Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma
February 17th, 2022
Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.
Bu protokol, istenen şekildeki yüksek doğruluklu protein mikro kalıplarının, özellikle hücre kümelerinin incelenmesi için izole edilmiş desen adalarının tutarlı bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Bu teknik, herhangi bir şekil ve boyuttaki izole ada mikro desenlerini yalnızca bir adımda yapmak için kullanılabilirken, daha önce bu tür desenleri yapmak iki ayrı adım gerektiriyordu. PDMS'yi, üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi doğru kürleme maddesi ile baz oranında karıştırarak başlayın.
Oda sıcaklığında ve basınçta 15 dakika boyunca inkübe edin, ardından karışımı 15 dakika boyunca vakum altında gazdan arındırın. PDMS'yi ana kalıba dökün ve gece boyunca kürlenmek için 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre aktarın. Ana kalıbı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
Ana kalıp soğurken, 25 milimetrelik sonikat kapaklar 10 dakika boyunca etanol içinde kayar. Hazırlanmakta olan pul sayısı kadar kapak fişi kullanın. Kapak kapaklarını DI suyuyla iyice durulayın ve filtrelenmiş bir hava tabancası kullanarak kurulayın.
Plazma temizleyiciyi yüksek vakum altında kullanarak kapakları bir dakika boyunca plazma ile tedavi edin. Kapak kapaklarının odanın içinde hareket etmesini önlemek için işlemden sonra vakumu yavaşça serbest bırakın. Her bir örtüyü, doğrudan güneş ışığından veya tepegöz aydınlatmasından yoksun bir odada 100 mikrolitre floresan etiketli protein çözeltisi ile kaplayın.
Işıktan ekstra koruma için numuneleri örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Her bir kapak kaymasını DI suyu ile iyice durulayın. Her bir kapak kapağının kenarlarını bir kağıt havluya veya benzer bir emici malzemeye hafifçe vurarak fazla suyu yüzeyden çıkarın.
Kapak kapaklarının en az 30 dakika boyunca karanlıkta açıkta bırakarak tamamen kurumasını bekleyin. Protein kaplı kapaklar kururken, PDMS damgasını bir neşter veya keskin bir bıçakla keserek ana kalıptan çıkarın. PDMS damgalarını yüksek vakum altında iki dakika boyunca plazma ile tedavi edin.
Pulları duman başlığının altında kapaklı bir kaba yerleştirin, ardından her pulu% 100 etanol içinde seyreltilmiş ince% 103-APTMS tabakası ile kaplayın. Kabı pullarla örtün ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Her iki taraftaki her damgayı DI suyuyla iyice durulayın.
Pulları temiz bir kaba koyun ve DI suyunda hazırlanan% 2.5 glutaraldehit ile kaplayın. Pulları örtün ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Pulları DI su ile iyice durulayın.
Daha önce tarif edildiği gibi yüzeyden fazla suyu çıkarın ve pulların 30 dakika boyunca ortaya çıkarılmadan kurumasını bekleyin. 30 dakika sonra protein kaplı kapaklar veya pullar tamamen kuru değilse, tamamen kuruması için filtrelenmiş bir hava tabancası kullanın. Pulların desen tarafını, tam temas etmeleri için yeterli basınçla kapak fişlerine itin.
15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Ardından PDMS damgalarını kapak fişlerinden dikkatlice soyun. Uygun filtreye sahip bir floresan mikroskop kullanarak, desenli kapakların doğruluğunu kontrol edin.
Desenli kapak fişlerini hemen kullanın veya daha fazla kullanana kadar doğrudan ışıktan uzak tutun. PAA hidrojel öncüsünü hazırlamadan önce, açılmadan önce oda sıcaklığına ulaşmak için akrilik asit NHS esterini buzdolabından çıkarın. % 70 etanol ile sterilize ederek değiştirilebilir bir kapaklı tabak seti hazırlayın, ardından kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininde UV ışığı altında inkübe edin.
Duman başlığının altında, 15 mililitrelik konik bir tüpe DI suyunda hazırlanan 1.25 mililitre% 40 akrilamid ekleyin. Aynı tüpe DI suyunda hazırlanan 175 mikrolitre bis-akrilamid çözeltisi ekleyin. Daha sonra 500 mikrolitre 10X PBS, ardından 2.915 mililitre DI su ekleyin.
Bu öncülün 969 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipet alın ve geri kalanını iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Taze bir mikrosantrifüj tüpünde 50 ila 100 miligram APS ölçün ve DI suyunda mililitre başına 100 miligrama kadar seyreltin. NHS esterini kaputta açın ve bir mikrosantrifüj tüpünde üç miligrama kadar NHS'yi dikkatlice ölçün.
NHS esterini 1X PBS'de mililitre başına bir miligrama seyreltin. Duman başlığının altında, PAA öncülünün 969 mikrolitrelik aliquot'unu içeren mikrosantrifüj tüpüne iki mikrolitre TEMED ekleyin. Hidrojel çözeltisinin pH'ını azaltmak ve NHS esterinin hidrolizini önlemek için 15 mikrolitre bir molar HCL ekleyin.
Tüpe 10 mikrolitre NHS ester çözeltisi ekleyin. Bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki adımları uygulayın. 30 milimetrelik kapak kaymasını, 3-APTMS ve glutaraldehit ile işlenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde ayarlanmış kapak kapağının orta kısmına dikkatlice yerleştirin ve plastik halkayı üstüne vidalayın.
Bir sonraki adıma hazırlanmak için desenli kapak kapağını minimum ışığa maruz kalacak şekilde ayarlayın. PAA öncü aliquot tüpüne beş mikrolitre APS çözeltisi pipetin, ardından ters çevirin ve karıştırın. Hemen pipetin 35 mikrolitresini bu çözeltinin 30 milimetrelik kapağına yerleştirin.
Desenli kapak kapağını, protein tarafı aşağı bakacak şekilde çözeltinin üzerine yerleştirin. Hidrojelde hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Hidrojeli ışıktan koruyun ve 90 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin.
Hidrojel polimerize olduktan sonra, üst kapak kaymasını çıkarmak için bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın, jelin yüzeyindeki deseni mahvetmekten kaçınmak için kapak kaymasının geri düşmediğinden veya jelden kaymadığından emin olun. Hidrojelde kalan NHS esterini pasifleştirmek için, jele iki mililitre steril PBS ekleyin ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Jelleri derhal deneyler için hazırlayın veya daha fazla kullanana kadar steril PBS'de dört santigrat derecede steril PBS'de gece boyunca saklayın.
Hidrojeller, kümeler içindeki hücresel çekiş kuvvetlerini görselleştirmek ve ölçmek ve önceden belirlenmiş boyut ve şekle sahip ada desenleri oluşturmak için dolaylı olarak floresan fibronektin ile desenlendi. Desen kalitesi, PDMS damgasının döküldüğü ana kalıbın aslına uygunluğu ile doğrudan ilişkiliydi. Bu yöntem, önceden belirlenmiş şekle sahip izole edilmiş, iyi tanımlanmış ada desenleri üretebilir.
Fibronektin adezyon noktaları sadece adanın istenilen bölgesinde mevcuttu. Bu izole yapışma noktaları adaları, küme şeklinin daha iyi kontrol edilmesini sağladı. PDMS pullarının iki küçük 3-APTMS ile kaplanması kritik öneme sahiptir, çünkü çıkarma yönteminin etkinliğini sınırlarken, çok fazla damga yüzeyinde turuncu bir kalıntı yaratacaktır.
Burada oluşturulan desenler, hem bireysel hücrelerde hem de kümelerde hücresel çekiş kuvvetlerini belirlemek için kullanılabilir, bu da mekanik homeostazı sürdürme yetenekleri hakkında fikir verir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, hücresel çekiş kuvvetlerini incelemek için özel olarak tasarlanmış yumuşak hidrojeller üzerinde yüksek sadakatlı protein mikro desenleri oluşturmak için düzenlenmiş bir protokol sunar. Yöntem, hücre kümelerinin şeklini kontrol etmek için önemli olan izole edilmiş ada desenlerinin üretimini basitleştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel mekanik
- Mikrofabrikasyon teknikleri
- Hücre dışı matris etkileşimleri
Arka Plan
- Hücresel çekiş kuvvetlerini anlamak, hücre davranışı çalışmaları için esastır.
- Desen oluşturma için geleneksel yöntemler çoklu adımlar gerektirir ve süreci karmaşıklaştırır.
- Mikrokontakt baskı, hücre biyolojisinde yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
- Fabrikasyon yöntemlerinin iyileştirilmesi, deneysel tutarlılığı artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Protein mikro desenler oluşturmak için tek adımlı bir yöntem geliştirmek.
- Belirli şekillerde hücre kümelerinin çalışmasını kolaylaştırmak.
- Çekiş kuvveti ölçümlerinin güvenilirliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- PDMS'i üretici talimatlarına göre bir kürleme ajanı ile karıştırma.
- Karışımı vakum altında gazdan arındırma.
- Desen oluşturma için PDMS'i ana kalıba dökme.
- Kürleme kalıbını gece boyunca 37 derece Celsius'ta kürleme.
Ana Sonuçlar
- Protokol, tek bir adımda mikro desenlerin oluşturulmasını sağlar.
- İzole edilmiş ada desenleri çeşitli şekil ve boyutlarda üretilebilir.
- Yöntem, hücre kümesi çalışmalarının tutarlılığını artırır.
- Bu teknikle geliştirilmiş çekiş kuvveti ölçümleri elde edilebilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, protein mikro desenler oluşturma sürecini basitleştirir.
- Hücresel mekaniği çalışmak için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
- Tek adımlı fabrikasyon süreci, alanda önemli bir gelişmedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Micropattern traction microscopy enables precise control of cell and cluster geometry, supporting quantitative measurement of cellular traction forces on engineered hydrogels. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cell mechanics, adhesion, and mechanotransduction in disease-relevant systems. The method's reproducibility and pattern fidelity facilitate robust target validation and predictive confidence in preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanobiological hypotheses by controlling cell shape and adhesion geometry.
- Supports functional target validation through quantitative traction force measurement at single-cell and cluster levels.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating the effects of defined extracellular matrix patterns.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible micropatterned substrates for downstream cell-based assays.
- Enables quantitative, high-fidelity readouts of cell-generated forces for compound screening.
- Supports assay scalability and platform reuse by simplifying pattern fabrication to a single step.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro traction force measurements with disease-relevant cellular behaviors.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting consistent mechanobiology assays.
- Reduces translational risk by providing quantitative, reproducible data on cell-matrix interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This micropatterning method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mechanobiology studies, assay development, and translational research on cell mechanics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell adhesion and force generation by controlling microenvironment geometry.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative traction force outputs for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides computational tools for image-based quantification of dot displacement and traction fields.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic studies with preclinical model validation where cell mechanics are implicated.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for repeated use across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mechanobiology-driven target validation and reduces ambiguity in cell-matrix interaction studies.
- Operational Value: Streamlines pattern fabrication, enhances reproducibility, and supports high-throughput assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative mechanistic data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on validated mechanobiological endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, cell culture, and quantitative image analysis.
- Needs access to PDMS molding, plasma treatment, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of pattern design and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptation across cell types and matrix proteins may require protocol optimization.
- Master mold durability limits long-term scalability and may necessitate periodic replacement.
