Name: Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için İn Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin mikro silikon konsollar kullanarak hücresel kasılma fonksiyonunu in vitro ortamda ölçme yöntemini. Bu teknik, kas hücrelerinin elektriksel veya kimyasal uyarıya yanıtını değerlendirmek için invaziv olmayan bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Sağlık hibe numaraları R01NS050452 ve R01EB009429 Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi. Konsol cips imalatı Cornell Üniversitesi&#39;nde bulunan Nanofabrikasyona Tesisinde işbirlikçileri tarafından dışarıdan gerçekleştirildi. Konsol üretim sürecinde kullanılan tüm ekipmanlar bu tesiste yer oldu. Konsol mikro-üretim ile yardım için Mandy Esch ve Jean-Matthieu Prot Special thanks. Konsol işlevsellik video animasyon UCF de Sentetik Gerçeklik Lab Charles Hughes, Alex Zelenin ve Eric Imperiale tarafından oluşturulmuştur.

1. Konsol Chip Fabrikasyon Açıklanan imalat adımlarının gösterilen ayrıntıları Şekil 1 'de verilmiştir. <ol><li> Bir fırın içinde silikon üzerinde yalıtkan (SOI) gofret yerleştirin ve bunları kurutmak için 20 dakika boyunca 125 ° C'de pişirilir. </li><li> Bir plazma kullanılarak susuz SOI gofretin sap tabakası üzerine silikon oksit, 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka yatırın kimyasal buhar çöktürme (PECVD) aracı artırıldı. </li><li> Cihaz katman yukarı bakacak şekilde spin lak mandrenin gofret yerleştirin. , Gofret merkezli olduğundan emin olun 1,000 rpm / saniye bir hızlanma 60 saniye boyunca 3000 rpm'de gofret merkezinde ve spin P20 astar 2 ml dağıtmak. P20 astar cihaz fotorezist tabakaya yapışmasını teşvik etmektedir. </li><li> Gofret spin lak mandrenin görünse de, o ile 1000 rpm / saniye oranında hızı 60 saniye boyunca 3000 rpm'de S1818 gofretin ortasına ışığa ve spin 2 ml dağıtmakFotorezist 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka btain. </li><li> Sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin ve 1 dakika boyunca 115 ° C'de bir fırında yumuşak gerçekleştirin. </li><li> Cihaz üzerinde bir tabaka ışığa için konsol maskeden desen transfer etmek için bir iletişim fotolitografi maske hizalama kullanılarak sert kontakt UV ışınlarına maruz kalma gerçekleştirin. 125 mj / S1818 fotodirenç için cm 2 poz enerji değerine göre pozlama süresini hesaplayın. </li><li> Hafifçe ileri ve geri gofretin çalkalayarak, 1 dakika boyunca 726 MIF fotorezist geliştirici gofret daldırarak fotorezist geliştirir. </li><li> De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun. </li><li> Aseton batırılmış bir pamuk bez kullanılarak (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarından fotorezist çıkarın. </li><li> Fotorezist tarafı yukarı bakacak şekilde, bir Derin Reaktif İyon Asitli (DRIE) aracında gofret yükleyin ve devi ile desenli silikon tabakasını etch için bir reçete çalıştırınce katmanı. Bir aşındırma durak olarak gömülü oksit katmanı işlevleri, yani tam bir iz sağlamak için gerekli olması beklenmektedir% 100'den daha fazla döngü için% 50 ile bir iz gerçekleştirin. </li><li> Fotorezist şerit 20 dakika boyunca sıcak bir fotorezist Banyo çözeltisi içindeki gofret yerleştirin. DI su ile gofret durulayın hızlı-dökümü-rinser (QDR) gofret aktarın. Fotorezist şerit ardından, durulama ve gofretin kuruması için SRD aracında gofret yükleyin. Beklendiği gibi konsol desen görünür sağlamak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin. </li><li> Bir PECVD alet gofretin cihaz katmanda un katkılı bir silikon oksit 1 mikron kalınlığında bir tabaka bırakın. Daha fazla işlem kademesi sırasında konsollar için koruyucu tabaka olarak bu oksit tabakası çalışır. </li><li> Gofretin arka tarafının başlatmak üzere yukarı bakacak şekilde sap tabakası ile dönel kaplayıcı aynası üzerine, gofret yerleştirin. Olun gofret 3000 rpm'de P20 gofretin ortasına astar ve spin 2 ml dağıtılması, ortalanır1000 rpm / saniye oranında hızı 60 sn. </li><li> Gofret spin lak mandrenin görünse de, bir 6.5 mikron kalınlığında bir tabaka elde edilmesi için 1000 rpm / saniye oranında hızı 45 saniye boyunca 2000 rpm'de gofretin merkezi ve spin üzerine SPR220-4.5 fotodirenç 2 ml dağıtmak Fotorezist. </li><li> 2 dakika boyunca 115 ° C'de bir fırında yumuşak gerçekleştirmek için bir yakınlık sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin. </li><li> Ön / arka uyum yeteneğine sahip bir fotolitografya temas hizalama kullanarak, ön yan konsol desen arka pencere maske hizalayın ve kolu katmanda fotodirenç için arka pencere maskeden desen transfer etmek için bir sert kontakt UV maruziyetini gerçekleştirin. 480 mj / SPR220-4.5 fotodirenç için cm 2 poz enerji değerine göre hesaplanan bir pozlama süresi kullanın. </li><li> UV'ye maruz kalmadan sonra, çok ince bisküviler bir sonraki işleme aşamasından önce 30 dakika süre ile karanlık bir yerde kalmasını sağlar. </li><li> Gofretin daldırarak fotorezist geliştirilmesi2 dakika süre ile, 726 MIF fotorezist geliştirici hafifçe ileri ve geri gofreti çalkalandı. </li><li> De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun. </li><li> 12 saat boyunca 90 ° C'de bir fırında gofret yerleştirin. </li><li> Florlu gazlar ile RIE sistemi ve oksit gravür için bir tarifi kullanarak gofret ters silikon oksit tabakası etch. Gofretin ters desenli oksit daha sonraki işlemler için bir aşındırma maske olarak görev yapar. Maruz kalan penceresinde silikon oksit tamamen kazınmış olduğundan emin olmak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin. </li><li> Aseton batırılmış bir bez kullanılarak temiz oda (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarında fotorezist çıkarın. </li><li> Bir DRIE aracında gofret yüklemek ve bir aşındırma durak olarak gömülü oksit tabakası işleyişi ile 500 um'lik bir derinliğe desenli tabaka sap oyulması için bir tarifi çalıştırın. Aşırı ısınmasını önlemek için birden çok çalışır içine bu etch bölünmüşsilikon tutarsız aşındırma neden gofret. Bu aşındırma adımı tamamen dirseklerin altında silikon kaldırır. </li><li> Dirseklerin altında gömülü oksit tabakası ve dirseklerin üstüne koruyucu oksit katman şerit,% 25 sulandırılmış HF pürüzlendirici kullanan bir ıslak aşındırma adımı gerçekleştirir. Not: Bu adım silikon konsolun alt yüzeyi serbest bırakır ve aynı zamanda lazer ile dirsekli araştırmak için bir erişim sağlamak için altına bir pencere açar. </li><li> DI su banyoları dizi ve azot ile dikkatlice kuru kullanarak gofret durulayın. Konsollar kendi üslerinde yalnızca desteklenen yana, doğrudan dirseklerin üzerine DI su veya inert gaz güçlü spreyler kullanmayın. </li><li> Sap tabakası aşındırma adımı esnasında üretilen klevajın çizgileri boyunca gofret bireysel fiş bölmektedir. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Daha önce yayınlanmış yöntemlerden 17'ye göre 13F lamelleri hazırlayın. NOT: Eğer 13F koyrslips mevcut değildir, 95 ° C'nin üzerindeki bir temas açısına sahip herhangi bir hidrofobik yüzey kullanılabilir. </li><li> Konsol cips ve% 70 etanol çözeltisi içinde 13F lamelleri sterilize ve bir akış kaputu kurumaya bırakın. </li><li> Bir standart 12 plaka içindeki 13F lamelleri üstüne bireysel konsol cips yerleştirin. </li><li> Kaplayın hücre tipi için optimize biyopolimer veya yüzey modifikasyonu ile dirsekleri standart hücre kültür protokollere göre kullanılır. </li><li> Istenen konsantrasyona kendi özel büyüme ortamında hücrelerin yeniden askıya. NOT: Bu protokol konsol penceresinden düşen ve istenilen konsol yüzeyine yapışan olmayan hücrelerin önemli bir sayıda neden olur. Hücre preparasyonlar, bu sebepten, standart preparatları için bir örtücü cam, daha konsantre 3-4x yapılmalıdır. Örneğin, sıçan iskelet kas uydu hücreleri, tipik olarak tohumlama 500-700 hücre / mm kare 15,16 ilk önce tohum ekme yoğunluğu kullanılarak yürütülürVe / meydan aa 2000 hücre olacak şekilde konsol alt tabakalar kullanılmaktadır. Optimizasyon deneyler, uygun bir tohum yoğunluğu belirlemek için yeni bir hücre kaynakları ile yapılmalıdır. </li><li> Orta kabarcık tamamen konsol pencere kapsayan sağlanması konsol çip yüzeyi üzerine, hücre süspansiyonu 200 ul pipetle. Orta pencereden fitiller ve dirseklerin üstüne bir statik kabarcık oluşturmak vermezse 13F lamel değiştirmek ve kaplama reattempt. </li><li> Bir kuluçka yongası içeren plaka aktarın ve hücreler, en az 1 saat (tercihen 2-3 saat) boyunca yapışmaya izin verir. </li><li> Bu kaplama tamamlandıktan sonra, büyüme ortamı, 1 ml kültür, bir 13F lamel olmaksızın temiz bir çukuruna çipi transferi, ve en fazla steril forseps kullanır. </li><li> Inkübatör plaka dönün. </li><li> Lamelleri in vitro bakım için standart bir protokole uygun hücreleri korumak. Iskelet kası hücreleri için,Hücreler birleştiklerinde, gerekli olacaktır hale kez ortam bileşiminin bir anahtar miyotüp oluşumunu tetiklemek için karıştırılabilir. </li></ol> Konsol Saptırma Analiz için Donanım ve Yazılım 3.Kurulum <ol><li> Dik elektrofizyoloji mikroskop aşamasında içine ısıtılmış kültür çanak yerleştirin. </li><li> Isıtılmış mikroskop kademesine ile henüz (+ 10 mM HEPES) içinde süspanse edilmektedir besleme ortamının 3 ml ilave edilir. </li><li> 15 mm'lik bir ayırma mesafesi ile ısıtılmış kültür çanak iç paslanmaz çelik elektrotlar monte ve bir darbe üreteci arasında değişen yoğunlukta, frekans ve dalga biçimi alan uyarım darbelerini üretebilen bağlamak, sistem alan uyarımı üretmek için izin Uygun zaman hücrelerin. </li><li> , Mikroskop tablonun alt tarafına, X ve Y platformlarının üzerine monte edilen bir helyum-neon lazer cıvata ve lazer ışını, bir 30 ° 'lik açı relativ de ısıtılmış kültür çanak tabanı boyunca yönlendirilecek şekilde ayarlayınkonsolun düzlemine e. </li><li> , Mikroskop sahne alt etmek, XY öteleme aşamalarında üzerine monte edilmiş bir kadran fotoğraf-dedektör modülü cıvata ve 4 kadranın merkezinde yansıyan lazer ışını topraklar. Şekil 2, böylece konumunu ayarlamak kurmak donanımın bir bakış sağlar Açıklanan protokol uygulanması için gerekli. </li><li> Cantilevers üzerinden tarama doğrusal aktüatörler kontrol etmek için bir yazılım program yazın. Şekil 3'te sunulan akış şemasına değini ile yazılım programı yazmak. Bu sistem ile kullanılmak üzere programlanmış bir grafik arayüz Şekil 4'te sunulmuştur. </li></ol> 4. Kaydı Konsol Sapma Veri <ol><li> Konsol analiz donanımı ve ilgili yazılımlar açın. </li><li> Ortama ısıtılmış sahne termistoru yerleştirin ve 37 ° C okumak için sabırsızlanıyorum. </li><li> Cantileve ile aşamaya konsol çipi takınSahnenin sağ tarafında yönelmiştir rs. </li><li> Mikroskop ışık kaynağı açın. </li><li> Konsol varsayarsak sahnenin sağında, konsol 1 yöneliktir: görünüm içine konsolun kenarlarını getirmek ve konsol 1. NOT ucunda lazer ışını konumlandırmak için lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanmak için Odak mikroskop Dizinin sol üst konumlandırılmış biridir ve sayılar sol alt aşağı 16 çalıştırın. Konsol 17 sağ üst pozisyonda ve sağ alt (Şekil 5A) içinde 32 hareket eder. </li><li> Basın kayıt yazılımı üzerinde "oynamak". </li><li> Sinyal foto-dedektörü kontrol kademeli motora ayarlayarak, x ve y çerçeveleri hem de "0" okur, böylece foto-dedektörü yerleştirin. </li><li> Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı Set konsol 1 pozisyon (Şekil 4). </li><li> . Adımı 4.7 tekrarlayın, konsolun 16 ucuna lazer taşıyın ve cantilev seter lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı 16 pozisyon. </li><li> Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 32 pozisyonunu tekrar, konsolun 32 ucuna lazer taşıyın. </li><li> Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 17 pozisyonunu tekrar, konsolun 17 ucuna lazer taşıyın. </li><li> Mikroskop ışık kaynağı ve laboratuarda havai ışığı kapatın. </li><li> Kayıt yazılımı basın "rekor". </li><li> 1 Hz frekansta 40 msn'de, 5 V bakliyat için nabız jeneratörü donanımı ayarlayın ve makineyi açın. NOT: İsteğe bağlı olarak, bu noktada belirli bir hücre kaynakları için optimize edilmiş stimülasyon protokolleri istihdam, belirtilen ayarları insan ve kemirgen hücre kaynaklarının 12,13,15,16 kullanılarak toplanan verilere dayalı kurallar vardır. </li><li> Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanarak, her on 5 saniye durdurma, 32 konsol dizi boyunca tarama donanımı ayarlayınör. </li><li> 32 konsolun Tarama işlemi tamamlandığında, daha sonra kayıt yazılımı ve veri dosyasını getirmek, uyarıcı kapatın. </li><li> Kontraktil aktivite kanıt her bir dirsek gelen kaydedilen iz inceleyin. Olumlu tepkiler her konsolun bir kenara not edin. Saptırma taban üzerinde en az 0,1 V ise, bir daralma, bir tepe noktası olarak tanımlanır. </li><li> Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı üzerinde tarama protokolü herhangi bir sigara duyarlı konsol çıkarın. </li><li> Aktif konsollar daha sonra hücrenin spontan kontraktil aktivitenin bir okuma almak için uyarı olmaksızın rescanned edilebilir. </li><li> Kültürlenen hücrelerin fonksiyonel çıktıya üzerindeki etkisini gözlemlemek için ortama terapötik bir bileşik ilave edildikten sonra, ya da geniş alan elektriksel uyarımı olmaksızın taramaları çalıştırın. </li><li> Elektriksel Uzun süre ve Contr tarama seviyeleri için hücreleri uyararak yorgunluk değerlendirmeler yürütmek actility belirli bir eşiğin altına düşmesi pik gücü için ne kadar sürdüğünü ölçmek için. </li><li> Motor nöronlar, kas ile ko-kültür içinde muhafaza edilir deneylerde, nöromüsküler nöronal bir uyarıcı motonöron-miyotüp konsol ko-kültürler işlemi ile bağlantı oluşumu (glutamat gibi) veya sinaptik inhibitör ölçün (örneğin, D-tubokurarin) ve tarama spontan aktivitede artış ve azalışlar sırasıyla 16. </li><li> Planlanan deneyler ihtiyaçlarına göre belirlenecektir gibi özel taramalar yapar. </li></ol> Konsol Sapma Verilerin 5. Analiz <ol><li> Kullanım Stoney denklemleri 15 hücre tabakası veya miyotüp (Pascal), ve (nano-Newton) hücresel kasılma gücünün doğrudan ölçümü stres bir okuma içine (Volt) ham konsol sapma verilerini dönüştürmek için (aşağıda ayrıntılı) güncellendi: reklam / 51866 / 51866eq1.jpg "/&gt; Denklem 1 <img alt="Denklem 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg"> Denklem 2 </li><li> Δ = konsol ucu sapma ve stres miyotüp tarafından üretilen yerlerde, σ c üniforma kalın filmi konsol, C dedektörün tam genişliğini varsayarak miyotüp tarafından üretilen = stres, = fotoğrafın üstüne lazer konumuna gerilimi ilişkin sistemine özgü katsayısı -detector, θ = konsolun düzlemine lazer ve detektör açısının E Si silikon elastik modüle = t Si konsolun kalınlığı = t = f miyotüp kalınlığı v = Si oranı arasında Zehir silikon, L = konsol uzunluğu, dedektör konsol ucundan lazer P = yolu uzunluğu, w Şekil 6'da verilmiştir. </li><li> Düzgün bir film miyotüp olduğunu varsayarak, miyotüp yapan kuvvet Stoney uygulama için kullanılan stresten kuvvet hesaplama ve varsayılan hücre bir kesit alana eşitleyerek, 3. Denklem yol filmde kuvvete eşittir denklem. <img alt="Denklem 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg"> Denklem 3 </li><li> Fonksiyonel Veri toplama, imünositokimyasal analizler için konsol fiş düzeltmek veya standart teknikler kullanılarak protein veya DNA analizi için hücreler kullanır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, daha sonraki bir zaman noktasında, işlevsel performansı yeniden değerlendirme amacıyla kuluçka yerine moleküler analiz için hazırlanırken hücreleri döner. </li></ol>

<ol><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+liberation+of+myogenic+cells+from+adult+rat+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle.</a> Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).</li>
<li>Yasin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+technique+for+growing+human+adult+skeletal+muscle+in+culture+starting+from+mononucleated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells.</a> J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).</li>
<li>Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitability+and+isometric+contractile+properties+of+mammalian+skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).</li>
<li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).</li>
<li>Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fiber+study+of+contractile+and+biochemical+properties+of+skeletal+muscles+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Diabetes. 43, 622-628 (1994).</li>
<li>Harber, M., Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+of+young+competitive+distance+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology+%28Bethesda%2C+Md%3A+1985%29%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners.</a> Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).</li>
<li>Hvid, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+days+of+muscle+disuse+impairs+single+fiber+contractile+function+in+young+and+old+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men.</a> Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+performance+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Contractile performance of striated muscle.</a> Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+mammalian+organ+systems+and+their+integration+into+models+of+whole+animals+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans.</a> Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).</li>
<li>Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+functional+myotubes+with+a+Bio-MEMS+device+for+non-invasive+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation.</a> Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).</li>
<li>Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+contractile+stress+generated+by+cultured+rat+muscle+on+silicon+cantilevers+for+toxin+detection+and+muscle+performance+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+embryonic+skeletal+muscle+myotube+physical+characteristics+with+contractile+force+generation+on+an+atomic+force+microscope-based+bio-microelectromechanical+systems+device%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+physics+letters%22%5BJournal%5D)">Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device.</a> Applied physics letters. 103, 83108(2013).</li>
<li>Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+system+for+high-content+screening+of+neuromuscular+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro.</a> Technology. 1, 37-48 (2013).</li>
<li>Stenger, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coplanar+molecular+assemblies+of+amino-+and+perfluorinated+alkylsilanes%3A+characterization+and+geometric+definition+of+mammalian+cell+adhesion+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth.</a> Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).</li>
<li>Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+long-term+in+vitro+tissue+engineered+model+of+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions.</a> Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).</li>
<li>Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+the+mechanosensory+circuit+of+the+stretch+reflex+arc%3A+Sensory+neuron+innervation+of+intrafusal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers.</a> Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).</li>
<li>Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+tissue+engineering%3A+A+maturation+model+promoting+long-term+survival+of+myotubes%2C+structural+development+of+the+excitation-contraction+coupling+apparatus+and+neonatal+myosin+heavy+chain+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression.</a> Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+novel+serum-free+cell+culture+model+of+skeletal+muscle+differentiation+by+systematically+studying+the+role+of+different+growth+factors+in+myotube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).</li>
<li>Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+determinants+of+neuronal+survival+and+growth+on+self-assembled+monolayers+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture.</a> Brain research. 630, 136-147 (1993).</li>
<li>Hickman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+pattern+design+for+in+vitro+cellular+networks+using+surface+photochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Scienc.%2C+%26+Technology+A%3A+Vacuum%2C+Surfaces%2C+and+Films%22%5BJournal%5D)">Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry.</a> Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).</li>
<li>Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li>
<li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li>
<li>Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+Surface+patterning+of+self+assembled+monolayers+for+controlling+neuronal+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biomedical+engineering+and+technology%22%5BJournal%5D)">Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior.</a> International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).</li>
<li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line%2C+NSI-566RSC%2C+and+its+induction+to+functional+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li>
<li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643(2010).</li>
<li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional%2C+high+information+content+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li>
<li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture%3A+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+and+tissue%22%5BJournal%5D)">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li>
<li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol+Biomater%22%5BJournal%5D)">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Hücresel daralma kanıt için mikro konsol analiz kritik adımlar mikroskop sahne içindeki konsol çip yerleştirme ve dizideki köşe konsolun ucuyla lazer ve foto-dedektör sonraki hizalama vardır. Bu doğru yapılmazsa, o zaman yazılım potansiyel veri toplama sırasında yanlış negatif birikimine neden, dizideki kalan konsolun pozisyonlarını hesaplamak için mümkün olacaktır. Operatörler konsol çip lazer pozisyonları kalibre önce kültür çanak alt ile aynı hizada yalan emin olmak için dikkatli olmalıdır. Çip çanak içinde bir açıda...

Hem insan hem de kemirgen kaynaklarından elde edilen kas hücrelerinin in vitro kültürü onlarca yıldır mümkün olmuştur1,2. Bununla birlikte, standart lamel preparatları biyokimyasal değerlendirme için yararlı olsa da, hücrenin birincil fonksiyonel çıktısının (kasılma) analizini kolaylaştırmazlar ve bu nedenle hücresel olgunlaşma ve performansı değerlendirmek için bir araç olarak biraz sınırlı bir değere sahiptirler. Bu tür in vitro kültürlerden elde edilebilecek veri miktarını en üst düzeye çıkarmak için, bu tür hücreleri, fonksiyonel performanslarının gerçek zamanlı değerlendirmesine izin veren konfigürasyonlarda barındırabilen sistemlerin geliştirilmesini ilerletmek gerekir. Çok sayıda üç boyutlu kas modelinin kurulması, bu ihtiyacı karşılama yolunda bir miktar ilerleme kaydetmiştir ve bu tür sistemler, kültürlenmiş kas hücrelerinin kasılma kapasitesini in vitro3-5 olarak değerlendirmek için bir dizi yayında kullanılmıştır. Bu tür sistemler doku modelleme ve rekonstrüksiyon çalışmaları için paha biçilmez olsa da, tek hücre tepkileri çalışmaları için uygulanabilirlikleri sınırlıdır. Tek lif çalışmalarının gerekli olduğu bu gibi durumlarda, karmaşık ve emek yoğun ex vivo metodolojiler tek seçenek olarak kalmaktadır6-10. Ayrıca, ilaç geliştirme ve tarama protokolleri için karmaşık, çok organlı platformların geliştirilmesine yönelik mevcut hareket, non-invaziv, kolayca ölçeklenebilir ve destekleyici hücreler ve doku modelleriyle kolayca entegre olan sistemlerin kurulmasını gerektirmektedir11. 
Mikro ölçekli konsollar, tek hücrelerin/küçük hücre popülasyonlarının fonksiyonel kasılma kapasitesini değerlendirmek için basit bir yöntem sunar12,13. Teknik, modifiye edilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) teknolojisine (AFM) dayanmaktadır14 ve kültürlenmiş miyotüp kasılma aktivitesine yanıt olarak mikro ölçekli konsol sapmasını ölçmek için bir lazer ve foto-dedektör sistemi kullanır. Modifiye edilmiş Stoney denklemleri daha sonra miyotüpteki gerilimi ve gözlemlenen substrat sapmasını15 oluşturmak için miyotüp tarafından uygulanan kuvveti hesaplamak için kullanılır. İlaç toksisitesi/etkinliği çalışmaları için potansiyel orta ila yüksek verimli uygulamalar sunan, çoğullanmış konsol dizilerinin eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlayan bir tarama programı yazılmıştır15,16. Bu tür bir teknoloji, in vivo ilaç etkinliğini tahmin etmek için fonksiyonel, klinik öncesi tahlillerin geliştirilmesinde paha biçilmez olabilir.Ayrıca, konsol çiplerinin silikonda üretilmesi, immün boyama, western blotting ve PCR gibi standart biyomoleküler tahliller için hücrelerin analiz sonrası işlenmesini engellemez. 
Bu el yazması, mikro ölçekli silikon konsolların üretimi ve hazırlanması, donanım ve yazılım kurulumu ve bu çipler üzerinde kültürlenen kasılma hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmek için çalıştırma yönergeleri hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar. Bu yüzeylerdeki hücrelerin kaplanması ve bakımı için standart hücre kültürü teknikleri uygulanabilir, bu nedenle güvenilir kültür parametrelerinin mevcut olduğu herhangi bir kontraktil hücre tipi bu cihazla kolaylıkla entegre edilebilmelidir. Bu sistemde kullanılan nispeten basit 2D kültür parametreleri, diğer hücre modellerinin entegrasyonunu veya kaslarla etkileşime girebilen hücre tiplerinin (innerve edici nöronlar gibi) eklenmesini doğrudan yapar ve bu modelin daha karmaşık fonksiyonel in vitro testlerin geliştirilmesinde uygulanabilirliğini büyük ölçüde artırır ve memeli sistemlerinin çok organlı modelleri.

<table><tbody><tr><td>Birincil sıçan kas büyüme ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>G5 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glial-Türetilmiş Nörotrofik Faktör</td><td>Hücre bilimleri</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör</td><td>Hücre bilimleri</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>siliyer nörotrofik faktör</td><td>Hücre bilimleri</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Nörotrofin-3</td><td>Hücre bilimleri</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Nörotrofin-4</td><td>Hücre bilimleri</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Asidik Fibroblast Büyüme Faktörü</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>13241-013&nbsp;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>Kardiyotrofin-1</td><td>Hücre bilimleri</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Heparin Sülfat</td><td>Sigma</td><td>D9809&nbsp;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Lösemi İnhibitör Faktör</td><td>Sigma</td><td>L5158&nbsp;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng / ml</td></tr><tr><td>Birincil sıçan kas farklılaşma ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sınıf 2 kırmızı diyot lazer</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotoğraf dedektörü</td><td>Noah Industries Model</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Nabız stimülatör</td><td>A-M sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Sayısallaştırıcı</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yama kelepçesi mikroskop ve sahne</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta T4 kültür kabı kontrolörü</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoskop yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW yazılımı</td><td>Ulusal Enstrümanlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 oC, %5 CO2 inkübatör</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sınıf 2 mikrobiyolojik akış başlığı</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetler ve uçlar</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikro silikon konsolun kullanımı hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için İn vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Daha fazla ön ve biyolojik olarak uygun in vitro tahlillerin gelişimi tohumlanmış hücrelerin fonksiyonel değerlendirilmesini sağlamak çok yönlü hücre kültür sistemlerinin ilerlemesi dayanmaktadır. Bu amaçla, mikro konsol bükme teknolojisi daralma kaynaklı alt tabakanın değerlendirilmesi yoluyla, iskelet, kalp ve düz kas hücreleri dahil hücre tipleri, bir dizi kasılma işlevselliğini ölçmek için hangi ile bir platform sunuyor. Birden fazla mesaj göndermiş konsol dizilerin uygulanması ilaç yeterlilik ve toksisitesini, hastalığın ilerlemesini fenotip ve yanı sıra, kas ve diğer hücre-hücre etkileşimleri değerlendirmek için yüksek verimli protokollere orta geliştirmek için bir araç sağlar. Bu yazıda, bu amaç için güvenilir bir konsol dizileri imal edilmesi için ayrıntıları ve bu yüzeyler üzerinde başarıyla kültürü hücreleri için gerekli olan bir yöntem sağlar. Ayrıca açıklama fonksiyonel anal gerçekleştirmek için gerekli adımlar sağlanırkontraktil hücre tipleri Ysis yeni lazer ve foto-dedektör sistemi kullanarak bu tür diziler üzerinde muhafaza. Vurgular hassasiyet ve bu sistem ile mümkün kontraktil fonksiyonun tekrar analiz tekrarlanabilir niteliği verilen temsili veriler, hem de çalışma geniş olan bu tür önlemlerin hale gelebilir. Bu sistemin başarılı yaygınlaşmasının araçlarla araştırmacılar doku performansı, hastalık gelişimi ve yeni terapötik tedaviye yanıtın daha doğru tahminlere yol açan, in vitro hızlı, düşük maliyetli fonksiyonel çalışmalar yapmak sağlayabilir.

Dirseklerin kontraktil hücrelerinin başarılı kültürü, standart hücre kültürü teknikleri (Şekil 5) kullanılarak, nispeten basit bir işlemdir. Yakalanma hücreleri destekleyici dirseklerin yüzdesi, hücre tipine bağlı olarak değişir incelenmiş ve belirli bir kültür tekniği kullanılmış olmasıdır. Sıçan arka bacak türetilen birincil embriyonik hücreleri kullanarak, kontraktil aktivite incelendi konsolun tespit% 12 (n = 4). Açıklanan lazer ve foto-dedektör sistemi kullanılarak kasılma fonksiyonu analizi seriba...

Bu protokol, in vitro kas hücrelerinin kasılma ölçmek için esnek kültür yüzeyleri olarak mikro silikon konsolun kullanımını tarif etmektedir. Hücresel kasılması, ölçülen kaydedilen ve in vitro kontraktil fonksiyon ölçmek için non-invazif ve ölçeklenebilir sisteminin temin edilmesiyle, kuvvet çıktılan dönüştürülebilir dirsekli bükme neden olur.

Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için İn Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Aşağıdaki deneyin amacı, kontrollü bir in vitro ortamda stimülasyona yanıt olarak kültürlenmiş kas liflerinin kasılma aktivitesini ölçmektir. Bu, ayrışmış kas hücrelerinin mikro ölçekli silikon konsollar üzerine kaplanması ve bu tek çekirdekli hücrelerin füzyonunun miyo tüpleri olarak adlandırılan lifler oluşturmak üzere indüklenmesiyle elde edilir. Farklılaşmış kas hücrelerini destekleyen bu konsol çipleri daha sonra, çipin teçhizata yerleştirilmesinden sonra kas kasılmasına yanıt olarak konsol sapmasını ölçmek için kullanılan bir lazer ve foto dedektörünü desteklemek için modifiye edilmiş bir elektrofizyoloji mikroskobuna aktarılır.Lazer, konsolun ucuna odaklanacak şekilde konumlandırılır ve foto dedektör de aynı şekilde saptırılmış ışını yakalayacak şekilde hizalanır Elektriksel veya kimyasal işleme yanıt olarak kas kasılmasının neden olduğu konsol sapma derecesini gösteren sonuçlar elde edilir ve tohumlanan hücrelerin kasılma profilinin gerçek zamanlı olarak doğrudan ölçümünü sağlar. Sonuç olarak, konsol yer değiştirmesi, bir kuvvet okuması sağlamak için işlenebilir. Bu sistem, ilaç tedavisi, hastalık, durum veya egzersiz protokollerine yanıt olarak kasılma fonksiyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesi için potansiyel bir yüksek verimli test yatağı sağlamak üzere çoğullanmıştır.Bu tekniğin, yama kelepçe elektrofizyolojisi gibi mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında temel avantajı, fonksiyonel analiz için bu yöntemin non-invaziv olması ve yüksek verimli çalışmalar için kolayca uyarlanabilir olmasıdır. Bu yöntem, klinik değerlendirmeden önce uygun doz yanıt konsantrasyonlarının belirlenmesi gibi ilaç geliştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, farklı patolojik fenotiplerden hücrelerin fonksiyonel performansını gerçek zamanlı olarak araştırmak için araçlar sağladığı için çoklu kas hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, ancak bu yöntem iskelet iskelet kası patolojileri hakkında bilgi sağlayabilir.Kardiyak ve düz kas gibi diğer doku sistemleri için de kullanılabilir Sterilize edilmiş, önceden hazırlanmış konsol cipsleri ve% 70 etanol çözeltisinde 13 F kapak kızakları ve bir akış başlığında havada kurumaya bırakılır. Ardından, 13 F kapak fişinin üzerine tek tek konsol talaşlarını yerleştirin. Standart bir 12 oyuklu plakanın içinde, konsolları kullanılan hücre tipi için optimize edilmiş biyopolimer veya yüzey modifikasyonu ile kaplayın Standart hücre kültürü protokollerine göre, yüzey kaplaması hazırlama yöntemimiz kullanılarak 30 dakika sürer, ancak araştırmacının özel kültür protokolüne bağlı olarak değiştirilebilir.Reese, hücrelerin kendi özel büyüme ortamlarında istenen konsantrasyona getirilmiş, daha sonra yüz mikrolitre hücre süspansiyonu konsol çip yüzeyine yerleştirilmiştir ve ortam kabarcığının konsol pencerelerini tamamen kaplamasını sağlamıştır. Talaşları içeren plakayı bir inkübatöre aktarın ve bu kaplama süresinden sonra hücrelerin en az bir saat yapışmasına izin verin. Çipi 13 F kapak kayması olmadan temiz bir kuyuya aktarmak için steril forseps kullanın ve her birine bir mililitre büyüme ortamı ekleyin.Plakayı inkübatöre geri koyun, hücreleri in vitro bakım için standart protokollerine göre koruyun. Kapak kızaklarında, ısıtılmış bir kültür kabını dik bir elektrofizyoloji mikroskobu sahnesine yerleştirin. Isıtılmış mikroskoba mevcut hücre besleme ortamının üç mililitresini ekleyin.Aşama paslanmaz çelik elektrotları, ısıtılmış kültür kabının iç kısmına 15 milimetrelik bir ayırma mesafesinde monte edin. Bunları, sistemin uygun olduğunda hücrelerin alan stimülasyonunu üretmesine izin vermek için alan stimülasyonu, değişen yoğunlukta, frekansta ve dalga biçiminde darbeler üretebilen bir darbe üretecine bağlayın. XY öteleme aşamalarına monte edilmiş bir helyum neon lazeri mikroskop masasının alt tarafına cıvatalayın.Ardından lazeri, lazer ışını ısıtılmış kültür kabının tabanından konsol düzlemine göre 30 derecelik bir açıyla yönlendirilecek şekilde ayarlayın. Sonraki cıvata, mikroskop aşamasının alt tarafına XY öteleme aşamalarına monte edilmiş bir kadran foto dedektör modülü. Konumunu, yansıyan lazer ışını dört kadranın ortasına inecek şekilde ayarlayın.Metin protokolünde sağlanan akış şemasına atıfta bulunarak konsolları tarayan doğrusal aktüatörleri kontrol etmek için bir yazılım programı yazın. Konsol analiz donanımını ve ilgili yazılımı açın. Isıtılmış aşamayı mrta içine yerleştirin ve 37 santigrat derece okumasını bekleyin.Ardından, konsol çipini, konsollar sahnenin sağ tarafına doğru yönlendirilecek şekilde sahneye yerleştirin. Mikroskop ışık kaynağını açın. Konsolların kenarlarını görünür hale getirmek için mikroskobu odaklayın ve konsolların sahne konsolunun sağına yönlendirildiğini varsayarak, lazer ışınını konsolun ucuna yerleştirmek için lazer foto dedektörü kontrol yazılımını kullanın.Biri, dizinin sol üst köşesinde yer alan ve sayılar 16'ya kadar inen sayıdır. Sol altta. Konsol 17 sağ üst konumdadır ve 32'ye kadar çalışır.Sağ altta, kayıt yazılımında oynat düğmesine basın. Fotoğraf dedektörünü kontrol eden step motorları ayarlayarak fotoğraf dedektörünü hem x hem de y karelerinde sinyal sıfır okuyacak şekilde konumlandırın. Ardından, lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsolu bir konuma ayarlayın.Ardından, lazeri konsolun 16 ucuna hareket ettirin. Fotoğraf dedektörünün konumunu tekrarlayın ve lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsol 16 konumunu ayarlayın. Şimdi lazeri konsol 32'nin ucuna getirin.Fotoğraf dedektörünün konumunu tekrarlayın ve lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsol 32 konumunu ayarlayın. Son olarak, lazeri konsol 17'nin ucuna hareket ettirin. Fotoğraf dedektörünün konumunu tekrarlayın ve lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımında konsol 17 konumunu ayarlayın.Mikroskop ışık kaynağını ve ardından laboratuvardaki tepe ışığını kapatın. Kayıt yazılımında kayıt düğmesine basın. Darbe üreteci donanımını 40 milisaniyeye ve beş voltluk darbelere, bir hertz frekansına ayarlayın.Ardından makineyi açın Lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımını kullanarak, donanımı 32 konsol dizisi boyunca tarama yapacak şekilde ayarlayın. Her birinde beş saniye durmak. 32 konsolun taraması tamamlandığında, stimülatörü kapatın.Ardından kayıt yazılımını durdurun ve veri dosyasını açın. Her konsoldan kaydedilen izi inceleyin. Kasılma aktivitesinin kanıtı için.Bir daralma, bir tepe noktası olarak tanımlanır. Sapma, taban çizgisinin en az 0.1 volt üzerindeyse, olumlu yanıtları olan her bir konsolu not edin. Yanıt vermeyen konsolları lazer fotoğraf dedektörü kontrol yazılımındaki tarama protokolünden çıkarın.Aktif konsollar daha sonra hücre spontan kasılma aktivitesinin bir okumasını elde etmek için stimülasyon olmadan yeniden taranabilir. Daha sonra, kültürlenmiş hücrelerin fonksiyonel çıktısı üzerindeki etkisini gözlemlemek için ortama terapötik bir bileşik ekleyin. Geniş alan elektrik stimülasyonu olan veya olmayan bileşik çalışma taramalarının eklenmesini takiben, hücreleri uzun süreler boyunca elektriksel olarak uyararak yorulma değerlendirmeleri yapın, ardından tepe kuvvetinin belirli bir eşiğin altına düşmesinin ne kadar sürdüğünü ölçmek için kasılma seviyelerini tarayın.Motor nöro nöro mio tüp konsol kokültürlerinin bir nöronal uyarıcı veya sinaptik inhibitör ile tedavisi ve spontan aktivitedeki artış ve azalmaların taranması yoluyla motor nöronların kas ile ko-kültürde tutulduğu deneylerde, konsol sapma verilerini metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analiz etmeye devam edin. Konsollar üzerinde kontraktil hücrelerin başarılı kültürü, standart hücre kültürü tekniklerini kullanan nispeten basit bir prosedürdür. Standart elektrofizyolojik yazılım, ham verileri analiz etmek için kullanılabilir ve tepe kuvveti, tepe kuvvetine kadar geçen süre ve yarı gevşeme süresi gibi ilgili fonksiyonel özelliklerin hesaplanmasını kolaylaştırır.Genişletilmiş stimülasyon protokolleri, kültürlenmiş hücrelerdeki yorgunluk oranlarını değerlendirmek için araçlar sağlar, böylece bu sistemden elde edilebilecek fizyolojik veri seviyesini genişletir. Konsol kültür sistemi, in vitro nöromüsküler sinaps oluşumunun değerlendirilmesine izin vermek için iskelet kası myo tüpleri ile kültür sistemine motor nöronları içerecek şekilde modifiye edilebilir. Bu tür kültürlerde, spontan kasılma aktivitesi oranları, glutamat gibi nöron spesifik bir uyarıcı ile tedaviye yanıt olarak kasılma oranlarıyla karşılaştırılır.Kasılma oranlarında gözlenen herhangi bir glutamat kaynaklı artış, asetilkolin salınımına ve ardından mio tüp aktivasyonuna yol açan kültürlenmiş nöronların aktivasyonunu düşündürmektedir Glutamat ile indüklenen aktivitenin durmasına yol açan asetilkolin reseptör blokeri, dtu rine gibi sinaptik inhibitörlerle tedavi, bu kültürlerde fonksiyonel nöromüsküler sinapsların varlığı için daha fazla kanıt sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş iskelet kasının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için mikro ölçekli silikon konsolların nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Bu videoda, elektrik hücresi-substrat empedans algılama veya ECIS kullanılarak aort düz kas hücresi (SMC) kasılmasının ölçümü açıklanmaktadır. ECIS, hücrelerin hareketini ölçer ve kasılmaları ölçmek için güvenilir bir yöntemdir.

SMC Kasılmasının İn Vitro Olarak Ölçülmesi: Elektrik Hücresi-Substrat Empedans Algılama Kullanarak Düz Kas Hücrelerinin Kasılmasını Değerlendirmek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Canlı hücrelerdeki mekanik zorlanmaya gerçek zamanlı tepkilerin ölçülmesine izin vermek için özel bir motor tahrikli mekanik aktüatör kullanılarak yeni bir görüntüleme protokolü geliştirilmiştir. Mekanobiyoloji ile ilgili olarak, sistem konfokal veya atomik kuvvet mikroskobu ile neredeyse gerçek zamanlı görüntülemeye izin verirken %20'ye kadar suşlar uygulayabilir.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Burada, epitelyal-mezenkimal geçiş geçiren mezenkimal hücrelerde kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesini ve uygulanmasını açıklıyoruz.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Bu yazıda birincil, hastaya özgü insan aort düz kas hücrelerinin ve dermal fibroblastların izolasyonu ve kültürlenmesi için eksplant kültürüne dayalı bir yöntem anlatılmaktadır. Ayrıca, hücre kasılmasını ölçmek ve daha sonra bu hücrelerdeki hastaya özgü farklılıkları incelemek için kullanılabilecek yeni bir yöntem sunulmaktadır.

Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro

Bu çalışma, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler (FLECS) Teknolojisini, floresan protein mikrodesenlerinin görselleştirilmiş yer değiştirmelerine dayanan tek hücreli kontraktil kuvvetlerin basitleştirilmiş, eller kapalı nicelleştirilmesi için mikrowell formatında kullanmak için esnek bir protokol sunmaktadır.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

İskelet kası fonksiyonu, geleneksel olarak zahmetli, düşük verimli yaklaşımlar kullanılarak, izole kas liflerinin kontraktilitesini ölçerek değerlendirilebilir. Burada, hidrojel gömülü kas liflerinin kontraktilitesini ölçmek için optik tabanlı, yüksek verimli bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımın ilaç taraması ve terapötik gelişim için uygulamaları vardır.

Optik tabanlı bir sistem kullanarak hidrojel gömülü bozulmamış fare kas liflerinin yüksek verimli kasılma ölçümleri

Burada, hücrelere izotropik ve tek eksenli dalga formları uygulayan, aynı zamanda ayarlanabilir sertliğe ve özelleştirilebilir protein matrislerine sahip substratlar üzerinde kültürü destekleyen yeni bir cihaz sunuyoruz. Bu basit ve ekonomik platform, araştırmacıların mekanik ipuçlarının hem temel çalışmalarda hem de hastalıkla ilgili bağlamlarda hücresel fonksiyonu nasıl düzenlediğini araştırmalarını sağlar.

In Vitro Hücresel Esneme ve Görüntüleme İçin Yeni Bir Platform

Öğrenin mikro silikon konsollar kullanarak hücresel kasılma fonksiyonunu in vitro ortamda ölçme yöntemini. Bu teknik, kas hücrelerinin elektriksel veya kimyasal uyarıya yanıtını değerlendirmek için invaziv olmayan bir platform sunar.

Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için İn Vitro

Daha fazla video keşfet