Name: Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Keşfedin floresan korelasyon spektroskopisi ile protein toplanmasını tespit etme yöntemini. ALS ile ilişkili TDP25 ve mutant SOD1 proteinlerinin difüzyon özelliklerini hücre lizatlarında ve canlı hücrelerde analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.K., Japonya Bilim Geliştirme Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (C) (#18K06201), Nakatani Yeni Koronavirüs Enfeksiyonlarına Karşı Önlemler Vakfı'ndan hibe, Hokkaido Üniversitesi Gelecekteki Araştırma Liderlerini Geliştirme Ofisi 'nden (L-Station) hibe ve Hoansha Vakfı'ndan bir hibe yardımı ile desteklendi. M. K., "Multimoleküler Kalabalık Biyosistemleri için Kimya" (#20H04686) yenilikçi alanlar üzerine bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid ve "Yaşamsal konuların bilgi fiziği" (#20H05522) üzerinde Bilimsel Araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklendi.

1. Malzemeler ve reaktifler
<ol><li>Hücre kültürü için pirojenik içermeyen çözümler ve ortam kullanın (Tablo 1).</li>
	<li>Ultra saf su kullanarak biyokimyasal deney için çözümler hazırlayın ve DNase/RNase free olarak kullanın.</li>
	<li>Çok denetim işlemine sahip hücre kültürü için uygun bir FBS seçin. Seçilen FBS lotları düzenli olarak değiştiğinden, FBS için katalog ve lot numarası burada temsil edilemez.</li>
	<li>Plazmid DNA<ol>
<li>eGFP monomer ifadesi için pmeGFP-N15'i hazırlayın; GFP-TDP25 ifadesi için pmeGFP-C1-TDP256; SOD1-G85R-GFP ekspresyörü için pmeGFP-N1-SOD1-G85R7; ve taşıyıcı olarak pCAGGS8. NOT: meGFP, gelişmiş GFP'nin (eGFP) A206K mutasyonunu taşıyan monomerik bir varyanttır. TDP25, TDP-43'ün ALS ile ilişkili bir C-terminal parçası. SOD1-G85R, SOD1'in ALS ile ilişkili bir mutanttır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre zorlanması<ol>
<li>Murine nöroblastom Neuro2a hücrelerini kullanın. NOT: Nöro2a hücreleri yüksek transfeksiyon verimliliğine ve yüksek ekspres eksojen proteinlere sahiptir. TDP25 ekspresyolü için Neuro2a veya HEK293 hücreleri gibi yüksek ekspresyon verimliliğine sahip hücre suşları gereklidir. HeLa hücrelerinde TDP25 verimli bir şekilde ifade edilememektedir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hücre kültürü ve transfection
<ol><li>Normal büyüme ortamında yarı bir araya gelen Neuro2a hücrelerini yetiştiren 100 mm'lik plastik bir tabak hazırlayın. NOT: Yarı izdiah edilene kadar önceki tohumlamadan sonra yaklaşık 48-72 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatmak gerekir.</li>
	<li>Ortamı çıkarın.</li>
	<li>Hücre kültürü kabına 0,5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yemeğe 9,5 mL normal büyüme ortamı ekleyin ve ayrılmış hücreleri askıya alın.</li>
	<li>Ölü hücreleri boyamak için Trypan mavisini kullanma, hücre sayacı kullanarak veya el ile hücre sayısını sayma. Daha sonra hücreleri kültür ortamında seyreltin (1.0 × 105/mL).</li>
	<li>Hücre lizisi için 35 mm'lik plastik bir kabın içine 2 mL hücre süspansiyonu veya canlı hücre ölçümü için bir cam taban kabı ekleyin.</li>
	<li>Yemeği 1 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Transfeksiyon gününden 15 dakika önce aşağıdaki hazırlıklara başlayın.</li>
	<li>İki adet 1,5 mL tüp hazırlayın ve her tüpe 100 μL Opti-MEM I ekleyin.</li>
	<li>İlk tüpte, 1.0 μg plazmid DNA'sını (Çözelti A) karıştırın. İkinci tüpte, 2,5 μL Lipofectamin 2000 'i karıştırın (Çözüm B). NOT: Transfeksiyon verimliliğini korumak için toplam DNA miktarını aynı tutun. Canlı hücrelerde FCS ölçümü için ifade düzeyini azaltmak için, protein ekspresyörü için plazmid DNA'nın fraksiyon miktarı azalmalıdır (örneğin, 0.2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R ve 0.8 μg pCAGGS karışımı). Ayrıca, Lipofectamine 2000 hacmi ile plazmid DNA miktarı arasında aynı oranı koruyun.</li>
	<li>Çözelti A ve B'yi her iki tüpe de ekleyerek hafifçe karıştırın ve ardından oda sıcaklığında (Çözelti C) 1 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Çözüm C'yi kültür ortamına ekleyin; ve hücreleri 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>3. Hücre lizisi ve orta değişim
<ol><li>Rutin bir mikroskop kullanarak GFP ifadesini denetleyin.</li>
	<li>Tabaktaki ortamı çıkarın.</li>
	<li>Ortamı yıkamak için 25 °C'de 2 mL PBS ekleyin. PBS'yi çıkarın.</li>
	<li>Tabağı ezilmiş buzun üzerine alüminyum bir tabağa yerleştirin. NOT: Pazar alet mağazasında veya ticari olarak laboratuvar ekipmanı olarak mevcut olan 1 mm kalınlığında alüminyum plaka kullanıyoruz.</li>
	<li>4 °C'de 200 μL lizis tamponu ekleyin. Tabağı hafifçe çalkalayın, böylece tampon yemeğin altına eşit olarak dağıtılır.</li>
	<li>Bir hücre kazıyıcı kullanarak çanağı kazıyın ve 1,5 mL'lik yeni bir tüpte çözülmemiş hücre kalıntıları ile lisatı kurtarın.</li>
	<li>Çözeltiyi 20.400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatant'ı yeni bir 1,5 mL tüpte kurtarın ve 4 °C'de veya buzda tutun. NOT: Lisatı dondurmayın.</li>
	<li>Canlı hücre ölçümleri için, ölçümden önce ortamı değiştirin. Faz kontrastı mikroskobu kullanarak hücre ekini kontrol edin. Floresan mikroskop kullanarak ifadeyi onaylayın.</li>
</ol>4. Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kalibrasyonu
<ol><li>Sistemi başlatın ve işlem yazılımını çalıştırın. Argon+ lazeri açın (458/477/488/514 nm). Sistemi en az 30 dakika sabitleyin.</li>
	<li>Optik yolu ayarlama: Ana ışın ayırıcı: HFT488; Dikroik ayna: NFT600; Floresan bariyer filtresi: bir bandpass filtresi 505-540 (BP505-540); Dedektör: çığ fotodiyot (APD)).</li>
	<li>Değeri doğrudan girerek iğne deliği boyutunu ayarlayın (66 μm; 1 havadar ünite).</li>
	<li>Rhodamine 6G (Rh6G) sokumunun içine sahnedeki kapak cam haznesinin bir kuyusuna ekleyin.</li>
	<li>Hedefe daldırma ultra saf suyunu ekleyin. Daldırma yağını kullanmayın.</li>
	<li>Odayı mikroskop aşamasına getirin. Sahneyi uygun konuma getirin.</li>
	<li>Cam yüzeyinden dağınık ışığı ölçerek üst cam yüzeye odaklanın. Objektif lensi alta indirdikten sonra, ayarlamak için odak düğmesini saat yönünde çevirin. NOT: Japonya ve Almanya'da yapılanlar arasında zıt olduğundan, odak düğmesinin dönüş yönünü kontrol edin.</li>
	<li>Çözeltinin içini gözlemlemek için odak noktasını üst cam yüzeyin 200 μm üzerine kaldırın.</li>
	<li>Sayım oranına tıklayın ve foton sayım oranını izleyin.</li>
	<li>Sayma hızı değerinin 10 kHz'den fazla olması için acousto-optik ayarlanabilir filtrelerin (AOTF) değerini (örneğin, heyecan lazer iletimi) kademeli olarak artırın.</li>
	<li>Pim Deliği Ayarı'nı tıklatın ve iğne deliği ayarlama sihirbazını açın. Hem x hem de y eksenindeki en yüksek (tepe) foton sayısına sahip iğne deliği konumunu bulun.</li>
	<li>Molekül başına sayım (BGBM) değeri en yüksek olacak şekilde objektif lensin düzeltme halkasını çevirin. NOT: Burada belirtilen haznenin kapak camının kalınlığı 0,12-0,17 mm olduğundan, düzeltme halkası minimum civarındadır veya CPM'nin maksimumda olduğu yerden sadece birkaç tur uzaktadır.</li>
	<li>BGBM değerinin 2-3 kHz olması için AOTF değerini kademeli olarak azaltın.</li>
	<li>90 s için Rh6G'nin otomatik ilişki işlevini (ACF) unun.</li>
	<li>Ölçüm tamamlandıktan sonra, eğri sığdırma analizi yapmak için Sığdır'ı tıklatın.</li>
	<li>Üçüz durumuna sahip tek bileşenli üç boyutlu (3B) difüzyon için bir model seçin. NOT: Rh6G monodisperse ve üçüz bir duruma sahip tek bileşenli dağınıktır.</li>
	<li>Kırmızı çizgiyi hareket ettirerek montaj başlangıç saatini ayarlayın. Tüme Sığdır'ı tıklatın ve sığdırma sapması denetleyin. Eğri montajını gerçekleştirdikten sonra, difüzyon süresinin (DT) ve yapı parametresinin (SP) kabaca sırasıyla 20-30 μs ve 4-8 aralığında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Yapısal parametre değerini unutmayın. Aynı gün, aynı optik koşullar altında ölçülen tüm AFL'lerin eğri uydurma analizi ve mikroskop aşamasında aynı tip cam taban kabı veya odalı kapak camı seti için SP değerini kullanın.</li>
</ol>5. Hücre lisatında FCS ölçümü
<ol><li>Hücre lysates hazırlamak (yukarıya bakın).</li>
	<li>Listi kapak cam odasına yerleştirin. Kurumasını önlemek için bir kapak ve hafif gölgelendirme için sahne kapağı yerleştirin.</li>
	<li>Alım durumunu, lazer gücünü, ölçüm süresini ve tekrarları ayarlayın.</li>
	<li>Sayma hızı'nı tıklatın ve lazerin AOTF değerini CPM değerinin 1 kHz'den fazla olması için ayarlayın.</li>
	<li>1 dakika boyunca deneme ölçümü gerçekleştirin. Hesaplanan ACF'nin pozitif genlik ve pürüzsüz bir çürüme gösterip göstermediğini kontrol edin.</li>
	<li>Ana ölçümü 5 dakika boyunca gerçekleştirin. NOT: Ölçüm süresi artırılsa bile ACF'nin şekli değişmeyene kadar toplam ölçüm süresi kademeli olarak artırilir.</li>
	<li>Eğri sığdırma çözümlemesi gerçekleştirmek için Sığdır'ı tıklatın.</li>
	<li>Üçüz durumuna sahip iki bileşenli 3B difüzyon için bir model seçin. Sp değerini girmeyi ve tümünü sığdır'ı tıklatmadan önce ayarını "Boş" değil "Sabit" olarak değiştirmeyi unutmayın.</li>
	<li>Takılan tabloyu sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak dışa aktar.</li>
	<li>Gerekirse, ACF ve Count rate kaydını sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak verin.</li>
</ol>6. Canlı hücrelerde FCS ölçümü
<ol><li>Ölçümden önce ortamı yenisiyle değiştirin.</li>
	<li>Isı aşaması inkübatörü kullanın. Mikroskop sahnesinde hücre kültürü çanasını ayarlayın.</li>
	<li>Konfokal mikrop kullanarak odağı ve konumu onaylayın. Ölçüm hücresini seçin. Yakınlaştırın ve hücre konumunu ayarlayın. Yavaş tarama hızı modunu kullanarak GFP ifade eden bir hücrenin floresan görüntülerini alın.</li>
	<li>"FCS" bölümündeki Konum'u kullanarak bir FCS ölçüm pozisyonu seçin.</li>
	<li>Bir çapraz çizgi kullanarak en az bir FCS ölçüm noktası seçin (Şekil 1).</li>
	<li>ACF'ye 1 dakika ölçün. NOT: Floresan proteinler çözeltiye göre yavaş hareket nedeniyle canlı hücrelerde fotobleachlanma eğiliminde olduğundan, ölçüm süresi minimum olmalıdır. Hücrede çözelti ölçümleri kadar sorunsuz bir şekilde ACF elde etmek genellikle zordur, çünkü uzun süreli ölçüm floresan proteinlerin fotobleachingine yol açacaktır.</li>
	<li>Üçüz durumdaki iki bileşenli 3B difüzyon için bir model kullanarak eğri sığdırma analizi gerçekleştirmek için Sığdır'ı tıklatın. NOT: Canlı hücre ölçümleri için, üçüz durumdaki iki bileşenli 3D difüzyon için bir model daha iyi olacaktır, çünkü canlı hücrede çeşitli mobil bileşenlerin varlığı nedeniyle tek bileşenli bir 3D difüzyon modeliyle ki-kare değerini azaltmak ampirik olarak zordur. Ancak, üç bileşenli 3D difüzyon için bir model kullanılsa bile, difüzyon bileşenleri genellikle modeli iki bileşenli için kullanmaya kıyasla ayrılmaz.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
<li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li>
<li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230(2016).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li>
<li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Bu yazarların çıkar çatışması yoktur.

Ölçümlerden önce sistem kalibrasyonu ile ilgili olarak, numuneyi ölçmek için kullanılanla aynı cam eşyalar kullanılmalıdır (örneğin, hücre lisat için 8 kuyulu kapak cam odası ve canlı hücreler için 35 mm cam taban kabı). Camdaki Rh6G adsorpsiyonu nedeniyle, etkili konsantrasyonu bazen azalabilir. Öyleyse, sadece iğne deliği ayarı için 1 μM gibi yüksek konsantre bir Rh6G çözeltisi kullanılmalıdır. Dedektörü korumak için son derece yüksek foton sayısı oranlarından kaçınılmalıdır (örneğin, 1000 kHz'den fazla). Ayrıca, konsa...

Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı gibi nörodejeneratif bozuklukları içeren proteintoplamalarının toksik olduğu ve hücre ve organlarda protein homeostazını (proteostaz) rahatsız edeceği bilinmektedir, bu da yaşlanmaya yol açabilir2. Protein toplamanın temizlenmesi terapötik bir strateji olarak beklenmiştir; bununla birlikte, protein toplama oluşumunu engelleyen ve protein agregalarını bozan kimyasallar (örneğin, küçük moleküller veya ilaçlar) henüz tespit edilmiştir. Ayrıca, protein toplamanın toksisiteyi nasıl uyguladığı zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, protein toplama ile ilgili araştırma projelerini teşvik etmek için, protein toplamayı basitçe tespit etmek için yüksek verim prosedürlerinin getirilmesi önemlidir. Protein toplama ve toplama spesifik floresan boyanın konformasyonunu tanıyan antikorlar kullanılarak protein toplama tespiti yaygın olarak kullanılmıştır3. Bununla birlikte, özellikle bu tür klasik prosedürleri kullanarak canlı hücrelerde toplamayı tespit etmek zordur. 
Förster rezonans enerji transferi (FRET), protein toplama ve yapısal değişimi tespit etmek için yapılan bir prosedürdür. Bununla birlikte, FRET protein dinamiklerini analiz edemez (örneğin, canlı hücrelerde proteinin difüzyonu ve oligomerizasyonu)3. Bu nedenle, burada, tek molekül hassasiyetine sahip floresan moleküllerin difüzyon özelliğini ve parlaklığını ölçen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanarak çözeltideki (örneğin hücre lisat) ve canlı hücreleri tespit etmek için basit bir protokol sunuyoruz4. FCS, lazer tarama konfokal mikroskobu (LSM) kullanılarak yapılan foton sayma yöntemidir. Son derece hassas bir foton dedektörü ve foton varış süresinin otomatik ilişki işlevinin (ACF) hesaplanması kullanılarak, algılama hacmindeki floresan moleküllerin zaman ve parlaklığından geçiş ölçülür. Difüzyon moleküler ağırlığın artmasıyla yavaşlar; bu nedenle, intermoleküler etkileşim FCS kullanılarak tahmin edilebilir. Daha da güçlü bir şekilde, floresan molekülün parlaklığındaki artış moleküllerin homo-oligomerizasyonunu gösterir. Bu nedenle, FCS bu tür protein toplamayı tespit etmek için güçlü bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 (a / h) Tripsin-1 mmol / L EDTA ve orta nokta; Fenol Kırmızısı İçeren 4Na Çözeltisi (Tripsin-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>100 mm plastik tabaklar</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam taban kabı</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Canlı hücre ölçümü için</td></tr><tr><td>35 mm plastik tabaklar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum levha</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Objektif</td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz asetat filtre membranı (0,22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Kapak cam haznesi 8 kuyulu</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Çözelti ölçümü için</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>bazal besiyeri</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>biosera</td><td></td><td>Lot kontrolü gerekli</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>FCS sistemi</td></tr><tr><td>Murin nöroblastom Neuro2a hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>Transfeksiyon taşıyıcısı için Plazmid DNA</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (&times; 100</td>) <td>Fujifilm Wako Saf Kimya A.Ş.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>Monomerik eGFP ile etiketlenmiş TDP25 için Plazmid</td></tr><tr><td>DNA'sı pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>eGFP monomer ekspresyonu için Plazmid DNA</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>ALS'ye bağlı G85R mutantı için Plazmid DNA'sı SOD1'in monomerik eGFP</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr> ile etiketlenmiştir</tbody></table>

floresan korelasyon spektroskopisi kullanılarak protein toplamanın tespiti

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein toplama, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) vb. Çözünür veya yaygın protein oligomerlerini veya agregalarını tespit etmek ve analiz etmek için, tek bir molekül hassasiyetine sahip tek bir parçacığın difüzyon hızını ve parlaklığını tespit debilen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılmıştır. Bununla birlikte, protein toplama tespiti için uygun prosedür ve know-how yaygın olarak paylaşılamamıştır. Burada, hücre lysate ve canlı hücrelerde toplama eğilimli proteinlerin difüzyon özellikleri için fcs ölçümünün standart bir prosedürünü gösteriyoruz: TAR DNA/ RNA bağlayıcı protein 43 kDa (TDP25) ve süperoksit dismutaz 1'in (SOD1) ALS ilişkili 25 kDa karboksil terminal parçası. Temsili sonuçlar, yeşil floresan protein (GFP) etiketli TDP25 agregalarının bir kısmının murine nöroblastom Neuro2a hücre lisatının çözünür kısmına biraz dahil edildiğini göstermektedir. Ayrıca, ALS ile ilişkili mutasyon taşıyan GFP etiketli SOD1 canlı hücrelerde daha yavaş bir difüzyon göstermektedir. Buna göre, burada FCS kullanarak difüzyon özelliği aracılığıyla protein toplamayı tespit etmek için prosedürü tanıtıyoruz.

Canlı hücrelerde hücre lisat ve SOD1-G85R-GFP'de GFP-TDP25 FCS ölçümü yaptık. Her iki durumda da pozitif genlik ve pürüzsüz ACL'ler elde edilebildi. Neuro2a hücrelerinde ifade edilen GFP-TDP25'in bir kısmının çözünür fraksiyonda belirtilen durum altında kurtarıldığini gösterdik6. Hücre lisatının çözünür fraksiyonunda, FCS(Şekil 2A, üst, ok) kullanılarak foton sayım oranı kaydında son derece parlak floresan molekülleri tespit edildi. Bu tür "sivri uçlar (patlama olarak...

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Floresan korelasyon spektroskopisinin en iyi prensibi olan FCS, başlangıçta 1970'lerde icat edildi. 1990'larda konfokal aparat mikroskopisi ile birleştirilerek FCS için önemli ve birçok iyileştirme kurulmuştur. O zamandan beri FCS, moleküler etkileşimler ve protein toplama analizi gibi birçok kimyasal ve virüs kür uygulaması için kullanılmıştır.Protein toplama nörodejeneratif bozuklukların ayırt edici bir özelliğidir. Floresan parlaklığı, difüzyon özellikleri ile açıklanan moleküler boyutlarda hareket eden tek parçacıklardır. Protein toplamalarının ölçülmesinde çok önemlidir, çünkü moleküllerin öngörülen yaşam döngülerini belirleyebilir, aynı zamanda homo veya hetero polimerizasyonunu ayırt edebilir.Burada, hücre lysates ve canlı hücrelerde FCS kullanarak agrega formu proteini ile ilişkili amyotrofik lateral sklerozun difüzyonunu ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Normal büyüme ortamında rahatça oturarak 100 milimetre plastik tabak büyüyen Neuro2a hücresi hazırlayın. Hücre konfluensi onaylayın.Ortamı çıkarın. Üçüncü kartuş kabına 3,5 mililitre Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Yemeğe 9,5 mililitre normal büyüme ortamı ekleyin ve askıya alın.Hücre süspansiyonu, ölü hücreleri lekelamak için trippan mavisi ile karıştırılır. Hücre sayma slaydına askıya alma ekleyin. Hücre sayacı veya el ile kullanarak hücre sayısını sayın.Canlı cep telefonu numarasını ve canlılıklarını kontrol edin. Sayılan ortamdaki hücreyi mililitre başına 5 gücünde 1.0 kez 10'da seyreltin. Canlı hücre ölçümü için hücre lizisi veya büyüme alanı çanağı için 35 milimetrelik plastik kabın içine iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Yemeği bir gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün plazmid DNA ve transfeksiyon reaktiflerinin karışımını hazırlayın. Transfeksiyon karışımını hücre sayılan ortama ekleyin ve hücreleri 24 saat kuluçkaya yatırın.Bir gün sonra. Rutin bir mikroskop kullanarak GFP ifadesini denetleyin. Hücrelerdeki çok parlak TDP25 bileşen gövdelerini görebilirsiniz.Hücre lizisi biyokimyasal tezgahta yapılmalıdır. Tabaktaki ortamı çıkarın. Orta olarak yıkamak için 25 santigrat derecede iki mililitre PBS ekleyin.PBS'yi çıkarın. Kabı ezilmiş buzun üstündeki alüminyum bir tabağa yerleştirin. Hemen, 200 mikroliter liziz tamponunu kabın içine ekleyin.Bir hücre kazıyıcı kullanarak yemeği kazıyın. 1,5 milimetrelik yeni bir tüpte çözülmemiş hücre kalıntılarıyla lisatı kurtarın. Lysate'i dört santigrat derecede santrifüjle.Canlı hücre ölçümleri için, ölçümden önce ortamı yenisiyle değiştirin. Faz kontrastı mikroskobu kullanarak hücre ekini kontrol edin. Ayrıca, floresan mikroskobu kullanarak GFP ifadesini kontrol edin.Konfokal mikroskop kombine FCS sistemi kullanın. 488 nanometre lazeri açın. Sistemi en az 30 dakika sabitleyin.Optik yolu kurun. Anlık ışık için 488 nanometre lazer kullanın. Uygun bir ışın ayırıcı ve dikroik sayaç kullanın.Ve ayrıca, floresan sigortaları. Genellikle, kalibrasyon ve çözelti ölçümleri için kapak odalarını kullanacağız. Dikkatlice, kapak odasını alın.Cam yüzeyi lens tarama kağıdına yerleştirin. FCS kalibrasyonunu dökün. Rhodamine 6G çözümünü de ekleyin.Hedefe ultra saf suyu ekleyin. Yağı kullanmayın. Odayı mikroskop aşamasına getirin.Sahneyi uygun konuma getirin. İğne deliği ayarını oluşturun ve iğne deliği ayarlama sihirbazını açın. Foton sayım hızını x yönü için iğne deliğinin kaba hareketi olarak izleyin.En parlak pozisyon haklı olarak belirlendi. Ardından, foton sayım oranını ince hareket olarak izleyin. En parlak konum başarıyla belirlendi Bu x yönü için iğne deliği konumudur.Aynı şekilde, iğne deliğinin en parlak konumunu y yönü için arayın. Y yönü için en parlak konum da başarıyla belirlendi. İğne deliğinin x ve y konumunu birleştirir.Her günün ölçümünden önce iğne deliği konumunu ayarlamak daha iyidir. Canlı yol değiştirildiğinde, iğne deliği konumu yeniden ayarlanmalıdır. Bir sayım oranı oluşturun ve telefon sayım hızını izleyin.BGBM izleme moduna geçin. BGBM değerinin en yüksek olması için çalıştırdığınız nesnenin düzeltme halkasını sayın. Sayım oranı penceresini kapatın.Rhodamine 6G çözüm ölçümü ile başlayın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, Eğri Sığdırma Analizi gerçekleştirmek için sığdır'ı tıklatın. Eski korelasyon işlevinin takılması için bir model seçin.Rhodamine 6G için, üçüz durumda 1 bileşenli, 3 boyutlu difüzyon için modeli seçin. Kırmızı çizgiyi hareket ettirerek montaj başlangıç saatini ayarlayın. Sığdırma hesaplamasını başlatmak için Tüme Sığdır'ı tıklatın.Uyum sapması kontrol edin. Tarafların sıfır civarında deftere nakledilip negatif olduğundan emin olun. Takılan değerleri kontrol edin.Difüzyon süresinin kabaca 20-30 mikrosaniye aralığında olduğundan emin olun. Ayrıca, yapısal parametre dört ila sekizdir. Sığdırma panelini açın ve ölçüm için bir model seçin.Uygun paneldeki numunenin modeline aynı yapısal parametre değerini girin. Türün Sabit olarak ayarlanacağından emin olun. Hücre lisatında GFP-TDP25 ölçümü.Lysate'i kapak odasına yerleştirin. Lisatın kurumasını önlemek için kapağı yerleştirin. Işık gölgelendirmesi için sahne kapağını yerleştirin.Alım panelinde lazer gücünü, ölçüm süresini ve tekrarlarını ayarlayın. Satın almaya başlayın. Bir ani artış gözlendi.Yine bir ani artış gözlendi. Ani artış, algılama gövdesinden geçen parlak molekülleri gösterir. Sivri uçlar çözünür oligomerleri veya agregaları gösterir.Eğri sığdırma analizi yapmak için bir uyum oluşturun. Üçüz durumdaki 2 bileşenli, 3 boyutlu difüzyon için modeli seçin. Uygun başlangıç saatini ayarlayın.Tüme Sığdır'ı tıklatın. Takılan değerleri kontrol edin. CANLı HÜCREDE GFP ölçümü ile etiketlenmiş SOD1-G85R.Çözelti ölçümünün aksine, ısı evresi inkübatörü kullanmanızı öneririm. Mikroskop sahnesinde hücre kültleme kabını ayarlayın. Oküler kullanarak odağı ve konumu onaylayın.Bir ölçüm hücresi seçin. Hızlı tarama modu kullanarak hücre konumunu yakınlaştırın ve ayarlayın. Yavaş tarama hızı modunu kullanarak hücrelerin anlık görüntüsünü alın.Konum aracını kullanarak bir FCS ölçüm pozisyonu seçin. Çapraz çizgi ölçüm pozisyonunu gösterir. Ölçüme başlayın.Foton sayım oranı kaydının hafifçe azalması GFP'nin fotobleaching olduğunu göstermektedir. Eğri montajını gerçekleştirin. Hücre lisatında GFP-TDP25'in temsili sonuçları gösterilmiştir.Üst grafik foton sayım oranının bir kaydı. Okların olduğu yerde çözünür oligomerler ve agregalar öneren bir çivi vardır. Orta grafik eski korelasyon işlevini temsil eder.Gri çizgi düşük, eski korelasyon işlevini gösterir. Macenta çizgisi takılı işlevi gösterir. Noktalı çizgiler, montaj için başlangıç ve bitiş saatlerini gösterir.Alt tabloda takılan değer gösterilir. Daha sonra, canlı bir hücrede SOD1-G85R-GFP'nin temsili sonuçları gösterilir. Üst grafik foton sayım oranımızın bir kaydını temsil eder.Kaydedilen foton sayım oranının kademeli olarak azaldığı gözlendi ve bu da farklı ölçümler için GFP büyümesinin fotobleaching olduğunu düşündürdü. Bunun nedeni canlı hücrelerdeki yavaş difüzyon hızıdır. Orta grafik SOD1'in eski korelasyon işlevini temsil eder.Gri çizgi düşük, eski korelasyon işlevini gösterir. Macenta çizgisi takılan işlevi gösterir. Noktalı çizgiler, montajla başlangıç ve bitiş saatlerini gösterir.Alt tabloda takılı değerler gösterilir. Burada, hücre lisatında TDP-25 ile ilişkili her hücreden ve FCS kullanarak canlı hücrelerde SOD1'in her mutantından difüzyonu ölçmek için bu prosedürü gösteriyoruz. Hücre lisatında çözünür oligomerler ve toplama genellikle sivri uçlar veya patlamalar olarak gözlenebilir.Öte yandan, canlı hücrelerde, muhtemelen bariz canlı yapılar dışında, bu tür sivri uçlar nadiren gözlenir. Mutant SOD1'lerin yavaşça difüze eden bir türü, bizim için içindeki SOD1 homopolimerizasyonu gibi tek parçacıklar için ortalama parlaklık ekler. Burada gösterilen prosedür basit ve değerlidir.FCS radyasyon içermez;doğrudan uyku durumunda. Bu sadece senin ve bizim hayal gücümüz.

detection-protein-aggregation-using-fluorescence-correlation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, proteazom aktivitesini bloke eden, yanlış katlanmış, mutant proteinlerin, bir floresan etikete kaynaşmış, ubikitine bağımlı proteazomal bozunmaya uğramasını önleyen proteazom inhibitörleri kullanılarak hücre bazlı bir protein agregasyon testini gösteriyoruz, bu da hücre sitoplazması içinde birikmelerine yol açar. Protein agregatları daha sonra floresan mikroskobu ile görselleştirilir ve ölçülür.

Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, protein homo-oligomerizasyonunu incelemek için floresan dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğini göstermektedir. Bir numunedeki floresan etiketli proteinler, FFS kullanılarak protein oligomerizasyonu incelenirken bir ajan kullanılarak dimerize edilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, proteinler küçük gözlem hacmine girip çıktıkça, proteinlerin oligomerik durumunu belirlemek için floresan moleküllerinin parlaklığındaki dalgalanmaların analizi yapılır.

Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Bu videoda, florofor etiketli Shwachman-elmas sendromu (SBDS) proteini ile uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimleri incelemek için floresan anizotropi tekniğini açıklıyoruz. SBDS proteinlerinin kademeli olarak artan EFL1 konsantrasyonları ile inkübe edilmesinde, iki protein arasında başarılı bir etkileşime işaret eden anizotropide sabit bir artış gözlenir.

Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını...

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Hedef reseptörleri hücre yüzeyinde bağlanan antikorlar uyum ve küme değişikliklerini görüşmek. Bu dinamik değişiklikler ilaç geliştirme hedef hücrelerdeki karakterize konusunda da etkileri vardır. Bu iletişim kuralı confocal mikroskobu ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile hücre yüzeyinde kümeleme reseptör kapsamını ölçmek için ImageJ/FIJI kullanır.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Biz kızılötesi nanospectroskopi ve yüksek çözünürlüklü atomik kuvvet mikroskobu oligomerik agregalar ve amiloid fibrils içine protein kendini montaj sürecini görselleştirmek için uygulama açıklar, yakından başlangıç ve geliştirme ile ilişkilidir insan nörodejeneratif bozuklukların geniş bir yelpazede.

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Keşfedin floresan korelasyon spektroskopisi ile protein toplanmasını tespit etme yöntemini. ALS ile ilişkili TDP25 ve mutant SOD1 proteinlerinin difüzyon özelliklerini hücre lizatlarında ve canlı hücrelerde analiz edin.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Daha fazla video keşfet