Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Bu protokol, C.eleganların biyokimyasal çalışması için teknik bir boşluğu doldurur ve model organizma olarak yararlılıklarını genişletir. Bu teknik hem basit hem de sağlamdır ve işlevsel olarak aktif C.elegans nükleer ekstresinin tutarlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Senkronize L1 hayvanlarını Escherichia coli OP50 ile tohumlanmış 10 adet 150 milimetre nematod büyüme ortamı içeren plakalara yerleştirerek başlayın ve hayvanların L4 aşamasına ulaşana kadar 20 santigrat derecede 48 saat büyümesine izin verin.

Hipotonik ve hipertonik tamponlar hazırlandıktan sonra, öğütme odasını% 70 etanol ile su basarak Balch homojenizatörini temizleyin. Daha sonra fazla etanol kaldırmak için odayı deiyonize su ile durulayın. Tungsten karbür topını öğütme haznesine yerleştirin.

Balch homojenizatör varilinin uçlarını kapla ve kapakları sağlanan başparmak vidalarıyla sabitle. Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi örnek başına tam hipotonik ve hipertonik tamponların beş mililitresini hazırlayın. Daha sonra steril, iki mililitrelik bir şırıngayı bir mililitre tam hipotonik tamponla doldurun ve Balch homojenizatörün taşlama odasını hafifçe yıkayın ve odada yaklaşık 500 mikrolitre tam hipotonik tampon bırakın.

Yıkanmış homojenizonu buzda saklayın ve 30 dakika soğumaya bırakın. İyi beslenen L4 hayvanlarını M9 tamponu ile 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve hayvanları üç dakika boyunca 1.000 kez g'da santrifüjleyin. Süpernatant çıkarın ve süpernatant temiz olana kadar hayvan peletini yıkamaya devam edin.

Daha sonra hayvanları üç mililitre soğuk hipotonik tamponla yıkayın ve gösterildiği gibi tekrar santrifüj yapın. Süpernatan hipotonik tamponu çıkardıktan sonra, hayvan peletine bir mililitre tam hipotonik tampon ekleyin ve hayvan süspansiyonu yeni bir steril, iki mililitrelik şırınna aktarın. Buzda tutulan hayvanları homojenizleştirmek için, hayvanları tungsten topu ile yüklü Balch homojenizatörün öğütme odasından hafifçe itin.

Sonra hayvanları şırınd içinde geri toplayın ve bu prosedürü 30 kez tekrarlayın. 30 homojenizasyon döngüsünden sonra, Balch homojenizatörden maksimum hayvan süspansiyonu toplayın ve şırıngayı ucu 1,7 mililitrelik bir mikrotüp içinde aşağı doğru yerleştirilmiş olarak saklayın. Tungsten topunu çıkarın ve taşlama odasını deiyonize suyla temizleyin.

Kurulayın ve topu ilgili etiketli tüpe geri verin. Daha sonra 7.9880 milimetre çapında ve 12 mikrometre boşluk açıklığı olan tungsten toplarını taşlama odasına yerleştirin ve homojenizatörü yeniden yerleştirin. Taşlama haznesini bir mililitre buz gibi tam hipotonik tamponla tekrar yıkayın.

Süspansiyonu gösterildiği gibi 25 kez ezin. Hayvan süspansiyonu temiz, 1,7 mililitrelik bir mikrotüp içine aktarın ve süspansiyonu buzda saklayın. Hayvan bedenlerini ve enkazı santrifüjle aşağı doğru pelet.

Pipet 40 mikrolitresi, giriş fraksiyonu olarak etiketlenmiş bir tüpe ve fraksiyonu buz üzerinde saklayın. Kalan süpernatantı peleni bozmadan yeni bir 1,7 mililitrelik tüpe ve çekirdeği peletmek için santrifüje aktarın. Daha sonra peletlenmiş çekirdekleri rahatsız etmeden süpernatantı sitozolitik fraksiyon olarak etiketlenmiş yeni bir 1.7 mililitrelik tüpe aktarın.

Çekirdek peletini yıkamak için, pelete 500 mikrolitre tam hipotonik tampon ekleyin, peleti askıya alın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede 4.000 kez santrifüjleyin. Santrifüjlemenin sonunda, nükleer peleti 500 mikrolitre taze tam hipotonik tamponda yeniden ıslatın ve numuneyi gösterildiği gibi tekrar santrifüj edin. Daha sonra peleti 40 mikrolitre tam hipertonik tamponda çözün.

Nükleer süspansiyonu nükleer fraksiyon etiketli 1.7 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve buzda saklayın. Floresan nicelleştirme kiti kullanarak üç fraksiyonun protein konsantrasyonunu belirleyin. Nükleer fraksiyonları altı mikrogram nükleer protein içeren tek kullanımlık tüplere ayırın ve kuru buz ve etanol banyosunda dondurun.

Numuneleri daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Temsili jel görüntüsü, CMV promotör DNA şablonunu kullanarak Caenorhabditis elegans L4 larva nükleer ekstresinin transkripsiyon ürünlerini gösterir. Aktif nükleer proteinlerin başarılı izolasyonu, in vitro transkripsiyondan sonra 132 baz çift bandı ile sonuçlandı ve başarısız izolasyon zayıf bir bant veya bir bandın olmamasına neden oldu.

Tüm arabellekleri açıkça etiketlemeyi unutmayın. Uygunsuz tamponlar nükleer proteinlerin işlevselliğine zarar verebilir. Ayrıca, proteinlerin denatüre olmasını önlemek için homojenizatör buz soğuk tutun.

Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların stresli koşullar sırasında C.eleganların RNA transkripsiyon oranını ölçmelerine izin vererek, hayvanın transkripsiyon oranının çevresel koşullara bağlı olarak değişebileceğini gösterdi.