Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için İn Vitro
3 Ekim 2014
Bu protokol, in vitro kas hücrelerinin kasılma ölçmek için esnek kültür yüzeyleri olarak mikro silikon konsolun kullanımını tarif etmektedir. Hücresel kasılması, ölçülen kaydedilen ve in vitro kontraktil fonksiyon ölçmek için non-invazif ve ölçeklenebilir sisteminin temin edilmesiyle, kuvvet çıktılan dönüştürülebilir dirsekli bükme neden olur.
Aşağıdaki deneyin amacı, kontrollü bir in vitro ortamda stimülasyona yanıt olarak kültürlenmiş kas liflerinin kasılma aktivitesini ölçmektir. Bu, ayrışmış kas hücrelerinin mikro ölçekli silikon konsollar üzerine kaplanması ve bu tek çekirdekli hücrelerin füzyonunun miyo tüpleri olarak adlandırılan lifler oluşturmak üzere indüklenmesiyle elde edilir. Farklılaşmış kas hücrelerini destekleyen bu konsol çipleri daha sonra, çipin teçhizata yerleştirilmesinden sonra kas kasılmasına yanıt olarak konsol sapmasını ölçmek için kullanılan bir lazer ve foto dedektörünü desteklemek için modifiye edilmiş bir elektrofizyoloji mikroskobuna aktarılır.
Lazer, konsolun ucuna odaklanacak şekilde konumlandırılır ve foto dedektör de aynı şekilde saptırılmış ışını yakalayacak şekilde hizalanır Elektriksel veya kimyasal işleme yanıt olarak kas kasılmasının neden olduğu konsol sapma derecesini gösteren sonuçlar elde edilir ve tohumlanan hücrelerin kasılma profilinin gerçek zamanlı olarak doğrudan ölçümünü sağlar. Sonuç olarak, konsol yer değiştirmesi, bir kuvvet okuması sağlamak için işlenebilir. Bu sistem, ilaç tedavisi, hastalık, durum veya egzersiz protokollerine yanıt olarak kasılma fonksiyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesi için potansiyel bir yüksek verimli test yatağı sağlamak üzere çoğullanmıştır.
Bu tekniğin, yama kelepçe elektrofizyolojisi gibi mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında temel avantajı, fonksiyonel analiz için bu yöntemin non-invaziv olması ve yüksek verimli çalışmalar için kolayca uyarlanabilir olmasıdır. Bu yöntem, klinik değerlendirmeden önce uygun doz yanıt konsantrasyonlarının belirlenmesi gibi ilaç geliştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, farklı patolojik fenotiplerden hücrelerin fonksiyonel performansını gerçek zamanlı olarak araştırmak için araçlar sağladığı için çoklu kas hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, ancak bu yöntem iskelet iskelet kası patolojileri hakkında bilgi sağlayabilir.
Kardiyak ve düz kas gibi diğer doku sistemleri için de kullanılabilir Sterilize edilmiş, önceden hazırlanmış konsol cipsleri ve% 70 etanol çözeltisinde 13 F kapak kızakları ve bir akış başlığında havada kurumaya bırakılır. Ardından, 13 F kapak fişinin üzerine tek tek konsol talaşlarını yerleştirin. Standart bir 12 oyuklu plakanın içinde, konsolları kullanılan hücre tipi için optimize edilmiş biyopolimer veya yüzey modifikasyonu ile kaplayın Standart hücre kültürü protokollerine göre, yüzey kaplaması hazırlama yöntemimiz kullanılarak 30 dakika sürer, ancak araştırmacının özel kültür protokolüne bağlı olarak değiştirilebilir.
Reese, hücrelerin kendi özel büyüme ortamlarında istenen konsantrasyona getirilmiş, daha sonra yüz mikrolitre hücre süspansiyonu konsol çip yüzeyine yerleştirilmiştir ve ortam kabarcığının konsol pencerelerini tamamen kaplamasını sağlamıştır. Talaşları içeren plakayı bir inkübatöre aktarın ve bu kaplama süresinden sonra hücrelerin en az bir saat yapışmasına izin verin. Çipi 13 F kapak kayması olmadan temiz bir kuyuya aktarmak için steril forseps kullanın ve her birine bir mililitre büyüme ortamı ekleyin.
Plakayı inkübatöre geri koyun, hücreleri in vitro bakım için standart protokollerine göre koruyun. Kapak kızaklarında, ısıtılmış bir kültür kabını dik bir elektrofizyoloji mikroskobu sahnesine yerleştirin. Isıtılmış mikroskoba mevcut hücre besleme ortamının üç mililitresini ekleyin.
Aşama paslanmaz çelik elektrotları, ısıtılmış kültür kabının iç kısmına 15 milimetrelik bir ayırma mesafesinde monte edin. Bunları, sistemin uygun olduğunda hücrelerin alan stimülasyonunu üretmesine izin vermek için alan stimülasyonu, değişen yoğunlukta, frekansta ve dalga biçiminde darbeler üretebilen bir darbe üretecine bağlayın. XY öteleme aşamalarına monte edilmiş bir helyum neon lazeri mikroskop masasının alt tarafına cıvatalayın.
Ardından lazeri, lazer ışını ısıtılmış kültür kabının tabanından konsol düzlemine göre 30 derecelik bir açıyla yönlendirilecek şekilde ayarlayın. Sonraki cıvata, mikroskop aşamasının alt tarafına XY öteleme aşamalarına monte edilmiş bir kadran foto dedektör modülü. Konumunu, yansıyan lazer ışını dört kadranın ortasına inecek şekilde ayarlayın.
Metin protokolünde sağlanan akış şemasına atıfta bulunarak konsolları tarayan doğrusal aktüatörleri kontrol etmek için bir yazılım programı yazın. Konsol analiz donanımını ve ilgili yazılımı açın. Isıtılmış aşamayı mrta içine yerleştirin ve 37 santigrat derece okumasını bekleyin.
Ardından, konsol çipini, konsollar sahnenin sağ tarafına doğru yönlendirilecek şekilde sahneye yerleştirin. Mikroskop ışık kaynağını açın. Konsolların kenarlarını görünür hale getirmek için mikroskobu odaklayın ve konsolların sahne konsolunun sağına yönlendirildiğini varsayarak, lazer ışınını konsolun ucuna yerleştirmek için lazer foto dedektörü kontrol yazılımını kullanın.
Biri, dizinin sol üst köşesinde yer alan ve sayılar 16'ya kadar inen sayıdır. Sol altta. Konsol 17 sağ üst konumdadır ve 32'ye kadar çalışır.
Sağ altta, kayıt yazılımında oynat düğmesine basın. Fotoğraf dedektörünü kontrol eden step motorları ayarlayarak fotoğraf dedektörünü hem x hem de y karelerinde sinyal sıfır okuyacak şekilde konumlandırın. Ardından, lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsolu bir konuma ayarlayın.
Ardından, lazeri konsolun 16 ucuna hareket ettirin. Fotoğraf dedektörünün konumunu tekrarlayın ve lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsol 16 konumunu ayarlayın. Şimdi lazeri konsol 32'nin ucuna getirin.
Fotoğraf dedektörünün konumunu tekrarlayın ve lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsol 32 konumunu ayarlayın. Son olarak, lazeri konsol 17'nin ucuna hareket ettirin. Fotoğraf dedektörünün konumunu tekrarlayın ve lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsol 17 konumunu ayarlayın.
Mikroskop ışık kaynağını ve ardından laboratuvardaki tepe ışığını kapatın. Kayıt yazılımında kayıt düğmesine basın. Darbe üreteci donanımını 40 milisaniyeye ve beş voltluk darbelere, bir hertz frekansına ayarlayın.
Ardından makineyi açın Lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımını kullanarak, donanımı 32 konsol dizisi boyunca tarama yapacak şekilde ayarlayın. Her birinde beş saniye durmak. 32 konsolun taraması tamamlandığında, stimülatörü kapatın.
Ardından kayıt yazılımını durdurun ve veri dosyasını açın. Her konsoldan kaydedilen izi inceleyin. Kasılma aktivitesinin kanıtı için.
Bir daralma, bir tepe noktası olarak tanımlanır. Sapma, taban çizgisinin en az 0.1 volt üzerindeyse, olumlu yanıtları olan her bir konsolu not edin. Yanıt vermeyen konsolları lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımındaki tarama protokolünden çıkarın.
Aktif konsollar daha sonra hücre spontan kasılma aktivitesinin bir okumasını elde etmek için stimülasyon olmadan yeniden taranabilir. Daha sonra, kültürlenmiş hücrelerin fonksiyonel çıktısı üzerindeki etkisini gözlemlemek için ortama terapötik bir bileşik ekleyin. Geniş alan elektrik stimülasyonu olan veya olmayan bileşik çalışma taramalarının eklenmesini takiben, hücreleri uzun süreler boyunca elektriksel olarak uyararak yorulma değerlendirmeleri yapın, ardından tepe kuvvetinin belirli bir eşiğin altına düşmesinin ne kadar sürdüğünü ölçmek için kasılma seviyelerini tarayın.
Motor nöro nöro mio tüp konsol kokültürlerinin bir nöronal uyarıcı veya sinaptik inhibitör ile tedavisi ve spontan aktivitedeki artış ve azalmaların taranması yoluyla motor nöronların kas ile ko-kültürde tutulduğu deneylerde, konsol sapma verilerini metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analiz etmeye devam edin. Konsollar üzerinde kontraktil hücrelerin başarılı kültürü, standart hücre kültürü tekniklerini kullanan nispeten basit bir prosedürdür. Standart elektrofizyolojik yazılım, ham verileri analiz etmek için kullanılabilir ve tepe kuvveti, tepe kuvvetine kadar geçen süre ve yarı gevşeme süresi gibi ilgili fonksiyonel özelliklerin hesaplanmasını kolaylaştırır.
Genişletilmiş stimülasyon protokolleri, kültürlenmiş hücrelerdeki yorgunluk oranlarını değerlendirmek için araçlar sağlar, böylece bu sistemden elde edilebilecek fizyolojik veri seviyesini genişletir. Konsol kültür sistemi, in vitro nöromüsküler sinaps oluşumunun değerlendirilmesine izin vermek için iskelet kası myo tüpleri ile kültür sistemine motor nöronları içerecek şekilde modifiye edilebilir. Bu tür kültürlerde, spontan kasılma aktivitesi oranları, glutamat gibi nöron spesifik bir uyarıcı ile tedaviye yanıt olarak kasılma oranlarıyla karşılaştırılır.
Kasılma oranlarında gözlenen herhangi bir glutamat kaynaklı artış, asetilkolin salınımına ve ardından mio tüp aktivasyonuna yol açan kültürlenmiş nöronların aktivasyonunu düşündürmektedir Glutamat ile indüklenen aktivitenin durmasına yol açan asetilkolin reseptör blokeri, dtu rine gibi sinaptik inhibitörlerle tedavi, bu kültürlerde fonksiyonel nöromüsküler sinapsların varlığı için daha fazla kanıt sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş iskelet kasının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için mikro ölçekli silikon konsolların nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kas hücrelerinin in vitro kontraktilitesini ölçmek için bükülebilir kültür yüzeyleri olarak mikro ölçekli silikon konsolların (cantilever) kullanımını açıklamaktadır. Hücresel kontraksiyon, konsolun bükülmesine neden olur; bu bükülme ölçülerek kuvvet değerlerine dönüştürülebilir ve böylece kontraktil fonksiyonun değerlendirilmesi için invaziv olmayan bir sistem sağlanmış olur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Kas lifleri, deneysel analizler için in vitro ortamda kültüre edilebilir.
- Mikro ölçekli konsol kirişler (cantilevers), kas kasılmasını ölçmek için özgün bir yöntem sunar.
- Kas fizyolojisini anlamak için kontraktil aktivitenin gerçek zamanlı ölçümü kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, kas fonksiyonlarının yüksek kapasiteli (high-throughput) test edilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Kültürlenmiş kas liflerinin kasılma aktivitesini ölçmek için.
- Kas hücrelerinin elektriksel veya kimyasal stimülasyona verdiği yanıtı değerlendirmek için.
- Kas kasılabilirliğini değerlendirmek için ölçeklendirilebilir bir sistem geliştirmek için.
Kullanılan Yöntemler
- Ayrıştırılmış kas hücreleri, mikroölçekli silikon konsolların üzerine ekilir.
- Kontraktilite ölçümü için hücrelerin miyotüplere dönüşmesi (füzyon) sağlanır.
- Konsol çipleri; lazer ve fotodetektör içeren bir elektrofizyoloji mikroskobuna yerleştirilir.
- Kas kasılmasına yanıt olarak konsol sapması ölçülür.
Temel Sonuçlar
- Sonuçlar, konsol sapma derecesinin kas kasılmasıyla ilişkili olduğunu göstermektedir.
- Gerçek zamanlı veriler, kas hücrelerinin kasılma profili hakkında içgörüler sağlar.
- Sistem, kontraktil fonksiyonun multipleks değerlendirmesine olanak tanır.
- Potansiyel uygulamalar arasında ilaç tedavisi ve egzersiz protokolü değerlendirmeleri yer almaktadır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, kas kasılabilirliğini incelemek için invaziv olmayan bir yaklaşım sunar.
- Kas fonksiyonlarının yüksek kapasiteli analizi için bir platform sağlar.
- Bulgular, kas fizyolojisinin ve patolojisinin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Mikroölçekli silikon konsol sistemleri, hücresel kontraktil fonksiyonun invaziv olmayan, gerçek zamanlı ölçümüne olanak tanıyarak kas dokularında ilaç etkinliğinin ve toksisitesinin değerlendirilmesi için öngörücü bir in vitro platform sağlar. Bu yaklaşım, farmakolojik veya genetik perturbasyonlara karşı kontraktil yanıtlar hakkında nicel ve tekrarlanabilir veriler sunarak, erken evre hedef doğrulamayı ve öncü bileşik tanımlamasını destekler. Multipleks dizi tasarımı, orta ila yüksek kapasiteli taramayı kolaylaştırarak portföy önceliklendirmesini iyileştirir ve nöromusküler, kardiyak ve düz kas terapötik geliştirme süreçlerindeki geç evre biyolojik riskleri azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Uyarılmaya yanıt olarak iskelet, kalp ve düz kas hücrelerinin doğrudan fonksiyonel çıktılarını ölçerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşimi için fenotipik bir okuma olarak kontraktil aktivitenin hassas ve etiketsiz nicelendirmesi yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Öngörücü Değer: Lead optimizasyonu ve preklinik devam/durdur kararlarına temel teşkil eden doz-yanıt ve kinetik veriler üretir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Tutarlı bileşik değerlendirmesi için çoklu kantilever dizilerinde standartlaştırılmış, tekrarlanabilir kontraktil ölçümler sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: İlaç kaynaklı kontraktil fonksiyon değişikliklerini değerlendirmek için orta ve yüksek kapasiteli protokollere olanak tanıyarak tarama kampanyalarının verimliliğini destekler.
- Veri Kalitesi: Değişkenliği azaltan ve yapı-aktivite ilişkilerine olan güveni artıran, gerçek zamanlı, sapma tabanlı kuvvet okumaları sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık Modelleme: Patolojik fenotiplerdeki hücrelerde kontraktil disfonksiyonun değerlendirilmesine olanak tanıyarak, nöromüsküler ve diğer kas hastalıkları için fenotipik taramayı destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Ko-kültür sistemlerinde nöromüsküler kavşak oluşumunun ve nöron-kas iletişiminin değerlendirilmesini kolaylaştırarak hedef mekanizma doğrulama sürecine bilgi sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Yorgunluk, stimülasyon veya bileşik maruziyeti koşulları altında kontraktil performansın boylamsal değerlendirmesine imkan tanıyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya geçişte köprü kurar.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Kaldıraç sistemi, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlama ve preklinik değerlendirmeye kadar keşif iş akışına entegre olarak, biyokimyasal ve genetik tarama yaklaşımlarını tamamlayan fonksiyonel bir fenotipik platform sunar.
- Keşif Biyolojisi: Genetik veya farmakolojik pertürbasyonları, hücresel kontraktilitedeki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Multiplex defleksiyon ölçümleri aracılığıyla analiz standardizasyonuna ve tekrarlanabilirliğe olanak tanıyarak, güvenilir bileşik kütüphanesi taramasını destekler.
- Analitik: Bileşik etkinliğinin ve etki mekanizmasının karşılaştırılmasına yardımcı olan pik kuvvet, pik süresi ve relaksasyon kinetiği gibi kantitatif çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili kontraktil fenotipleri modelleyerek ve kas temelli modellerde terapötik kurtarmayı değerlendirerek preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kas hücresi tipleri ve hastalık modelleri genelinde yeniden kullanılabilir ve uyarlanabilir bir yetenek sunarak, mükerrer analiz geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sürrogat belirteçler yerine fonksiyonel, fizyolojik son noktaları ölçerek hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Otomatik lazer sapma deteksiyonu ve multipleks dizi formatları aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Bileşiklerin erken fonksiyonel triyajını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve yanlış pozitiflere yapılan yatırımı azaltır.
- Portföy Etkisi: in vivo çalışmalar öncesinde kontraktil risk veya etkinlik hakkında mekanistik içgörü sağlayarak risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü, kas farklılaşması ve elektrofizyoloji uyumlu mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Stimülasyon ve ölçüm için lazer ve foto-detektör enstrümantasyonuna, XY translasyonel aşamalara ve pals jeneratörü donanımına bağımlıdır.
- Farklı merkezlerde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hücre ekimi, yüzey kaplaması ve stimülasyon protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı kas tiplerine (iskelet, kalp, düz) adaptasyon, yüzey kaplamalarının ve kültür koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, protokolde belirtildiği üzere, optik bileşenlerin dikkatli bir şekilde hizalanması gerekliliği ve uzun süreli kayıtlarda meydana gelebilecek potansiyel sinyal kayması yer almaktadır.
