Name: Aktif Caenorhabditis elegansın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'tan fonksiyonel nükleer ekstrakt izolasyonu ve in vitro transkripsiyon rekonstitüsyonu için güvenilir bir yöntem. Bu teknik, gen düzenlemesi araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma bir NIH MIRA hibesi (R35GM124678'den J. S.'ye) tarafından desteklendi.

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak rakip çıkarları yoktur.

C. elegans , düşük maliyetli bakımı ve genetik manipülasyon kolaylığı nedeniyle ökaryotik transkripsiyon sistemini incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada L4 C. elegans fonksiyonel olarak aktif nükleer özün tutarlı izolasyonu için bir protokol açıklanmıştır. Bu protokol transkripsiyon etkinliğini görselleştirmeye odaklansa da, transkripsiyon aktivitesinin daha hassas bir ölçümünü elde etmek için transkripsiyon sonrası üretilen cDNA RT-qPCR kullanılarak ölçülebilir8. ...

Küçük, serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans , çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için basit ama güçlü bir model organizmadır. 1963'te piyasaya sürülmesinden bu yana, nematodlar nörobiyoloji, metabolizma, yaşlanma, gelişim, bağışıklık ve genetik1 sorularını yanıtlamak için paha biçilmez olmuştur1. Hayvanın ideal bir model organizma olmasını sağlayan birçok özelliğinden bazıları arasında kısa nesil süre, RNA parazitinin etkinliği, şeffaf vücut ve hem hücresel soyunun hem de sinir sisteminin tamamlanmış haritaları bulunur.
Nematodun bilime katkıları çok büyük olsa da, ökaryotik transkripsiyon sistemini aydınlatmak için yetenmemiştir, bu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızın çoğu maya, meyve sineği ve memeli hücre kültüründen nükleer ekstrakt kullanan çalışmalardan gelmektedir2. Araştırmacıları fonksiyonel nükleer özüt çıkarmaktan vazgeçiren en büyük engel nematodun sert dış manikürüdür. Bu dış iskelet çapraz bağlı kollajenler, cuticlins, glikoproteinler ve lipitlerden oluşur ve C. eleganları larva aşamasından yetişkinliğe kadar kimyasal veya mekanik kuvvetlerle protein ekstraksiyona dayanıklı hale getirir3. C. elegans nükleer ekstresi kullanan bir in vitro transkripsiyon sistemi bir zamanlar geliştirilmiştir, ancak sistemin sınırlı kapsamı nedeniyle yaygın olarak benimsenmemiştir ve özü hazırlamak için Dounce homojenizatörün kullanılması protein kararsızlığına yol açabilir4,5.
C. eleganları kırmak için bir Dounce homojenizatör kullanan nükleer ekstrakt izolasyonu için önceki protokolün aksine, bu protokol bir Balch homojenizatör kullanır. Balch homojenizatör iki ana bileşenden oluşur: bir tungsten karbür topu ve bir uçtan diğerine sıkılmış bir kanala sahip paslanmaz çelik bir blok. Balch homojenizatörü tungsten karbür topu ile yüklenir ve taşlama odasını kapatmak için her iki tarafa da kapatılmıştır. Şırınnalar, taşlama odasına giden iki dikey bağlantı noktasına yüklenebilir. Malzeme bir şırınnadan diğerine taşlama odasından geçirilirken, şırınnalardan gelen basınç malzemeyi top ile odanın duvarı arasındaki dar bir boşluktan geçirir. Bu yavaş ve sabit basınç, dar boşluktan kolayca geçebilen tutarlı bir boyuta ulaşana kadar malzemeyi kırar. C. elegans'ı sürekli ama yumuşak bir basınçla dar boşluktan zorlamak, hayvanları açar ve içeriklerini çevredeki tampona bırakır. Top boyutlarının değiştirilmesi boşluğu daha da sıkılaştırarak yeni salınan hücreleri kırar ve çekirdeği tampona boşaltır. Santrifüjlemenin birden fazla örneği çekirdekleri hücre kalıntılarının geri kalanından ayırarak temiz bir nükleer özün toplanmasına izin verir. Balch homojenizatör, Dounce homojenizatöre göre birkaç nedenden dolayı tercih edilir: sistem çok sayıda hayvanı idare edebilir ve tek bir denemede yüksek miktarda aktif protein çıkarmayı mümkün hale getirir; topların ve çelik bloğun hassas işlenmesi, birden fazla numune arasında tutarlı taşlama sağlar; ağır çelik blok bir ısı emici görevi görür, ısıyı taşlama odasından düzgün bir şekilde çeker ve denatüre etmeyi önler.
İzolasyondan sonra, nükleer ekstrakt transkripsiyon aktivitesi herhangi bir biyokimyasal deneyde kullanılmadan önce doğrulanmalıdır. Geleneksel olarak, transkripsiyon aktivitesi, yeni sentezlenen RNA'yı izlemek ve görselleştirmek için radyolabelli nükleotidler kullanılarak ölçüldü. Bununla birlikte, radyoaktif etiketleme, kullanım ve bertaraf sırasında önlem gerektirdiği için külfetli olabilir6. Günümüzde teknolojik gelişmeler, araştırmacıların nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)7 gibi teknikleri kullanarak küçük RNA miktarlarını bile ölçmek için çok daha az zararlı veya zahmetli yöntemler kullanmalarına izin verir. Burada protokol, aktif nükleer özü larva evresi 4 (L4) C. eleganlardan izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Sarf malzemeleri ve reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL 8 Şeritli Tüpler ve Düz Şerit Kapaklar, Clear</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL Bireysel PCR tüpleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL steril mikrotüpler</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>% 100 mutlak moleküler sınıf etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>%100 etanol, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; V1001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipet</td><td>VWR uluslararası</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>150 mm petri plakaları</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>20 mL plastik şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Norm-Ject şırınga</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 mL vakumlu filtre kabı 0.22 &mikro; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>50 mL serolojik pipet</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serolojik pipet</td><td>VWR uluslararası</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Ağar, Kriter</td><td>VWR Uluslararası</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Denville Bilimsel</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Alkol geçirmez işaretleyici</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>VWR Uluslararası</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td> Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum diklorür</td><td>Millipore Sigma</td> <td>ve nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>&nbsp; C8667</td><td></td></tr><tr><td>Kontrol DNA tapınağı klonlama primerleri, İleri 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrol DNA tapınağı klonlama primerleri, İleri 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>DNA jel boyası, SYBR güvenli</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA merdiven karışımı, O' gen cetveli</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>DNA Yükleme Boyası, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNase, Taban Çizgisi-SIFIR</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>Kuru buz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Escherichia coli OP50 suşu</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A38</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>HeLa nükleer ekstrakt in vitro transkripsiyon sistemi, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Çözeltisi, 1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit% 37</td> <td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Hipoklorit ağartıcı</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum diklorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>Orta ağırlıkta bulaşıklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop slaytları, Vista vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>moleküler dereceli su, Hypure</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>Nystatin</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; N1638</td><td></td></tr><tr><td>PCR sistemi, FailSafe, premix A</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>FS99100</tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü, Tek kullanımlık kokteyli durdurun 100x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>protein test kiti, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; Q33211</td><td></td></tr><tr><td>ters transkripsiyon kiti, Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon kiti RNeasy mikro kiti</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNase İnhibitörü</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>VWR Uluslararası</td><td>&nbsp; BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Millipore Sigma</td> <td>ve nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & mikro ile steril şırınga filtresi; m Polietersülfon membran</td><td>VWR uluslararası</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>VWR Uluslararası</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>transkripsiyon primerleri, İleri 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>transkripsiyon primerleri, Ters 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 derece C inkübatör</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 & derece; C kuluçka makinesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C inkübatörü</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & derece; C buzdolabı</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& derece; C dondurucu</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch homojenizatör, isobiotec hücre homojenizatör</td><td>Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, Eppendorf 5418 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj, VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu, Leica M80</td>, <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Florometre, Qubit 2.0</td>, <td>Invitrogen</td>, <td>Q32866,</td><td></td></tr><tr><td>Jel görüntüleme sistemi, iBright FL1500</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>Jel sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüjler, Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Pipet L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan platform</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

aktif caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için nükleer ekstrakt ve rekonsitasyonu İzolasyonu

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans, 1963 yılında piyasaya sürüldüldüklerinden beri biyolojik araştırmalar için önemli bir model sistemidir. Bununla birlikte, C. elegans, in vitro transkripsiyon ve DNA replikasyon gibi nükleer özlerini kullanarak biyolojik reaksiyonların biyokimyasal çalışmasında tam olarak kullanılmamıştır. Biyokimyasal çalışmalarda C. elegans'ı kullanmanın önemli bir engeli, nükleer özün aktivitesini feda etmeden nematodun kalın dış kütikülünü bozuyor. Kıtkeni kırmak için Dounce homojenizasyon veya sonication gibi çeşitli yöntemler kullanılırken, genellikle protein kararsızlığına yol açarlar. Aktif nükleer proteinlerin in vitro reaksiyonlar için larva veya yetişkin C. eleganlardan izole edilmesi için belirlenmiş bir protokol yoktur. Burada protokol, larva evresi 4 C. eleganların balç homojenizatörü kullanılarak homojenizasyonunu ayrıntılı olarak açıklar. Balch homojenizatör, hayvanları bu süreçte kütikülleri kıran dar bir boşluktan yavaşça zorlamak için basınç kullanır. Balch homojenizatörün düzgün tasarımı ve hassas işlenmesi, deneyler arasında hayvanların tutarlı bir şekilde taşlanmasına izin verir. Balch homojenizatörden elde edilen homojenatın fraksiyone edilmesi, C. eleganların transkripsiyon aktivitesini test etmek için bir in vitro yöntemde kullanılabilecek işlevsel olarak aktif nükleer ekstrakt sağlar.

Özetlenen adımların ardından fonksiyonel nükleer ekstrakt (Şekil 1) verilmelidir, taşlama veya yıkama adımlarındaki sapma zayıf aktiviteye veya düşük verime yol açabilir. Fonksiyonel C. elegans nükleer özü elde edilirse, daha önce açıklanan in vitro teste eklendiğinde CMV promotörünün bölgesini DNA şablonuna aşağı doğru yazıya dökecektir. Elde edilen RNA transkript, geleneksel yöntemler kullanılarak nükleer proteinlerden ve DNA şablonundan ...

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Bu protokol, C.eleganların biyokimyasal çalışması için teknik bir boşluğu doldurur ve model organizma olarak yararlılıklarını genişletir. Bu teknik hem basit hem de sağlamdır ve işlevsel olarak aktif C.elegans nükleer ekstresinin tutarlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Senkronize L1 hayvanlarını Escherichia coli OP50 ile tohumlanmış 10 adet 150 milimetre nematod büyüme ortamı içeren plakalara yerleştirerek başlayın ve hayvanların L4 aşamasına ulaşana kadar 20 santigrat derecede 48 saat büyümesine izin verin.Hipotonik ve hipertonik tamponlar hazırlandıktan sonra, öğütme odasını% 70 etanol ile su basarak Balch homojenizatörini temizleyin. Daha sonra fazla etanol kaldırmak için odayı deiyonize su ile durulayın. Tungsten karbür topını öğütme haznesine yerleştirin.Balch homojenizatör varilinin uçlarını kapla ve kapakları sağlanan başparmak vidalarıyla sabitle. Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi örnek başına tam hipotonik ve hipertonik tamponların beş mililitresini hazırlayın. Daha sonra steril, iki mililitrelik bir şırıngayı bir mililitre tam hipotonik tamponla doldurun ve Balch homojenizatörün taşlama odasını hafifçe yıkayın ve odada yaklaşık 500 mikrolitre tam hipoto

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Erkeğin spermatid yalıtma ve etkinleştirmek için bir...

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Bu iletişim kuralı, hücresel Caenorhabditis elegans içinde vivohücre kaderi dönüşüm sırasında çalışma açıklar. Transjenik hayvanlar, ısı-şok organizatörü tahrik overexpression nöron kader-inducing transkripsiyon faktörü CHE-1 ve Kromatin düzenleyen faktör LIN-53 mikrop nöron yeniden programlama için hücre RNAi aracılı tükenmesi izin kullanarak gözlenen vivo.<br...

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Bu yöntem, Caenorhabditis elegans örneklerinden ve daha sonra eş-immünoselipitasyondan yüksek verimli protein özü hazırlanması için bir protokol açıklar.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Mevcut protokol, Caenorhabditis elegans için sıvı ve plaka üstü kültürlerde lipit takviyesi yöntemlerini, uzunlamasına çalışmalar ve toplu veya birkaç solucan ve solucan dokusundan gen transkripsiyonel analizi ile birlikte tanımlamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Uzun Ömürlülük ve Gen Transkripsiyonel Analizi için Lipid Takviyesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'tan fonksiyonel nükleer ekstrakt izolasyonu ve in vitro transkripsiyon rekonstitüsyonu için güvenilir bir yöntem. Bu teknik, gen düzenlemesi araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Daha fazla video keşfet