Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

Floresan anizotropi bazlı protein-protein etkileşimi tespiti için, uygun bir anizotropi tamponunda C-terminal tetrasistein motifleri ile etiketlenmiş rekombinant hedef proteinlerle başlayın.

Florofor içeren bir boya ekleyin - tetrasistein motifi yoluyla hedef proteinlere bağlanın. Anizotropi tamponu ile diyalize edin, bağlanmamış boyayı çıkarın. Karışımı kuvars küvetlere aktarın. Başarılı bir şekilde etiketlenmiş hedef proteinlerin yüzdesini belirleyerek absorbansı ölçün.

Bir floresan küvetinde, florofor etiketli hedef proteinleri etiketlenmemiş proteinlerle karıştırın. Bir spektroflorometre kullanarak, floresan anizotropisini ölçün.

Hedef proteinler tamponda serbestçe asılı kaldıkça, onlara bağlı floroforlar, Brown hareketi nedeniyle eksenleri etrafında rastgele döner. Uygun bir dalga boyunda dikey polarize ışıkla uyarıldığında, floroforlar dikey ve yatay düzlemlerde polarize ışık yayar. Dikey ve yatay polarize emisyonların floresan yoğunluklarının oranı - anizotropi - ölçülür.

Etiketlenmemiş proteinler florofor etiketli hedeflere bağlandığında, protein kompleksinin moleküler boyutu artar ve dönme hareketini azaltır. Sonuç olarak, yayılan ışık daha polarize hale gelir ve dikey düz