Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

DNA, RNA ve proteinin multipleks immünofloresan hücre tabanlı tespiti yaklaşımımız, tek hücreler içindeki farklı tip ve sarmallı proteinleri ve nükleik asitleri aynı anda görselleştirmemizi sağlar. Tohumlamadan önce, örtü fişlerini etanol içinde beş dakika inkübe edin, ardından PBS'de iki dakikalık iki yıkama yapın. İkinci yıkamadan sonra, kapak astarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca mililitre başına 20 mikrogram poli-D-lizin içine tamamen batırın.

İnkübasyonun sonunda, fazla matris çözeltisini PBS'de iki yıkama ile çıkarın ve ilgilenilen hücreleri, örtü kayma konsantrasyonu başına 50 mikrolitre PBS başına 1 x 10'da altıncı hücrelere seyreltin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir poli-D-lizin kaplı örtü astarı üzerine ilgilenilen hücrelerin 50 mikrolitresini tohumlayın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitlemeden önce PBS'de üç kez yıkayın.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de 500 mikrolitre% 0.1 Tween 20 ile geçirgen hale getirmeden önce hücreleri PBS'de iki kez yıkayın. İnkübasyonun sonunda, her bir kapak fişini yıkama başına 500 mikrolitre taze PBS ile iki kez yıkayın. Kapak fişini bir cam slayt üzerine hareketsiz hale getirmek için, sterilize edilmiş bir cam slayt üzerine küçük bir damla şeffaf oje yerleştirin ve kapak fişinin hücresiz tarafının bir kenarını oje damlasının üzerine yerleştirin ve kapak fişini yukarı bakacak şekilde sürgülü hücre tarafına indirin.

Hücrelerin dehidre olmasını önlemek için hareketsiz hale getirilmiş kapak fişine birkaç damla PBS ekleyin ve kapak fişinin dışına bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Bariyer çekildiğinde, PBS'yi 100 mikrolitre proteaz III ile değiştirin ve slaytı 15 dakika boyunca 40 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, slaytları taze PBS'de iki kez, her yıkamada iki dakika boyunca sallanarak yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, ilgilenilen probu 200 mikrolitre hibridizasyon tamponunda 67 santigrat derecede 10 dakika seyreltin. İnkübasyonun sonunda, her bir kapak kızağına 50 mikrolitre prob çözeltisi ekleyin ve slaytları iki saat boyunca nemlendirilmiş 40 derece fırına yerleştirin. Kuluçka işleminin sonunda, slaytları taze yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve yıkama başına iki dakika sallayın.

İkinci yıkamadan sonra, fazla tamponu çıkarmak için slaytlara dokunun ve kapak fişlerine 1, 2 ve 3 numaralı floresan kanalları için bir damla amplifikatör ile 30 dakikalık, 40 santigrat derece inkübasyon için 30 dakikalık, 40 santigrat derece inkübasyon ile işlem yapın ve yeni yıkama tamponunda iki iki dakikalık yıkama ile tedaviler arasında yıkama başına sallanma. Son yıkamadan sonra, 4 derecelik fırında 15 dakikalık bir inkübasyon için kapak kızağına bir damla floresan kanal 40 amplifikatör ekleyin ve slaytı gösterildiği gibi iki kez yıkama tamponu ile ve bir kez PBS ile yıkayın. İlgilenilen proteinlerin immün boyaması için, son yıkamadan sonra, her bir örtü astarını oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyon için 200 mikrolitre bloke edici tampon ile muamele edin.

İnkübasyonun sonunda, bloke edici tamponu boşaltın ve PBS artı Tween 20'de seyreltilmiş 200 mikrolitre ilgilenilen antikoru ekleyin,% 1 sığır serum albümini ile desteklenmiştir. Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir ikincil antikorla etiketlemeden önce, slaytları taze PBS artı Tween 20'de 10 dakikalık iki yıkama ile yıkama başına çalkalayarak yıkayın. Kuluçka süresinin sonunda, slaytları taze PBS artı Tween 20 ile yıkama başına çalkalanarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, çekirdekleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca uygun bir nükleer boya ile karşı boyayın, ardından PBS'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çalkalayarak iki yıkama yapın. Numuneleri görüntüleme için monte etmek için, numune başına bir yeni steril cam slayt üzerine bir damla antifade solüsyonu yerleştirin ve solüsyonu yaklaşık olarak kapak fişlerinin büyüklüğünde bir alanı kaplayacak şekilde yayın. Kapak fişlerini kızaklarından ayırın ve lamel fişleri PBS'ye batırın.

Kalan ojeyi çıkarmak için forseps kullanın ve kapak fişinin arkasını bir laboratuvar mendiliyle kurulayın. Ardından, her bir kapak kayma numunesini aşağı bakacak şekilde antifade solüsyonunun üzerine nazikçe yerleştirin ve numunelerin gece boyunca kurumasını bekleyin. Bu prosedürün konseptinin bir kanıtı olarak, HIV-1 DNA, RNA ve protein aynı anda etiketlendi ve tek hücre düzeyinde mikroskobik olarak görselleştirildi.

Bu örnekte, iki HIV-1, DNA genomu, viral RNA'yı aktif olarak kopyalarken tek bir hücre içinde görselleştirilebilir. Viral RNA, nükleer gözenek kompleksi yoluyla dışa aktarıldı ve viral protein sitoplazmada sentezlendi. Gözlemlendiği gibi, prob çapraz reaktivitesi potansiyeline sahip iki retrovirüs ile etiketlenmesine rağmen, iki virüs boyunca prob setleri arasında çok az çapraz reaktivite gözlenir veya hiç gözlenmez.

Ek olarak, numune hazırlama sırasında hücreler RNaz ile muamele edilirse viral RNA boyaması ortadan kaldırılabilir. Her görüntüdeki hücre başına antikor sinyalinin ortalama entegre floresan yoğunluğu daha sonra ölçülebilir. Gözlendiği gibi, HBV pre-genomik RNA ve toplam HBV RNA miktarı, HBV enfeksiyonu boyunca artar.

HCV enfeksiyonu görüntülemesi, ilgilenilen floroforları tespit etmek için 60X yağa daldırma objektifi kullanılarak konfokal mikroskopi yoluyla da gerçekleştirilebilir. Bu son derece spesifik yaklaşım, aynı zamanda yüksek uzaysal zamansal çözünürlüğe sahip viral veya hücresel süreçlerin izlenmesine de izin verir. Ek olarak, bu teknik birden fazla virüs ve diğer patojenleri incelemek için kullanılabilir.