Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Bu yöntem, geliştirilmekte olan SARS-coronavirus-2 aşıları ile ilgili daha önemli sorulardan birini yanıtlamanın bir yolunu sağlar. Aşı nötralize edici bir antikor tepkisi ortaya çıkarabiliyor mu? Bu tekniğin temel avantajı, ikinci seviye bir muhafaza tesisinde yapılabilmesidir.

Ayrıca nispeten hızlı ve ucuzdur, bu da aynı anda birçok numuneyi analiz etmek için uygun hale getirir. Nötralize edici asit prosedürünü gösteren, laboratuvarda kıdemli bir teknisyen olan Ricardo Marius ve doktora öğrencisi Taylor Jamieson var. DMEM'deki Vero E6 hücrelerini 37 santigrat derecede %10 FBS ve %5 karbondioksit ile destekleyerek başlayın.

Hücreleri geçirmek için, önce 10 mililitre PBS ekleyerek ve kabı dört ila beş kez hafifçe sallayarak yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, üç mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce tüm yüzeyin kaplı olduğundan emin olmak için yemeği sallayın. Hücreler ayrıldıktan sonra, %10 FBS ile desteklenmiş yedi mililitre DMEM ekleyerek trypsin'i devre dışı bırakın, ardından birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri yeniden dürt.

Tripini santrifüjleme ile çıkarın ve hücreleri 10 mililitre taze DMEM'de canlandırmadan önce hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin. Saydıktan sonra, her 15 santimetrelik plakaya yaklaşık bir kez 10 yedinci hücre ekleyin ve hücreler% 100 bir birikmeye kadar kültürü bir ila iki gün kuluçkaya yatırın. VSV spike EGFP psödovirüsü titerleme için hazırlamak için, serumsuz DMEM'in 12 mililitresinde seyreltilmiş stok virüsü ile enfeksiyonun 0.01 çokluğunda hücreleri enfekte edin.

Virüsü ekledikten sonra, hücreleri 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın ve ara sıra sallanan% 5 karbondioksit. Kuluçkanın sonunda, inokülüsünü% 2 FBS ve 20 milimolar yığınlarla desteklenmiş taze DMEM ile değiştirin, ardından hücreleri 34 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, enfekte hücrelerin EGFP ifadesini görselleştirmek için floresan bir mikroskop kullanın.

Kapsamlı bir sitopatik etki ve hücre müfrezesi gözlendikten sonra, kültür üstnatantını toplayın ve santrifüjleme ile enkazı kaldırın. Birden fazla donma-çözülme döngüsünü önlemek için, eksi 80 santigrat derecede depolamadan önce süpernatant aliquot. Viral titreyi belirlemek için, Vero E6 hücrelerini altı kuyu plakasında, kuyu başına altı çarpı 10 ila beşinci hücrelere kadar tohumlama yoğunluğunda plakalayın ve bir gecede kuluçkaya yatırın.

Ertesi gün, 900 mikrolitre orta ila yedi mikro santrifüj tüpü ekleyerek ve ilk tüpe 100 mikrolitre viral stok ekleyerek viral stokun on kat seri seyreltme serisini kurun. Kısa bir girdaplamadan sonra, her tüp arasında girdaplama yaparak, sonraki her tüpe 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs aktarın. Daha sonra Vero E6 kültür plakasının her kuyusundaki süpernatantı 10 ila eksi saniyenin 500 mikrolitresi ile eksi yedinci viral seyreltmelere değiştirin.

Hücre kültürü inkübatörde her 15 dakikada bir hafifçe sallanan 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, inokülüsleri bir kaplama çözeltisi ile değiştirin ve hücreleri 34 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 48 saat boyunca kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, plakları kristal mor boyama ile görselleştirmek için, her kuyuya iki mililitre% 0.1 kristal mor eklemeden önce hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Pbs ile her kuyuyu iki kez hafifçe yıkamadan önce tabağı oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika bir rocker üzerine yerleştirin.

Son yıkamadan sonra, mililitre başına plak şekillendirme ünitelerinde her kuyuda virüsün titresini hesaplamak için belirtilen formülü kullanmadan önce plakaların en az bir saat kurumasına izin verin. Nötralizasyon tahlilleri için hücreleri plakalamak için, mililitre başına beşinci hücrelere iki kez 10 yoğunlukta 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre Vero E6 hücresi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün ısı, 56 santigrat derecelik su banyosunda test edilecek hasta serum örneklerini 30 dakika boyunca devre dışı bıraktı.

Daha sonra her kuyuda antibiyotik içeren 72 mikrolitre serumsuz DMEM'e serumun sekiz mikrolitresini ekleyerek hastanın serum örneklerinin on katını boş bir 96 kuyu doku kültürü plakasına kurun A.Sıra A.'nın ardından B'den G'ye kadar her bir satır kuyusuna 40 mikrolitre serumsuz DMEM ve H sırasının her kuyusuna 80 mikrolitre ekleyin.12 kuyu çok kanallı pipet kullanarak, örnekleri A satırında karıştırın, sonra A satırının her kuyusundan B satırının her kuyusuna numunenin 40 mikrolitresini aktarın.Karıştırdıktan sonra, sonraki her kuyu satırı için seyreltmeyi F.Next satırına kadar tekrarlayın, A'dan G'ye kadar her kuyuya 0.05 çok miktarda enfeksiyonda 40 mikrolitre VSV spike EGFP ekleyin, ve plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat kuluçkaya yatırmadan önce dört ila beş kez pipetleme ile karıştırın. Kuluçkanın sonunda, vero E6 kültür plakasının her kuyusundan süpernatantı dikkatlice emiş edin ve örnek seyreltme plakasının her kuyusundan hücre kültür plakasının ilgili kuyusuna 60 mikrolitre antikor virüsü karışımı aktarın. Tüm örnekler aktarıldığında, hücre kültürü plakasını 37 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite her 20 dakikada bir sallayarak bir saat yerleştirin.

Kuluçka tamamlandıktan sonra, hücre kültürü plakasının her kuyusuna 140 mikrolitre karboksimetilselüloz kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı 34 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın. 24 saat sonra, plakaları 488 nanometre dalga boyunda otomatik bir floresan görüntüleyici üzerinde görüntüleyin ve tek tek EGFP odaklarını ölçmek için görüntüleyicinin otomatik sayma özelliğini kullanın. Bu temsili örnekte, SARS-coronavirus-2 spike reseptör bağlama etki alanına karşı piyasada bulunan nötralize edici bir antikor, igG'nin yanı sıra negatif kontrol olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılmıştır.

Yüzde inhibisyon, floresan görüntüleme ile tespit edilen EGFP odaklarının sayısına göre hesaplandı. SARS-koronavirüs-2 enfeksiyonu sonrası yaklaşık üç ay sonra toplanan iyileşen hasta örnekleri ile psödovirüs nötralizasyonu, hastanede yatan hastaların hastaneye yatmayı gerektirmeyenlere kıyasla nötralizasyon kapasitesinin arttığını göstermiştir. Bu prosedür, viral enfeksiyonu engellemeyi amaçlayan diğer COVID-19 önleme ve terapötik ajanları değerlendirmek için de kullanılabilir.