Name: Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Öğrenin, tek hücreli çoklanmış immünofloresan görüntüleme ile HIV, HBV ve HCV gibi virüslerin DNA, RNA ve proteinlerini eş zamanlı görselleştirin. Bu yöntem, viral enfeksiyon dinamiklerini yüksek çözünürlükle izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma tamamen veya kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ve U54 AI150472) tarafından desteklenmiştir. Dr. Raymond F. Schinazi ve Sadie Amichai'ye influenza A Virüsü ile enfekte olmuş hücreleri sağladıkları için teşekkür ederiz.

1. Kapak kapakları veya oda slaytları üzerindeki tohum hücreleri (Süspansiyon vs Yapışkan Hücreler) (sunulan protokol kapakları kullanır).
<ol><li>Süspansiyon hücrelerinin tohumlanması<ol><li>Poli-D-lizin (PDL) kaplı örtü kızaklarını hazırlayın (süspansiyon hücrelerinin örtü kaymasına yapışmasını kolaylaştırır) önce 5 dakika boyunca etanol (EtOH) içindeki örtü kaymalarını inkübe ederek (örtü kaymalarını sterilize eder ve herhangi bir kalıntıyı giderir). Daha sonra, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika (dak) boyunca PDL'de (20 μg / mL) örtüleri inkübe etmeden önce fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın.</li>
		<li>PDL'yi çıkarın ve PBS'de 2 kat yıkayın. Pelet hücreleri (istenen görüntüleme koşullarına göre daha önce enfekte edilmiş / tedavi edilmiş) ve 50 μL PBS'de 106hücreyi yeniden askıya alır. Cam üzerinde (PDL kaplı) 50 μL hücre tespit edin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Yapışkan hücrelerin tohumlanması<ol><li>Steril örtü üzerindeki kültür hücreleri, 6 kuyucuklu tabağa yerleştirilir ve hücreleri viral parçacıklarla enfekte eder veya ilgilenilen bileşikle tedavi eder. Görüntüleme deneyleri için numune hazırlamadan önce hücrelerin% 50-70 akıcılığa ulaşmasına izin verin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hücresel fiksasyon: Floresan görüntüleme çalışmaları için hücresel morfolojiyi korumak
NOT: Hücresel fiksasyondan önce RT'de %4 PFA ve PBS'yi en az 30 dakika tutun.
<ol><li>Hücresel ortamı aspire edin, PBS'de kapak kapaklarındaki hücreleri 3 kat yıkayın ve hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. PFA'yı aspire edin ve hücreleri PBS 2x'te yıkayın. NOT: Deneyci deneye başka bir tarihte devam etmek isterse, hücreler artık kurutulabilir ve saklanabilir. Sabit hücreler depolamadan önce EtOH'de dehidre edilebilir.<ol><li>Hücresel fiksasyondan sonra yıkamayı takiben PBS'yi çıkarın ve 500 μL% 50 EtOH (suda v / v) ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.</li>
		<li>%50 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %70 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.</li>
		<li>%70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %100 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.</li>
		<li>% 100 EtOH'yi çıkarın ve% 100 EtOH ile değiştirin. NOT: Susuz hücreler 6 ay boyunca -20 °C'de saklanabilir. EtOH'nin buharlaşmasını önlemek için depolamadan önce plakaları bant veya parafilm ile kapatın.</li>
		<li>Hücrelerin/virüslerin çoklanmış floresan etiketlemesine geçmek için hücreleri rehidratlayın.</li>
		<li>% 100 EtOH'yi çıkarın ve% 70 EtOH'nin 500 μL'si ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Hücrelerin hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin. Tüm hücreleri batırmak için her zaman yeterli çözelti kullanın.</li>
		<li>%70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %50 EtOH ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>% 50 EtOH'yi çıkarın ve 1x PBS ile değiştirin. NOT: Proteaz seyreltme, hibridizasyon probları ve yıkama tamponunu proteaz tedavisi (Adım 4) ve hedef prob uygulamasından (Adım 5) önce hazırlayın. Reaktif hazırlama ile ilgili özel talimatlar, ilgili her adımın başında sunulmaktadır.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Diğer Notlar</td>
		</tr><tr><td>Proteaz çözeltisi</td>
			<td>1X PBS'de hazırlanın</td>
		</tr><tr><td>Hedef oligonükletodie probu(ları)</td>
			<td>Hibridizasyon tamponunda seyreltin</td>
		</tr><tr><td>Yıkama tamponu</td>
			<td>Hedef hibridizasyon adımlarını izleyerek yıkarlar</td>
		</tr><tr><td>Hibridizasyon tamponu</td>
			<td>Tablo 3'te sunulan tarif</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: MICDDRP protokolündeki anahtar reaktifler.
3. Hücre geçirgenliği: Büyük moleküllerin (antikorlar, nükleik asit hibridizasyon probları) girişi için hücre ve hücresel organellere erişimi arttırır
<ol><li>Hücresel fiksasyon veya rehidrasyondan sonra 1x PBS'yi çıkarın ve 1x PBS'de 500 μL% 0.1 (v / v) Ara-20 ile değiştirin. RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Tek tek değiştirin. 500 μL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve taze 1x PBS ekleyin.</li>
</ol>4. Hibridizasyon verimliliğini artırmak için sabit viral/hücresel nükleik asitten nükleik asit bağlayıcı proteinleri uzaklaştırmak için cam slayt üzerinde coverslip immobilizasyonu ve proteaz işlemi
NOT: Hücresel geçirgenlik sırasında seyreltilmiş Proteaz III (Malzeme Tablosundaki reaktifin özelliklerine bakınız) çözeltisini hazırlayın. Proteazın geçirgenlikten önce 10 dakika boyunca RT'ye ulaşmasına izin verin.
<ol><li>Sterilize edilmiş bir cam slaytın üzerine küçük bir damla oje yerleştirin. Arkanızı kurutun (hücre tabakası olmayan taraf) ve kapak kaymasının kenarını oje damlasının üzerine, yapıştırılmış hücrelerin yukarı baktığı tarafı olacak şekilde yerleştirin. Kurumayı önlemek için hareketsiz kapak kapağına birkaç damla PBS ekleyin.<ol><li>Hidrofobik bariyer kalemi (reaktifleri hücreler üzerinde lokalize tutan su itici kalem) kullanarak slayta yapıştırılan kapak kaymasının çevresine bir daire (kapak kaymasından yaklaşık 3 mm uzaklıkta) çizin.</li>
	</ol></li>
	<li>Protease III'ü 1x PBS (100 μL/coverslip) içinde seyreltin. NOT: Proteaz konsantrasyonunun, ampirik optimizasyon yoluyla hücre tipleri, problar veya hedef nükleik asit (ler) deki farklılıklara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ( Bkz. Tartışma). Farklı viral sistemlerde en verimli RNA / DNA etiketlemesi için, aşağıdaki Tablo 2'de sunulan aşağıdaki seyreltmelerle, (1 ila 2 ) - (1 ila 15) (proteaz ila 1x PBS) arasında değişen seyreltmelerle başarı elde ettik.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Prob Hedefleri</td>
			<td>1X PBS'de Proteaz Seyreltme (Proteaz III - 1X PBS)</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 ila 5</td>
		</tr><tr><td>HTLV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 ila 5</td>
		</tr><tr><td>HBV pgRNA ve toplam HBV RNA</td>
			<td>1 ila 15</td>
		</tr><tr><td>IAV RNA</td>
			<td>1 ila 15</td>
		</tr><tr><td>ZIKV RNA</td>
			<td>1 ila 2</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: PBS'de viral nükleik asit hibridizasyonu için proteaz III dilüsyonları.
<ol start="3"><li>İmmobilizasyonu takiben 1x PBS'yi kapak kapağı üzerinde boşaltın ve seyreltilmiş Proteaz III'ü uygulayın.</li>
	<li>Nemlendirilmiş bir fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Dekant proteaz çözeltisi ve daldırma slaytları 1x PBS'de. RT'de 2 dakika boyunca sallanan bir tabakla çalkalayın. Yeni 1x PBS ile tekrar yıkayın.<ol><li>Sadece DNA tespiti için, numuneleri her biri 2 dakika boyunca nükleaz içermeyen suyla üç kez yıkayın, ardından 37 ° C'de 30 dakika boyunca PBS'de seyreltilmiş 5 mg / mL RNaz A ile inkübasyon yapın.</li>
		<li>Decant RNase Bir çözelti ve ultra saf su ile 2 dakika boyunca 3x yıkayın. Hedef probun (lar) ın ISH ile devam edin. NOT: Hibridizasyon tamponu, sunulan sonuçlar için vRNA boyama verimliliğini etkilemeden vDNA tespitini geliştirir (Temsili Sonuçlar). DNA Kanal 1 (C1) probları 1:1'i hibridizasyon probu ile seyreltin. RNA C2 ve C3 problarını hibridizasyon tamponunda seyreltin. Görüntüleme çalışmalarımızda kullanılan C2 ve C3 probları 50X çözeltilerdedir (1:50; hibridizasyon tamponuna hedef prob).</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adım adım prosedürü izleyerek nükleaz içermeyen suda hibridizasyon tamponunu hazırlayın:<ol><li>15 mL'lik bir tüpte, 700 μL nükleaz serbest su, 300 μL% 50 (ağırlık / hacim (w / v)) dekstran sülfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM sodyum sitrat (pH 6.2) ve 375 mg (toz) etilen karbonat ekleyin.</li>
		<li>Etilen karbonatı çözmek için bir vorteks kullanarak iyice karıştırın (tüm tozun çözündüğünden ve berrak bir çözelti olduğundan emin olun).</li>
		<li>Ara-20'nin 25 μL'si (hacim/hacim (v/v)) %10 (hacim/hacim (v/v)) ve 2,5 mL'yi (2x çözelti) tamamlamak için yeterli nükleaz içermeyen su ekleyin. NOT: Sunulan hibridizasyon tamponunun tarifi aşağıdaki Tablo 3'te bulunabilir. Çözüm bir hafta boyunca kararlıdır. Çözeltinin köpürmesini önlemeye dikkat ederken, Tween-20 deterjanının yeterli miktarda karıştırıldığından emin olun.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Stok Konsantrasyonu</td>
			<td>Ek Notlar</td>
		</tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Dextran sülfat</td>
			<td>%50 (w/d)</td>
			<td>Çok viskoz</td>
		</tr><tr><td>Sodyum klorür</td>
			<td>5 milyon</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sodyum sitrat (pH 6.2)</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>4 °C'de depolayın</td>
		</tr><tr><td>Etilen karbonat</td>
			<td>NA</td>
			<td>Toz</td>
		</tr><tr><td>Ara-20</td>
			<td>%10 (d/d)</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Reaktiflerin hibridizasyon tampon listesi.
5. DNA / RNA hedef hibridizasyon probları ile inkübasyon: Hedef oligonükleotid probları, ilgilenilen bölgelere bağlanır ve ön amplifikatörlerin, amplifikatörlerin ve floresan probların bağlanması için moleküler bir iskele oluşturur.
NOT: DNA / RNA problarını 40 ° C'de 10 dakika boyunca (Hücre Geçirgenliği sırasında) ısıtın ve RNaz tedavisi dahil değilse en az 10 dakika boyunca RT'ye soğutun. Hedef prob hibridizasyonundan önce RNaz tedavisi veya daha fazla numune tedavisi gerekiyorsa, buna göre probları ısıtın. Isındıktan sonra C2 ve C3 problarını döndürün ve hibridizasyon tamponunda seyreltin. Seyreltmeden sonra, C2 ve C3 probları kısaca ısıtılabilir. Sıcak 50x yıkama tamponu (Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakınız) 40 ° C'de 10-20 dakika boyunca ve moleküler biyoloji sınıfı suda 1x'e kadar seyreltin.
<ol><li>Hibridizasyon prob(lar)ının eklenmesinden önce 10 dakika boyunca 67 °C'de 200 μL hibridizasyon tamponunu inkübe edin. Probu hibridizasyon tamponunda seyreltin ( Tablo 2'de listelenen tarif). 50 μL/coverslip ekleyin.</li>
	<li>Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 2 saat (s) boyunca inkübe edin. Dekant problar ve daldırma kızakları 1x yıkama tamponuna. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın.</li>
</ol>6. Amplifikatör (Amper) 1-FL Hibridizasyonu: Hedef DNA / RNA problarının kuyruk dizisine tamamlayıcı olan ön amplifikatörün eklenmesi (Adım 5)
NOT: Amplifikatörler kullanılmadan önce RT'de olmalıdır. Her bir amplifikatörü kullanmadan 30 dakika önce buzdolabından çıkarın ve RT'deki bankta bırakın.
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amper 1-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Decant Amp 1-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.</li>
</ol>7. Amper 2-FL Hibridizasyonu: Ön amplifikatörlere konyak tanıma sırasına sahip sinyal amplifikatörü ile inkübasyon (Amp 1-FL)
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amp 2-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Decant Amp 2-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.</li>
</ol>8. Amper 3-FL Hibridizasyon: İkinci sinyal amplifikatörü ile inkübasyon
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amper 3-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Decant Amp 3-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.</li>
</ol>9. Amper 4-FL Hibridizasyon: Floresan etiket ve son hibridizasyon adımı
NOT: İlk olarak, hedef probun (lar) kanallarına göre uygun Amp 4 (A, B veya C) - FL'yi seçmek için Tablo 4'e bakın. İlgilenilen DNA / RNA'yı etiketlemek için hangi Amp 4-FL'nin gerekli olduğunu değerlendirin. Aşağıdaki tabloda bir örnek verilmiştir:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>DNA Kanal 1 (C1)</td>
			<td>488</td>
			<td>550</td>
			<td>550</td>
		</tr><tr><td>DNA/RNA Kanal 2 (C2)</td>
			<td>550</td>
			<td>488</td>
			<td>647</td>
		</tr><tr><td>RNA Kanal 3 (C3)</td>
			<td>647</td>
			<td>647</td>
			<td>488</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 4: Çoklanmış ISH için Amp 4 (A, B veya C)-FL floresan probu seçimi.
NOT: Çoğullanmış FISH (birden fazla hedef) için, doğru Amp 4 (A, B veya C)- FL'yi seçmek, ilgilendiğiniz hedefi (hedefleri) doğru şekilde etiketlemek için kritik öneme sahiptir. Hedef problar (Adım 5), seçilen Amp 4-FL'ye bağlı olarak ilgili floresan etiketlerini (Alexa 488, Atto 550 veya Alexa 647) dikte eden farklı renk kanallarına (C1, C2 veya C3) sahiptir. Çoklanmış görüntüleme için florofor kombinasyonlarının seçilmesine ilişkin örnekler Şekil 2 ve Şekil 3 açıklamalarında verilmiştir. Ek bir örnek olarak, Amp 4B-FL seçimi, DNA C1 problarını Atto 550 ile ve RNA C3 problarını Alexa 647 ile seçici olarak etiketleyecektir.
<ol><li>Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.</li>
	<li>Kapak kapağına 1 damla Amper 4-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Adım 9.2'yi takiben, örnekleri ışıktan korunarak kapalı tutun.</li>
	<li>Decant Amp 4-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. 1x PBS (2 dakika) ile yıkayın ve PBS'de saklayın.</li>
</ol>10. Protein immün boyama: İlgilenilen proteinleri etiketlemek için
<ol><li>PBS'yi boşaltın ve kapak kapağına 200 μL blokaj tamponu ekleyin (%1 BSA ile, %10 v/v FBS ile PBS'de %0,1 v/v Ara-20 (PBST)). RT'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Dekant bloke edici tampon ve PBST'de seyreltilmiş 200 μL primer antikor + % 1 w / v BSA uygulayın. RT'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>PBST'de RT'de 1 saat boyunca tercih edilen sekonder antikoru + BSA ile% 1 uygulayın.</li>
	<li>Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika yıkayın.</li>
</ol>11. Nükleer boyama: İmmün boyama sonrası karşı leke çekirdekleri
<ol><li>PBST'yi boşaltın ve RT'de 1 dakika boyunca DAPI veya nükleer leke seçin.</li>
	<li>Slaytı PBS ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.</li>
</ol>12. Montaj
<ol><li>Yeni steril cam sürgü üzerine 1 damla antifade çözeltisi (örneğin, Uzatma Altın) yerleştirin (İlk olarak, EtOH ile kaydırağı temizleyin ve cam üzerinde kalıntı kalmamasını sağlamak için kurumaya bırakın). Aynı uçla, antifade çözeltisi damlasını, yaklaşık olarak kapak kaymasının büyüklüğünde bir alanı kaplayacak şekilde yayın. NOT: Antifade çözeltisi çok viskozdur ve pipet uygulaması zor olabilir. Pipetlemeden önce ucun 200 μL'lik bir uçtan kesilmesi bu sorunları hafifletebilir.</li>
	<li>Slayttan hücre örneği içeren kapak kaymasını çıkarın ve forseps ve PBS kullanarak arkadaki artık ojeyi çıkarmak için PBS'ye batırın. Kuru forseps ve bir Kimwipe kullanarak kapak kaymasının arkası.</li>
	<li>Antifade çözeltisinin damlasına hafifçe yerleştirilmiş örtü kayması, damla üzerine kapak kaymasının numune tarafını (hücre tabakası ile yan taraf) yerleştirin).</li>
	<li>Numunelerin gece boyunca kurumasını bekleyin.</li>
</ol>13. Görüntüleme
<ol><li>Epifloresan mikroskoplu görüntü.</li>
</ol>

<ol><li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li>
<li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li>
<li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882(2017).</li>
<li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li>
<li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7721(2019).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
<li>Bushnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProbeDesigner%3A+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+%28bDNA%29+signal+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li>
<li>Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+HIV-1+Genomic+DNA+from+Entry+through+Productive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection.</a> Journal of Virology. 91 (9), (2017).</li>
<li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26 (1), 10-18 (2002).</li>
<li>Francis, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505(2020).</li>
<li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi genellikle kapsamlı optimizasyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem 5-etinil-2-deoksiüridin (EdU) etiketleme ve DNA FISH'tir. EdU etiketlemesi, viral DNA ve proteini aynı anda görselleştirmek için uygulanmıştır, çünkü EdU yeni ortaya çıkan DNA'ya dahil edilir ve daha sonra tıklama kimyası yoluyla azid içeren floresan boyalarla etiketlenir. Bu nedenle EdU etiketlemesi, DNA virüslerinin veya virüslerin yerel virüs replikasyon kinetiğini replika...

Geleneksel immün boyama yaklaşımlarıyla proteinleri spesifik olarak etiketlemek için binlerce ticari antikor mevcut olsa da ve füzyon proteinleri, bir örnek1'deki birden fazla proteini izlemek için foto-optimize floresan etiketlerle tasarlanabilirken, proteinin mikroskobik görselleştirilmesi genellikle geleneksel DNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) ile uyumlu değildir2 . Floresan tabanlı yaklaşımlar kullanılarak DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesindeki teknik sınırlamalar, virüs replikasyonunun derinlemesine anlaşılmasını engellemiştir. Enfeksiyon sırasında hem viral nükleik asidin hem de proteinin izlenmesi, virologların virüs replikasyonu ve montajı 3,4,5,6'nın altında yatan temel süreçleri görselleştirmelerini sağlar.
Nükleik asit tespitinin duyarlılığını artırmak için dallanmış DNA (bDNA) in situ teknolojisini kullanan DNA, RNA ve Protein'in (MICDDRP)3'ün multiplex immunofloresan cell tabanlı detection'u adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik 7,8,9 . Ek olarak, bu yöntem gelişmiş özgüllük için eşleştirilmiş problar kullanır. bDNA dizisine özgü problar, yoğun ve lokalize bir sinyal üretmek için dallanma preamplifikatörü ve amplifikatör DNA'larını kullanır ve DNA9'da tekrarlanan bölgeleri hedeflemeye dayanan önceki hibridizasyon yöntemlerini geliştirir. Klinik bağlamda enfekte olmuş hücreler genellikle bol miktarda viral genetik materyal içermez ve tanısal ortamlarda floresan nükleik asit tespiti için hassas bir yöntem için bir emtia sağlar. bDNA teknolojisinin RNAscope7 ve ViewRNA10 gibi yaklaşımlarla ticarileştirilmesi bu nişi doldurmuştur. bDNA floresan görüntülemenin duyarlılığı, hücre kültürü modellerinde kıt nükleik asit türlerinin tespit edilmesine izin veren hücre biyolojisinde de önemli bir faydaya sahiptir. Duyarlılığın büyük ölçüde artması, bDNA tabanlı görüntüleme yöntemlerini virüsleri incelemek için uygun hale getirir. Bununla birlikte, potansiyel bir eksiklik, bu yöntemlerin RNA veya RNA ve proteini görselleştirmeye odaklanmasıdır. Tüm çoğalan hücreler ve birçok virüs, DNA genomlarına sahiptir veya replikasyon döngüleri sırasında DNA oluşturur, bu da hem RNA hem de DNA'yı ve proteini görüntüleyebilen yöntemleri oldukça arzu edilir hale getirir.
MICDDRP protokolünde, RNAscope yöntemini kullanarak viral nükleik asidin tespiti için bDNA FISH'imodifikasyonlar 7 ile gerçekleştiriyoruz. Bu protokoldeki en önemli değişikliklerden biri, kimyasal fiksasyonu takiben proteaz tedavisinin optimizasyonudur. Proteaz tedavisi, prob hibridizasyon verimliliğini artırmak için nükleik aside bağlı proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Proteaz tedavisini dallı oligonükleotid prob (lar) ile inkübasyon izler. bDNA problarının uygulanmasından sonra, numuneler yıkanır ve daha sonra sinyal ön amplifikatörü ve amplifikatör DNA'ları ile inkübe edilir. Çoklu gen hedeflerinin etiketlenmesi olan multipleks in situ hibridizasyon (ISH), spektral farklılaşma için farklı renk kanallarına sahip hedef problar gerektirir7. DNA amplifikatörleri ile inkübasyonu immünofloresan (IF) takip eder.
bDNA ISH, hedefe özgü sinyallerin amplifikasyonu ile sinyalden gürültüye iyileştirmeler sağlar ve spesifik olmayan hibridizasyon olaylarından kaynaklanan arka plan gürültüsüne bir azalmasağlar 7,11. Hedef problar, spesifik olmayan hibridizasyon olaylarının olasılığını tahmin eden ve prob-hedef hibrid 7,11'in erime sıcaklığını (T m) hesaplayan halka açık yazılım programları kullanılarak tasarlanmıştır. Hedef problar, hedef DNA / RNA dizisini tamamlayan 18 ila 25 bazlı bir bölge, bir ara dizi ve 14 bazlı bir kuyruk dizisi içerir. Her biri ayrı bir kuyruk dizisine sahip bir çift hedef prob, bir hedef bölgeye (~ 50 baza yayılan) melezleşir. İki kuyruk dizisi, amplifikatör probları için 20 bağlama bölgesi içeren ön amplifikatör probları için bir hibridizasyon bölgesi oluşturur ve bunlara ek olarak etiket probu için 20 bağlama bölgesi içerir. Örnek olarak, nükleik asit molekülü üzerindeki bir kilobaz (kb) bölgesi, 20 prob çifti tarafından hedeflenir ve ön amplifikatör, amplifikatör ve etiket probu ile sıralı hibridizasyon için moleküler bir iskele oluşturur. Bu nedenle, nükleik asit molekülü başına 8000 floresan etiketin teorik verimine yol açabilir, bu da tek moleküllerin tespitini ve geleneksel FISH yaklaşımları7'ye göre büyük gelişmeler sağlar (bDNA sinyal amplifikasyonunun şeması için Şekil 1A'ya bakınız). Çoklanmış ISH için problar kurmak üzere her hedef probun farklı bir renk kanalında (C1, C2 veya C3) olması gerekir. Farklı renk kanallarına sahip bu hedef problar, farklı 14 tabanlı kuyruk dizilerine sahiptir. Bu kuyruk dizileri, farklı floresan problarla farklı sinyal amplifikatörlerini bağlayacak ve böylece birden fazla hedef arasında kolay spektral farklılaşmayı mümkün kılacaktır. Sunulan Protokolde, Adım 9'daki Tablo 4, hedef probların floresan olarak etiketlenmesi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ek olarak, Şekil 2 ve Şekil 3, HIV-1 ve HTLV-1 enfeksiyonlarını takiben çoklu viral nükleik asit hedeflerinin spesifik floresan etiketlemesini elde etmek için uygun Amplifikatör 4-FL (A, B veya C) (floresan probu ve son hibridizasyon adımı) 'nı nasıl seçtiğimize dair örnekler sunmaktadır.
RNA, DNA ve proteinlerin eşzamanlı floresan görselleştirmesinin çeşitli uygulamalarını gösterdik ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlük 3,4,5 ile virüs replikasyonunun kritik aşamalarını gözlemledik. Örneğin, viral RNA, sitoplazmik ve nükleer DNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesi, nükleer girişten önce sitoplazmada RNA içeren çekirdekleri takip etmek ve proviral DNA3'ün entegrasyonu da dahil olmak üzere HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki önemli olayları görselleştirmemize izin vermiştir. Ayrıca konakçı faktörlerin ve ilaç tedavisinin viral enfeksiyon ve replikasyon üzerine etkilerini karakterize etmek için MICDDRP uyguladık 4,5. Ukah ve ark.'da, HIV transkripsiyonunu ve gecikme tersine çevirmesini görselleştirmek için farklı gecikme tersine çevirici ajanlarla tedavi edilen gecikmeli hücre modellerinde HIV-1 transkripsiyonunun reaktivasyonunu izledik4. Ek olarak, MICDDRP, küçük molekül tedavisine veya konakçı faktörü kısıtlamasına atfedilen antiviral inhibisyonla ilişkili fenotipik değişiklikleri görselleştirmemize izin verebilir. Yaklaşımımızın sağlamlığına ve geniş uygulanabilirliğine kavramın bir kanıtı olarak, sadece insan immün yetmezlik virüsünde (HIV)-1'de değil, aynı zamanda insan T-lenfotropik virüsünde (HTLV)-1, hepatit B virüsünde (HBV), hepatit C virüsünde (HCV) enfeksiyonu takip etmek için viral nükleik asidi etkili bir şekilde etiketlemek için protokolümüzün modifikasyonlarını kullanabileceğimizi gösterdik. Zika virüsü (ZIKV) ve influenza A virüsü (IAV). HIV-1 yaşam döngüsü hem viral DNA hem de RNA türlerinden oluştuğundan, HIV-1 replikasyon kinetiğini takiben MICDDRP optimizasyonumuzun çoğunu gerçekleştirdik. Bununla birlikte, ek olarak, viral transkripsiyon ve replikasyonu izlemek için ZIKV, IAV, HBV ve HCV gibi virüslerde her iki duyu (+) ve antisens (-) sarmallılığın farklı viral RNA transkriptlerinin sentezini izleyebileceğimizi gösterdik 3,4,5,6. Çalışmalar, çeşitli viral süreçlerin mekanik anlayışını geliştirmeyi ve bu floresan görüntüleme teknolojisini çok çeşitli hücresel modellere uygulamak için bir kılavuz görevi görmeyi amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>DNA hibridizasyon tamponu için</td><td></td><td></td>% 4 PFA<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>% 50 dekstran sülfat Amreso 198 <tr><td>50X yıkama tamponu</td><td>ACD Bio</td><td>320058</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör 1-FL</td><td>ACD Biyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör 2-FL</td><td>ACD Biyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör 3-FL</td><td>ACD </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyo Amplifikatör 4-FL</td><td>ACD Bio</td><td></td><td>Danışın Protokolde Amp-4 tablosu</td></tr><tr><td>Anti-HCV NS5a antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab13833</td><td>Fare monoklonal; HCV genotipleri 1a, 1b, 3 ve 4 ile çalışır</td></tr><tr><td>Anti-HIV-1 p24 monoklonal antikoru</td><td>NIH AIDS Reaktif Programı</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mov10 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab80613</td><td>Tavşan poliklonal</td></tr><tr><td>Anti-PB1 antikoru</td><td>GeneTex</td><td>GTX125923</td><td>Grip proteinine karşı antikor</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td></td><td></td><td>İmmün boyama için bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>Takviyeli</td><td></td><td></td> hücre ortamı <td>Hücre modeline uygun ortam</td></tr><tr><td>Lameller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ACD Bio</td><td></td><td>Nükleer boyama (ACD Bio'dan RNAscope kiti)</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (1X PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Kalsiyum ve magnezyum içermez</td></tr><tr><td>Etilen karbonat</td><td>Sigma</td><td>E26258</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)Hangi</td><td></td><td></td> <td>serum ikincil antikorunun yükseltildiğine bağlı olarak spesifik FBS kullanın (ör. keçi FBS)</td></tr><tr><td>Fisherbrand colorfrost plus mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-17/18/19</td><td>Önceden temizlenmiş</td></tr><tr><td>HCV-GT2a-sense-C2 probu</td><td>ACD Bio</td><td>441371</td><td>HCV (+) sense RNA probu</td></tr><tr><td>HIV-gagpol-C1</td><td>ACD Bio</td><td>317701</td><td>HIV-1 cDNA probu</td></tr><tr><td>HIV-nongagpol-C3</td><td>ACD Bio</td><td>317711-C</td><td>HIV-1 RNA probu</td></tr><tr><td>HybEZ hibridizasyon fırını</td><td>ACD Bio</td><td>321710/321720</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge hidrofobik bariyer kalemi</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Oje</td><td></td><td></td><td>Proteaz tedavisinden önce lamel kaymak için immobolize etmek için</td></tr><tr><td>Nukleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poli-d-lizin (PDL)</td><td></td><td></td> <td>20 & mikro'da kaplama lamelleri; 30 dakika boyunca g/mL PDL</td></tr><tr><td>Prob seyreltici</td><td>ACD Bio</td><td>300041</td><td>RNA C2 veya C3 problarını seyreltmek için</td></tr><tr><td>Altın antifadesi</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz III</td><td>ACD</td><td>Bio 322337</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope&reg; &nbsp; Prob- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td><td>ACD Bio</td><td>436221</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İkincil antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA hibridizasyon tamponu için</td><td>sodyum klorür</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat, pH 6.2</td><td></td><td></td><td>DNA hibridizasyon tamponu</td></tr><tr><td>Tween-20</td> <td>için</td><td></td><td>DNA hibridizasyon tamponu ve PBS-T</td></tr><tr><td>V-HBV-GTD</td> için <td>ACD</td><td>Bio 441351</td><td>Toplam HBV RNA</td></tr><tr><td>V-HBV-GTD-01-C2</td><td>ACD Bio</td><td>465531-C2</td><td>HBV pgRNA probu</td></tr><tr><td>V-HCV-GT2a probu</td><td>ACD Bio</td><td>441361</td><td>HCV(-) duyu RNA probu</td></tr><tr><td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td><td>ACD Bio</td><td>495071-C3</td><td>HTLV-1 (-) sense RNA probu hedefleme HBZ</td></tr><tr><td>V-HTLV1-GAG-C2</td><td>ACD Bio</td><td>495051-C2</td><td>HTLV-1 DNA probu</td></tr><tr><td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td><td>ACD Bio</td><td>495061</td><td>HTLV-1 (+) anlamlı RNA probu</td></tr><tr><td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td><td>ACD Bio</td><td>436221</td><td>IAV RNA probu</td></tr><tr><td>V-ZIKA-pp-O2</td><td>ACD Bio</td><td>464531</td><td>Zika (+) duyu RNA probu</td></tr><tr><td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td><td>ACD Bio</td><td>478731-C2</td><td>Zika (-) duyu RNA sonda</td></tr></tbody></table>

viral nükleik asitleri ve proteinleri görselleştirmek ve hiv, htlv, hbv, hcv, zika virüsü ve İnfluenza enfeksiyonunu İzlemek için tek hücreli Çoklanmış floresan görüntüleme

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Virüslerin dinamik replikasyon ve montaj süreçlerini yakalamak, viral nükleik asit ve proteinin hassas ve eşzamanlı olarak etiketlenmesini sağlayan sağlam in situ hibridizasyon (ISH) teknolojilerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Konvansiyonel DNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri genellikle immün boyama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesini sağlayan MICDDRP (MULTIPLEX IMMUNOFLUORESCENT CELL-BASED D ETECTION OF DNA, RNA ve protein) adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. Geleneksel DNA FISH'lerle karşılaştırıldığında, micddrp, oligonükleotid probu duyarlılığını ve tespitini önemli ölçüde artıran dallanmış DNA (bDNA) ISH teknolojisini kullanır. MICDDRP'nin küçük modifikasyonları, viral proteinlerin farklı sarmallara sahip nükleik asitlerle (RNA veya DNA) eşzamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu protokolleri, insan immün yetmezlik virüsü (HIV)-1, insan T-lenfotropik virüsü (HTLV)-1, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV), Zika virüsü (ZKV) ve influenza A virüsü (IAV) dahil olmak üzere çoklu viral patojenlerin yaşam döngülerini incelemek için uyguladık. Viral nükleik asitleri ve proteinleri çeşitli virüslerde etkili bir şekilde etiketleyebileceğimizi gösterdik. Bu çalışmalar bize çoklu viral sistemlerin gelişmiş mekanik anlayışını sağlayabilir ve ek olarak, DNA, RNA ve proteinin çok katlı floresan görüntülemesinin geniş bir hücresel sistem spektrumunda uygulanması için bir şablon görevi görebilir.

MICDDRP'nin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. DNA ve RNA'nın etiketlenmesini immün boyama izler. Dallanma yükselteçlerinin kullanımı sinyali arttırır ve tek nükleik asit moleküllerinin tespit edilmesini sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Şekil 1: MICDDRP şeması ve adım adım iş akışı. (A) bDNA sinyali, viral DNA (1) ve RNA türlerinin (2) tespi...

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

DNA, RNA ve proteinin multipleks immünofloresan hücre tabanlı tespiti yaklaşımımız, tek hücreler içindeki farklı tip ve sarmallı proteinleri ve nükleik asitleri aynı anda görselleştirmemizi sağlar. Tohumlamadan önce, örtü fişlerini etanol içinde beş dakika inkübe edin, ardından PBS'de iki dakikalık iki yıkama yapın. İkinci yıkamadan sonra, kapak astarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca mililitre başına 20 mikrogram poli-D-lizin içine tamamen batırın.İnkübasyonun sonunda, fazla matris çözeltisini PBS'de iki yıkama ile çıkarın ve ilgilenilen hücreleri, örtü kayma konsantrasyonu başına 50 mikrolitre PBS başına 1 x 10'da altıncı hücrelere seyreltin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her bir poli-D-lizin kaplı örtü astarı üzerine ilgilenilen hücrelerin 50 mikrolitresini tohumlayın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitlemeden önce PBS'de üç kez yıkayın.İnkübasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de 500 mikrolitre% 0.1 Tween 20 ile geçirgen hale getirmeden önce hücreleri PBS'de iki kez yıkayın. İnkübasyonun sonunda, her bir kapak fişini yıkama başına 500 mikrolitre taze PBS ile iki kez yıkayın. Kapak fişini bir cam slayt üzerine hareketsiz hale getirmek için, sterilize edilmiş bir cam slayt üzerine küçük bir damla şeffaf oje yerleştirin ve kapak fişinin hücresiz tarafının bir kenarını oje damlasının üzerine yerleştirin ve kapak fişini yukarı bakacak şekilde sürgülü hücre tarafına indirin.Hücrelerin dehidre olmasını önlemek için hareketsiz hale getirilmiş kapak fişine birkaç damla PBS ekleyin ve kapak fişinin dışına bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Bariyer çekildiğinde, PBS'yi 100 mikrolitre proteaz III ile değiştirin ve slaytı 15 dakika boyunca 40 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, slaytları taze PBS'de iki kez, her yıkamada iki dakika boyunca sallanarak yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, ilgilenilen probu 200 mikrolitre hibridizasyon tamponunda 67 santigrat derecede 10 dakika seyreltin. İnkübasyonun sonunda, her bir kapak kızağına 50 mikrolitre prob çözeltisi ekleyin ve slaytları iki saat boyunca nemlendirilmiş 40 derece fırına yerleştirin. Kuluçka işleminin sonunda, slaytları taze yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve yıkama başına iki dakika sallayın.İkinci yıkamadan sonra, fazla tamponu çıkarmak için slaytlara dokunun ve kapak fişlerine 1, 2 ve 3 numaralı floresan kanalları için bir damla amplifikatör ile 30 dakikalık, 40 santigrat derece inkübasyon için 30 dakikalık, 40 santigrat derece inkübasyon ile işlem yapın ve yeni yıkama tamponunda iki iki dakikalık yıkama ile tedaviler arasında yıkama başına sallanma. Son yıkamadan sonra, 4 derecelik fırında 15 dakikalık bir inkübasyon için kapak kızağına bir damla floresan kanal 40 amplifikatör ekleyin ve slaytı gösterildiği gibi iki kez yıkama tamponu ile ve bir kez PBS ile yıkayın. İlgilenilen proteinlerin immün boyaması için, son yıkamadan sonra, her bir örtü astarını oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyon için 200 mikrolitre bloke edici tampon ile muamele edin.İnkübasyonun sonunda, bloke edici tamponu boşaltın ve PBS artı Tween 20'de seyreltilmiş 200 mikrolitre ilgilenilen antikoru ekleyin,% 1 sığır serum albümini ile desteklenmiştir. Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir ikincil antikorla etiketlemeden önce, slaytları taze PBS artı Tween 20'de 10 dakikalık iki yıkama ile yıkama başına çalkalayarak yıkayın. Kuluçka süresinin sonunda, slaytları taze PBS artı Tween 20 ile yıkama başına çalkalanarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, çekirdekleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca uygun bir nükleer boya ile karşı boyayın, ardından PBS'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çalkalayarak iki yıkama yapın. Numuneleri görüntüleme için monte etmek için, numune başına bir yeni steril cam slayt üzerine bir damla antifade solüsyonu yerleştirin ve solüsyonu yaklaşık olarak kapak fişlerinin büyüklüğünde bir alanı kaplayacak şekilde yayın. Kapak fişlerini kızaklarından ayırın ve lamel fişleri PBS'ye batırın.Kalan ojeyi çıkarmak için forseps kullanın ve kapak fişinin arkasını bir laboratuvar mendiliyle kurulayın. Ardından, her bir kapak kayma numunesini aşağı bakacak şekilde antifade solüsyonunun üzerine nazikçe yerleştirin ve numunelerin gece boyunca kurumasını bekleyin. Bu prosedürün konseptinin bir kanıtı olarak, HIV-1 DNA, RNA ve protein aynı anda etiketlendi ve tek hücre düzeyinde mikroskobik olarak görselleştirildi.Bu örnekte, iki HIV-1, DNA genomu, viral RNA'yı aktif olarak kopyalarken tek bir hücre içinde görselleştirilebilir. Viral RNA, nükleer gözenek kompleksi yoluyla dışa aktarıldı ve viral protein sitoplazmada sentezlendi. Gözlemlendiği gibi, prob çapraz reaktivitesi potansiyeline sahip iki retrovirüs ile etiketlenmesine rağmen, iki virüs boyunca prob setleri arasında çok az çapraz reaktivite gözlenir veya hiç gözlenmez.Ek olarak, numune hazırlama sırasında hücreler RNaz ile muamele edilirse viral RNA boyaması ortadan kaldırılabilir. Her görüntüdeki hücre başına antikor sinyalinin ortalama entegre floresan yoğunluğu daha sonra ölçülebilir. Gözlendiği gibi, HBV pre-genomik RNA ve toplam HBV RNA miktarı, HBV enfeksiyonu boyunca artar.HCV enfeksiyonu görüntülemesi, ilgilenilen floroforları tespit etmek için 60X yağa daldırma objektifi kullanılarak konfokal mikroskopi yoluyla da gerçekleştirilebilir. Bu son derece spesifik yaklaşım, aynı zamanda yüksek uzaysal zamansal çözünürlüğe sahip viral veya hücresel süreçlerin izlenmesine de izin verir. Ek olarak, bu teknik birden fazla virüs ve diğer patojenleri incelemek için kullanılabilir.

single-cell-multiplexed-fluorescence-imaging-to-visualize-viral

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Burada, nanoakışkan bir cihazda akut olaylar ve üretken HIV-1 enfeksiyonu için tek hücrelerin izlendiği bir protokol sunuyoruz. Görüntüleme verileri virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlar. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntülemenin sinyal kinetik ve moleküler etkileşimleri incelemek için ilk yöntemidir.

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu

Burada, anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye bağlı manyetik mikroküreler tarafından yakalanan sağlam şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) viral partikülleri üzerinde iki benzersiz spike protein epitopunu aynı anda tespit etmek için çift raportörlü bir akış sitometrik sistemi kullanan yeni geliştirilmiş bir multipleks floresan immünolojik testi açıklıyoruz.

Viral Partiküller Üzerindeki Yüzey Protein Epitoplarının Multipleks Çift Raportör Stratejisi ile Profillenmesi

Öğrenin, tek hücreli çoklanmış immünofloresan görüntüleme ile HIV, HBV ve HCV gibi virüslerin DNA, RNA ve proteinlerini eş zamanlı görselleştirin. Bu yöntem, viral enfeksiyon dinamiklerini yüksek çözünürlükle izlemenizi sağlar.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Daha fazla video keşfet