to brain targets and pathway clarification via enhanced delivery.
- Screening: Delivers antibodies consistently to brain tissue, enabling reliable compound or target evaluation in vivo.
- Analytics: Provides quantitative readouts of antibody concentration in brain and microglial phagocytosis as a functional biomarker of engagement.
- Translational Research: Connects delivery efficiency to preclinical validation by enabling antibody access to disease-relevant brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing BBB permeability of diverse antibody formats across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antibody brain uptake, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible antibody exposure across studies through controlled ultrasound and microbubble parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early brain exposure data, reducing late-stage failure risk due to poor CNS penetration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibody candidates based on validated brain delivery efficiency.
Implementation Considerations
- Expertise in ultrasound physics, microbubble handling, and in vivo imaging is required for accurate setup and execution.
- Instrumentation includes a focused ultrasound transducer, water bolus, microbubble preparation system, and fluorescence detection tools.
- Cross-team standardization is needed for ultrasound parameters (frequency, amplitude, duty cycle) and injection protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation across models requires adjustment of scanning patterns and ultrasound targeting to match brain anatomy and disease-relevant regions.
- Practical limitations include variability in BBB opening efficiency and the need for careful animal welfare monitoring during retro-orbital injection and transducer application.
