İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, belirli yapışkan mikro desenler üzerinde elde edilen hücre mimarisi ve konumunun normalizasyonunun, geleneksel cam lam desteklerinde mümkün olmayan, hassas ve sağlam ilaç etkisi kantifikasyonu ile görüntü yakalamanın kolayca otomatikleştirilmesine ve doğrudan görüntü işlemeye nasıl olanak tanıdığını göstermektir. Bu, L şeklinde SI three etiketli mikro desenler taşıyan SI two çiplerine heli hücreleri ekilerek gerçekleştirilir. Hücreler, L'nin iki ucunu kapsayan ana bir stres lifi oluşturarak üçgen şeklini alır. Desenli hücreler daha sonra lebos statin ile inkübe edilir veya işlem görmeden bırakılır, ardından aktin hücre iskeletini ve çekirdekleri görselleştirmek için fikse edilir ve boyanır.

Ardından, mikropattern hücrelerin görüntüleri alınır ve analiz için bir görüntü yığını oluşturmak amacıyla cell ref makrosu ile fenotipleri nicelleştirmek için hypotenuse makrosu kullanılarak işlenir. Nihayetinde, düşük dozda BLEs statinin, standart hücre kültürü koşullarında tespit edilemeyen, mikropattern HELOC hücreler üzerinde anlamlı bir etkisi olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, hoş geldiniz.

Bugün, hücre analizi için yapışkan mikro desenlerin nasıl kullanılacağını açıklayan deneysel protokolümüzü sunmak ve bu yapışkan mikro desenler üzerinde çok düşük dozlardaki ilaçların kolayca nasıl nicelendirildiğini gösteren deneysel verileri paylaşmak için buradayız. Bu mikro desenleri ilk gördüğünüzde, hücre analizi sırasında görüntü yakalamadaki değişkenlik sorunlarını nasıl çözebileceğini hemen anlayacaksınız. Çünkü, bir mikro diziye benzer şekilde hücrelerin düzenli bir dizisine sahip olduğunuzda, görüntüleri adım adım yakalayabilmek için mikroskop tablasını hücreden hücreye kolayca hareket ettirebilirsiniz.

Ancak mikro desenlerin sunduğu tek avantaj elbette bu değildir. Aslında, çapraz veya Y şekli gibi belirli tipik mikro desenlerde, hücre içi mimariyi normalize etmiş oluruz; yani organeller, mitotik iğ, hücre iskeleti ve farklı protein ağlarının tümü hücreden hücreye aynı konumlarda veya aynı yönelimde yer alır, bu da ilaçların bu özel desenler üzerindeki etkilerini öngörmeyi ve nicelleştirmeyi çok daha kolay hale getirir. Bu durum, klasik Petri kabı veya mikroplakada normalde yapılan işlemlerle kıyaslandığında oldukça sezgi dışı görünebilir.

Çünkü elbette hücrelerin hareket ettiğini ve farklı morfolojiler benimsediğini sıkça görürsünüz. Öte yandan, adhezif mikro desenler üzerinde tüm hücreler birbirine benzemeye başlar; çünkü bu adhezif mikro desene yanıt vermekte ve mimarilerini aynı şekilde organize etmektedirler. Bu durum aslında biraz yapay görünebilir, ancak yakından baktığınızda, Petri kabı daha yapay değil midir?

Çünkü dokularda hücreler, hem komşu hücreler hem de hücre dışı matris tarafından kısıtlanırlar. Bu nedenle, hücre mimarisini yönlendiren çok miktarda uzamsal bilgiye maruz kalırlar. Mikro desenlerin sağladığı bu yerinde avantaj, bizim üzerinde çalıştığımız konudur.

Bu uzamsal bilgiyi hücrelere geri kazandırıyoruz ve tüm hücreler buna yanıt vererek aynı şekilde organize oluyor. Artık tüm hücreler birbirine benzediği için, referans hücre kavramını getirebiliriz; yani tüm görüntülerin ortalamasını alarak, hücrenin belirli bir koşulda nasıl göründüğünü gerçekten temsil eden tek bir görüntü elde edebiliriz. Daha sonra bir ilaç ekleyip bu referans hücreye tekrar bakarak, ilaca yanıt olarak hücre morfolojisinin veya organizasyonunun nasıl değiştiğini görebilirsiniz.

Situ two logolarının okunabilir olduğundan emin olarak, iki adet situ two çipini altı kuyucuklu bir plakanın iki bağımsız kuyucuğuna ayrı ayrı yerleştirin. Bu deneyde kullanılan situ two çipleri FibroGen SI three ile boyanmış mikro desenlere sahiptir ve kullanımdan önce karanlıkta tutulmalıdır. Yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaşmış HeLa hücrelerini tripsin ile toplayın ve mikroskop altında hücrelerin düzgün bir şekilde tekil hale geldiğini kontrol edin; hücreleri 300 G'de dört dakika boyunca santrifüjleyin ve nazikçe yeniden süspande edin; hücreleri sayın ve mililitre başına 15.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin.

Eksik D-M-M-E-F 12 kültür ortamında kuyu başına 60.000 hücre dağıtın. Hücrelerin merkezde toplanmasına neden olacak rotasyonel hareketlerin oluşmasını önlemek için plak mümkün olduğunca az hareket ettirilmelidir. Hücrelerin çeper altında 10 dakika boyunca çökelmesini bekleyin, ardından hücreleri inkübatöre taşıyın.

Hücre inkübatöründe 10 ila 20 dakika içinde, hücreler 10 dakika sonra yapışmaya başlayacaktır; hücreler yapıştığında düzenli olarak mikroskop altında kontrol edin. Hücre besiyerini değiştirin ve aşağıdaki prosedürü dört kez tekrarlayarak fazla hücreleri uzaklaştırın. Plakayı düz tutarak, besiyerini kuyucuğun yan tarafından nazikçe aspire edin.

Çipin kurumasını önlemek için yeterli ortamın kaldığından emin olun. Dört mililitre PBS ekleyin ve aspirasyona çipin merkezinden başlayın. Ardından, daha önce yapıldığı gibi PBS'nin büyük kısmını aspire etmek için kuyucuğun kenarına geçin ve mikroskop altında yüzen hücrelerin olup olmadığını kontrol edin.

Eğer çok miktarda yüzen hücre kalırsa, yıkama prosedürünü tekrarlayın. Çok az hücre varsa, PBS'nin bir kısmını aspire edin ve yerine iki mililitre taze besiyeri ekleyip bu işlemi iki kez tekrarlayarak toplamda dört mililitre taze besiyeri ekleyin. Hücrelerin tamamen yayılmasına izin vermek için hücreleri bir hücre inkübatöründe üç saat boyunca inkübe edin.

Bu yöntemle, mikro desenlerin %10 ile %30'u arasında tek bir hücre tarafından doldurulacak, diğer desenler ise ya boş kalacak ya da birden fazla hücre tarafından doldurulacaktır. Hücreleri BLEs statin ile tedavi etmek için, 17 millimolar ilaç stok çözeltisini dört mililitre besiyerinde %0,1 DMSO ile beş micromolar nihai konsantrasyona seyreltin. Kontrol için sadece %0,1 DMSO içeren besiyeri hazırlayın; çipin kurumasını önlemek için hücre besiyerini aspire edin ve hızla BLEs statin veya kontrol çözeltileriyle değiştirin.

Hücreleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında sitoskelet tamponunu hazırlayın. 2 mL cb'ye 1 g sükroz ekleyin.

Bu, hücre içi yapıların korunmasına yardımcı olur. Bir mililitre CB sükroz ile dört mililitre %5 PFA'yı karıştırın. CB sükroz içindeki PFA çözeltisinden iki mililitre ekleyin.

Taze bir altı kuyucuklu plakanın iki kuyucuğuna. Hücreleri fikslemek için, bir penset yardımıyla CY iki çipi alın ve iki mililitre CB sakroz çözeltisinde PFA içeren altı kuyucuklu plakaya yerleştirin. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, PFA'yı uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın, ardından hücreleri iki mililitre 100 milimolar amonyum klorür ile 10 dakika boyunca yıkayın.

Kalıntı PFA çapraz bağlama aktivitesini söndürmek için, hücreleri üç dakika boyunca 0,1% tritton X 100 içeren iki mililitre PBS ekleyerek geçirgen hale getirin, iki kez PBS ile yıkayın; aktin filamentlerini 1,5% BSA içeren PBS içinde 1:2000 oranında iki mililitre ZI konjuge phalloidin ile boyayıp oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından hücreleri iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Sonrasında, çekirdekleri boyayın.

PBS içinde çözünmüş 1 mg/mL konsantrasyonunda iki mililitre hawked ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edin. İki mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Yan iki çipi, al gibi montaj çözeltilerinden 25 ila 30 µL kullanarak standart bir lam üzerine monte edin.

Üç farklı dalga boyunda görüntü elde etmek için Metamorph görüntüleme yazılımı ve NIK icon eclipse T mikroskobu kullanıyoruz. Sistem, CCD Hema Matsu kamera ve intens lite cıva fiber aydınlatıcı ile donatılmıştır. İlk olarak 20 x büyütme seçin.

Menü çubuğunda sıradaki adım olarak, deneyin farklı parametrelerini ayarlamak için çok boyutlu kazanımı (multidimensional acquisition) açın. İlk olarak verilerinizi nereye kaydedeceğinizi belirtin.

Dalga boyu sayısını üç olarak ayarlayın, SI üç dalga boyunu seçin ve lam üzerine kapatma camını, 12 mikro desen kamera alanının merkezine gelecek şekilde konumlandırın. Alan başına görüntülenen mikro desen sayısı, kamera ve objektif kurulumlarına bağlı olarak değişiklik gösterecektir. Her bir dalga boyu için pozlama süresini ayarlayın ve otomatik odaklama yapın.

PS üç için, çok boyutlu veri toplama işlemini yürüten bir günlük oluşturun ve bunu MDA jnl olarak kaydedin. Her biri 12 mikro desen içeren 24 görüntü elde etmek için tarama aşaması fonksiyonunu açın. Yürütülecek günlük ayarlarına altı sütun ve dört satır ile eksi 400 micron x adım boyutu ve 300 micron y adım boyutu girin; MDA jnl günlüğünü yükleyin ve üç dalga boyunda 24 görüntünün otomatik veri toplama işlemini başlatmak için scan düğmesine basın.

Bu videoda, hücrenin tutunmamış kısmını destekleyen tek bir ana aktin stres lifinin oluşumunu tetiklemek ve BLE'lerin statinin hücreler üzerindeki etkisini, düz fibronectin üzerine oturtulmuş hücrelerle karşılaştırarak görselleştirmeyi ve ölçmeyi kolaylaştırmak için L mikro desenler kullanılmıştır. Otomatik görüntü işleme ve analizi için, açık kaynaklı ImageJ programı için yazılmış iki özel makro açıklanmaktadır; ham görüntülerden oluşan bir yığından, ilk makro tekil hücreleri ayıklar ve bir referans hücre oluşturur. İkinci makro ise hücre membranının çökmesini ölçer.

İlk adım, ham görüntülerden tekil hücrelerin segmentasyonudur. Floresanla işaretlenmiş mikro desen görüntüleri, mikro desenler merkezli bölgeleri belirlemek için kullanılır; bu bölgeler her dalga boyundaki görüntülerden kırpılır ve her dalga boyu için yığınlar halinde yeniden birleştirilir. Tek hücreli mikro desenleri seçmek için, makro görüntü başına çekirdek sayısını tespit eder ve tüm yığınlarda birden fazla çekirdek içeren veya hiç çekirdek içermeyenleri eler.

Son olarak, toplanan tüm görüntülerin ve tüm kanalların mikrodesen konumuna göre yeniden hizalanması için ImageJ eklentisi multi-stack reg kullanılır. Bu adım, tek hücre analizi yapmak veya bir referans hücre oluşturmak için kullanılabilecek, bireysel görüntülerden oluşan bir çizgi yığını (line stack) oluşturur. ImageJ'de referans hücre, bir yığındaki filtrelenmiş ve hizalanmış görüntülerin projeksiyonu alınarak oluşturulur.

Çeşitli projeksiyon yöntemleri uygulanabilir, ancak genellikle görüntü yığınının aykırı değerlerini ortadan kaldırmak için medyan projeksiyonu seçilir. Referans hücre, yalnızca mikrodesenli hücrelerle elde edilen, temsil ve görüntü analizi için benzersiz ve kullanışlı bir araçtır. İncelenmesini kolaylaştırmak için, tek renkli görüntüyü kodlanmış bir frekans haritasına dönüştürmek üzere bir bakma tablosu veya LUT uygulanır.

BLE'lerin statin etkisini karakterize etmek için hücrenin sertliği ve çökmesi ikinci bir Image J makrosu kullanılarak analiz edilmiştir. Kısaca, L mikro desenin eşik değerle belirlenmiş görüntüleri, hücrenin üçgen şeklinin teorik hipotenüsünü tanımlamak için kullanılır. Ardından, hücre şeklini tanımlamak amacıyla aktin boyama görüntülerinin eşik değerle belirlenmesi işlemi gerçekleştirilir.

Ardından, teorik hipotenüs ile gerçek konkav hücre membranı arasındaki alan farkı ölçülür; teorik hipotenüsün altında kalan bir alana sahip hücreler çökmüş olarak kabul edilir. Beş mikromolar BLEs statinin etkisi, işlem görmüş ve kontrol koşullarındaki çökmüş hücre sayıları karşılaştırılarak karakterize edilmiştir. BLEs statin ile işlem görmüş veya işlem görmemiş L mikropatern hücrelerinin tipik görüntüleri gösterilmektedir; hücreler mikropaternler üzerinde fikse edilmiş ve boyanmıştır.

Aktin ve çekirdekler sırasıyla kırmızı, yeşil ve mavi renklerde gösterilmiştir. BLEs statinin hücre şekli üzerindeki etkisini kontrol koşullarıyla karşılaştırınız. Düz fibronektin üzerinde BLEs statin veya kontrollerle inkübasyon sonrası tipik hücreler burada gösterilmektedir.

Hücreler fikse edilmiş ve boyanmıştır; aktin ve çekirdekler sırasıyla yeşil ve mavi renktedir. İşlem görmüş ve kontrol koşulları arasındaki benzerliğe dikkat edin. BLEs statin ile işlem görmüş veya işlem görmemiş referans hücrelerden elde edilen tipik görüntüler gösterilmiştir.

Bu yaklaşımın, incelenen fenotipin kolayca gözlemlenmesi için olan potansiyelini not edin. Burada, makro hipotenüs kullanılarak BLEs statinin hücreler üzerindeki etkilerinin analizine dair bir örnek verilmiştir. Kontrol hücrelerinin %25'i çökmüşken, beş mikromolar BLEs statin ile tedavi edilen hücrelerde bu oran üç kat artarak %75'e çıkmıştır; bu durum, zayıflamış aktinin kontraktil ağını yansıtmaktadır.

Bunu izledikten sonra, yapışkan mikro desenlerin yüksek içerikli analizlerdeki birçok darboğazı nasıl çözdüğüne dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İlk olarak, yapışkan mikro desenlerin kullanımı, görüntü yakalama işlem analizini çok daha basit hale getirmiştir. İkinci olarak, mikro desenler, hücrelerin morfolojilerini ve davranışlarını normalize ederek hücreden hücreye değişkenliği azalttığı için, ilaçların çok düşük dozlardaki çok hafif etkilerinin tespit edilmesine olanak tanır.

Ve son olarak, hücre analizinde genellikle iyi bir sonuç almak için gerekli olan binlerce hücreye kıyasla, referans hücremizi kullanarak sağlam ve anlamlı bir sonuç elde etmek için yalnızca birkaç on hücreye ihtiyaç duyarsınız.