Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

Floresan anizotropi bazlı protein-protein etkileşimi tespiti için, uygun bir anizotropi tamponunda C-terminal tetrasistein motifleri ile etiketlenmiş rekombinant hedef proteinlerle başlayın.

Florofor içeren bir boya ekleyin - tetrasistein motifi yoluyla hedef proteinlere bağlanın. Anizotropi tamponu ile diyalize edin, bağlanmamış boyayı çıkarın. Karışımı kuvars küvetlere aktarın. Başarılı bir şekilde etiketlenmiş hedef proteinlerin yüzdesini belirleyerek absorbansı ölçün.

Bir floresan küvetinde, florofor etiketli hedef proteinleri etiketlenmemiş proteinlerle karıştırın. Bir spektroflorometre kullanarak, floresan anizotropisini ölçün.

Hedef proteinler tamponda serbestçe asılı kaldıkça, onlara bağlı floroforlar, Brown hareketi nedeniyle eksenleri etrafında rastgele döner. Uygun bir dalga boyunda dikey polarize ışıkla uyarıldığında, floroforlar dikey ve yatay düzlemlerde polarize ışık yayar. Dikey ve yatay polarize emisyonların floresan yoğunluklarının oranı - anizotropi - ölçülür.

Etiketlenmemiş proteinler florofor etiketli hedeflere bağlandığında, protein kompleksinin moleküler boyutu artar ve dönme hareketini azaltır. Sonuç olarak, yayılan ışık daha polarize hale gelir ve dikey düzlemde yatay düzlemden daha yüksek emisyon ile anizotropiyi arttırır.

Etiketlenmemiş proteinin artan konsantrasyonlarını ekleyin ve anizotropi ölçümünü tekrarlayın.

Artan etiketlenmemiş protein ilavesi ile anizotropide doğrusal olmayan bir artış, florofor etiketli hedef proteinler üzerindeki çoklu özdeş olmayan bağlanma bölgelerinde etiketlenmemiş protein bağlanmasını gösterir.

3 nanomol SBDS-FlAsH proteinini 3 nanomol Lumio Green boya ile 5 mikrolitre hacminde anizotropi tamponunda karıştırın. Reaksiyonun 4 santigrat derecede 8 saat devam etmesine izin verin. 8 saat sonra, serbest boyayı çıkarmak için numuneyi gece boyunca anizotropi tamponuna karşı diyalize edin. Bir kuvars küvet kullanarak bir spektrofotometrede 280 nanometre ve 508 nanometrede absorbansı ölçün. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi etiketli proteinin yüzdesini ölçmek için Lambert-Beer yasasını kullanın.

Anizotropi değerini ölçmeden önce, protein-ligandın her titrasyon adımı, tüm numunenin çözeltiye dağıtıldığından ve homojen hale geldiğinden emin olarak dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Bir floresan küvette, 200 mikrolitre 30 nanomolar SBDS-FlAsH'yi anizotropi tamponuna yerleştirin ve 2 mikrolitre 30 mikromolar EFL1'i titre edin. İyice karıştırın ve anizotropi ve floresan değerini ölçmeden önce reaksiyonun 3 dakika beklemesine izin verin. Toplam 40 mikrolitre EFL1 hacmi eklenene kadar bu işlemi tekrarlayın. Son adım olarak, verileri metin protokolünde açıklandığı gibi varsayılan bir bağlama modeline sığdırın.