İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, hücre mimarisinin ve konumunun belirli yapışkan mikro desenler üzerinde elde edilmesinin, geleneksel cam kaplama kayma desteklerinde elde edilemeyen ilaç etkilerinin hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi ile görüntü elde etmenin kolay otomasyonuna ve basit görüntü işlemeye nasıl izin verdiğini göstermektir. Bu, heli hücrelerinin SI üzerine, L şeklinde SI üç etiketli mikro desen taşıyan iki çip üzerine tohumlanarak elde edilir. Hücreler, L'nin iki ucunu kapsayan büyük bir stres lifi oluşturan üçgen şekli benimser.Model hücreleri daha sonra lebos statin ile inkübe edilir veya tedavi edilmeden bırakılır, daha sonra akton hücre iskeletini ve çekirdeğini görselleştirmek için sabitlenir ve boyanır.

Mikro model hücrelerinin görüntüleri daha sonra analiz için bir görüntü yığını oluşturmak üzere hücre ref makrosu ve fenotipleri ölçmek için hipotenüs makrosu kullanılarak elde edilir ve işlenir. Sonuç olarak, düşük dozlarda BLE'lerin statininin, standart hücre kültürü koşullarında tespit edilemeyen mikro model HELOC hücreleri üzerinde önemli bir etkisini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, hoş geldiniz.

Bugün, hücre analizi için yapışkan mikro desenlerin nasıl kullanılacağını açıklayan deneysel protokolümüzde size yol göstermenin yanı sıra, bu yapışkan mikro desenler üzerinde çok düşük dozlarda ilaçların kolay miktar tayinini gösteren deneysel verileri göstermek için buradayız. Dolayısıyla, bu mikro kalıpları ilk gördüğünüzde, hücre analizi sırasında görüntü yakalamadaki değişkenlik sorunlarını nasıl çözebileceğini hemen anlayacaksınız. Çünkü bir mikro dizi gibi gerçekten bir hücre dizisine sahip olarak, görüntüleri adım adım yakalayabilmek için mikroskop aşamasını hücreden hücreye kolayca hareket ettirebilirsiniz.

Ancak sunduğu mikro desenlerin tek avantajı elbette bu değil. Çok daha fazla gelişme sunuyor çünkü aslında, crossbo veya Y gibi bazı tipik mikro modellerde, aslında iç hücre mimarisini normalleştiriyoruz, yani organeller, mitotik iğ, hücre iskeleti ve farklı protein ağlarının hepsi hücreden hücreye aynı konumlarda veya hücreden hücreye aynı yönelimde, Bu, ilaçların bu belirli modeller üzerindeki etkilerini tahmin etmeyi ve ölçmeyi çok daha kolay hale getirir. Şimdi bu, normalde klasik Petri kabında veya mikroplakada yapılanlardan oldukça mantıksız görünebilir.

Tabii ki, sık sık hücrelerin hareket ettiğini ve farklı morfolojileri benimsediğini görürsünüz. Yapışkan mikro desenlerde ise, tüm hücreler birbirine benzemeye başlayacak çünkü bu yapışkan mikro desene tepki veriyorlar ve mimarilerini aynı şekilde düzenliyorlar. Bu aslında biraz yapay görünebilir, ancak yakından baktığınızda, Petri kabı daha da yapay değil mi?

Çünkü dokularda hücreler, komşu hücreler tarafından olduğu kadar hücre dışı matriks tarafından da kısıtlanır. O kadar çok fazla uzamsal bilgi alıyorlar ki, bu da hücre mimarisini yönlendiriyor. Ve bu, mikro desenlerin reklamını yerinde yapmak için yaptığımız şeydir.

Bu mekansal bilgiyi hücrelere geri yüklüyoruz ve tüm hücreler buna yanıt veriyor ve aynı şekilde organize oluyor. Ve şimdi hücrelerin hepsi birbirine benzediği için, referans hücre kavramını tanıtabiliriz, yani tüm görüntülerin ortalamasını alabilir ve tek bir görüntü elde edebiliriz, bu da hücrenin belirli bir durumda nasıl göründüğünü gerçekten temsil eder. Daha sonra bir ilaç ekleyebilir ve bu referans hücreye tekrar bakabilir ve bu ilaca yanıt olarak hücrenin morfolojisini veya organizasyonunu nasıl değiştirdiğini görebilirsiniz.

İki situ iki çipi ayrı ayrı altı kuyulu bir plakanın iki bağımsız kuyusuna yerleştirin ve situ two logosunun okunabilir olduğundan emin olun. Bu deney için kullanılan situ two çipleri, FibroGen SI üç ile boyanmış mikro desenlere sahiptir ve kullanımdan önce karanlıkta tutulmalıdır. Tripsin ile yaklaşık% 80 oranında birleşen hela hücrelerini toplayın ve mikroskop altında uygun şekilde bireyselleştirilip bireyselleştirilmediklerini kontrol edin, dört dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin ve hücreleri tekrar askıya alın, hücreleri nazikçe sayın ve mililitre başına 15.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin.

Eksik D-M-E-M-F 12 kültür ortamında, oyuk başına 60.000 hücre dağıtın. Ortamda, hücreleri merkezde yoğunlaştırma eğiliminde olacak dönme hareketlerinin ortaya çıkmasını önlemek için plaka mümkün olduğunca az hareket ettirilmelidir. Hücrelerin kaputun altında 10 dakika boyunca çökelmesine izin verin, ardından onları hücre inkübatörüne taşıyın.

Hücre inkübatöründe 10 ila 20 dakika içinde, hücreler 10 dakika sonra yapışmaya başlayacaktır, hücreler bağlandığında mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. Hücre ortamını değiştirin ve aşağıdaki prosedürü dört kez tekrarlayarak hücre fazlalığını giderin. Plakayı düz tutarak, ortamı kuyunun yanından nazikçe aspire edin.

Çipin kurumasını önlemek için yeterli ortam bulundurmaya dikkat edin. Dört mililitre PBS ekleyin ve çipin ortasından başlayarak aspire edin. Daha sonra, PBS'nin çoğunu daha önce olduğu gibi aspire etmek için kuyunun yanına hareket ederek, mikroskop altında yüzen hücreler olup olmadığını kontrol edin.

Çok miktarda yüzen hücre kalırsa, yıkama işlemini tekrarlayın. Çok az hücre varsa, PBS'nin bir kısmını aspire edin ve iki mililitre taze ortam aspirat ile değiştirin ve iki kez dört mililitre taze ortam ekleyin. Hücrelerin tamamen yayılmasını sağlamak için hücreleri bir hücre inkübatöründe üç saat boyunca inkübe edin.

Bu yöntemi kullanarak, mikro desenlerin %10 ila %30'u tek bir hücre tarafından işgal edilirken, diğer desenler ya boş olacak ya da birden çok hücre tarafından işgal edilecektir. Hücreleri BLE'ler statin ile tedavi etmek için, 17 milimolar ilaç stoğu çözeltisini dört mililitre ortamda% 0.1 DMSO ile beş mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin. Kontrol için, ortamı %0.1 DMSO ile hazırlayın, yalnızca hücre ortamını aspire edin ve çipin kurumasını önlemek için BLE'ler, statin veya kontrol solüsyonları ile hızlı bir şekilde değiştirin.

Hücreleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, hücre iskeleti tamponunu hazırlayın. İki mililitre cb'ye bir gram sükroz ekleyin.

Bu, iç hücre yapılarının korunmasına yardımcı olur. Bir mililitre CB sakarozunu dört mililitre% 5 PFA ile karıştırın. CB sükroz çözeltisine iki mililitre PFA ekleyin.

Taze altı kuyulu bir plakanın iki kuyusunda. Hücreleri sabitlemek için, CY iki çipini almak için forseps kullanın ve CB sükroz çözeltisinde iki mililitre PFA içeren altı oyuklu plakaya yerleştirin. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, PFA'yı çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın, ardından hücreleri iki mililitre 100 milimolar amonyum klorür ile 10 dakika boyunca yıkayın.

Kalıntı PFA çapraz bağlama aktivitesini söndürmek için, üç dakika boyunca% 0.1 tritton X 100 içeren iki mililitre PBS ekleyerek hücrelere geçirgenebilir, iki mililitre ZI konjuge baylık ile iki mililitre ZI konjuge baylık ile iki kez yıkandı PBS'de% 1.5 BSA inkübe edildi oda sıcaklığında bir saat inkübe edildi. Sonra hücreleri bir kez iki mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, çekirdekleri sürdürün.

PBS'de satılan mililitre başına bir miligramdan iki mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. İki mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Yan taraftaki iki yongayı, al gibi 25 ila 30 mikrolitre montaj solüsyonu kullanarak standart bir kızağa monte edin.

Üç dalga boyunda görüntü elde etmek için Metamorph görüntüleme yazılımı ve bir NIK icon Eclipse T mikroskobu kullanıyoruz. CCD Hema Matsu kamera ve intens lite cıva fiber aydınlatıcı ile donatılmıştır. Önce 20 x büyütmeyi seçin.

Sonraki menü çubuğunda çok boyutlu alım'ı açın. Deneyin farklı parametrelerini ayarlamak için. Öncelikle verilerinizi nereye kaydedeceğinizi belirtin.

Dalga boyu sayısını üçe ayarlayın, SI üç dalga boyunu seçin ve kapak kayma sürgüsünü, kamera alanında 12 mikro desen ortalanacak şekilde konumlandırın. Alan başına görselleştirilen mikro desenlerin sayısı, kameraya ve objektif kurulumlarına bağlı olarak değişecektir. Her dalga boyu ve otomatik odaklama için pozlama süresini ayarlayın.

PS üç için, çok boyutlu alım çalıştıran bir günlük oluşturun ve bunu MDA jnl olarak kaydedin. Her biri 12 mikro desen içeren 24 görüntü elde etmek için tarama aşaması işlevini açın. Yürütmek için set günlüğüne eksi 400 mikron x adım boyutuna ve 300 mikron y adım boyutuna sahip altı sütun ve dört satır girin, üç dalga boyunda 24 görüntünün otomatik olarak alınmasını başlatmak için MDA jnl press scan günlüğünü yükleyin.

Bu videoda, L mikro desenleri, hücrenin bağlanmamış kısmını destekleyen tek bir ana aktin stres lifinin oluşumunu tetiklemek ve düz fibronektin üzerine oturan hücrelere kıyasla BLE'lerin statininin hücreler üzerindeki etkisinin görselleştirilmesini ve ölçülmesini basitleştirmek için kullanılır. Otomatik görüntü işleme ve analizi için, bir ham görüntü yığınından açık kaynaklı program görüntüsü J için yazılmış iki özel yapım makroyu ana hatlarıyla belirtiriz, ilk makro tek tek hücreleri çıkarır ve bir referans hücresi oluşturur. İkinci makro, hücre zarının çöküşünü ölçer.

İlk adım, ham görüntülerden tek tek hücrelerin segmentasyonudur. Floresan etiketli mikro desen görüntüleri, her dalga boyu için görüntülerde kırpılan ve her dalga boyu için yığınlar halinde yeniden birleştirilen mikro desenler üzerinde ortalanan bölgeleri delmek için kullanılır. Tek hücreli mikro desenleri seçmek için, makro görüntü başına çekirdek sayısını algılar ve birden fazla çekirdek içeren veya hiç çekirdek içermeyenleri tüm yığınlarda ortadan kaldırır.

Son olarak, image J eklentisi çoklu yığın kaydı, toplanan tüm görüntüleri ve tüm kanalları mikro desen konumuna göre yeniden hizalamak için kullanılır. Bu adım, artık tek hücre analizi için veya bir başvuru hücresi oluşturmak için kullanılabilecek tek tek görüntülerden oluşan bir satır yığını oluşturur. Görüntü J'de, referans hücresi, bir yığından filtrelenmiş ve hizalanmış görüntülerin bir projeksiyonu yapılarak oluşturulur.

Birkaç projeksiyon yöntemi uygulanabilir, ancak görüntü yığınının aykırı değerlerini ortadan kaldırmak için genellikle bir medyan projeksiyon seçilir. Referans hücresi, yalnızca mikro model hücrelerle elde edilen temsil ve görüntü analizi için benzersiz ve kullanışlı bir araçtır. İncelemesini kolaylaştırmak için, tek renkli görüntüyü kodlanmış bir frekans haritasına dönüştürmek için bir arama tablosu veya LUT uygulanır.

BLE'lerin statin etkisini karakterize etmek için, hücrenin sertliği ve çökmesi ikinci bir görüntü J makrosu kullanılarak analiz edildi. Kısaca, L mikro modelinin eşik görüntüleri, hücre üçgeni şeklinin teorik bir hipotenüsünü tanımlamak için kullanılır. Hücre şeklini tanımlamak için akton boyama görüntülerinin bir sonraki eşiklemesi gerçekleştirilir.

Teorik hipotenüs ile gerçek içbükey hücre zarı arasındaki alan farkı daha sonra ölçülür, teorik hipotenüsün altında bir alan sunan hücrelerin çöktüğü kabul edilir. Beş mikromolar BLE'nin statinin etkisi, tedavi ve kontrol koşullarında çökmüş hücrelerin sayısının karşılaştırılmasıyla karakterize edildi. BLE'ler, statin ile tedavi edilen veya tedavi edilmeden bırakılan L mikromodel hücrelerinin tipik görüntüleri, hücrelerin sabit ve boyanmış mikro desenler olduğunu göstermektedir.

Aktin ve çekirdekler sırasıyla kırmızı, yeşil ve mavi olarak gösterilir. Kontrol koşullarına kıyasla BLE'lerin statininin hücre şekli üzerindeki etkisine dikkat edin. BLE'ler, statin veya düz fibronektin üzerindeki kontroller ile inkübasyondan sonra temsili hücreler burada gösterilmiştir.

Hücreler sabitlendi ve boyandı, aktin ve çekirdekler sırasıyla yeşil ve mavi renktedir. Tedavi edilen ve kontrol edilen koşullar arasındaki benzerliğe dikkat edin. BLE'ler, statin ile tedavi edilen veya tedavi edilmeden bırakılan hücrelerden elde edilen referans hücrelerin tipik görüntüleri gösterilmektedir.

İncelenen fenotipin kolay gözlemlenmesi için bu yaklaşımın potansiyeline dikkat edin. Burada, BLE'lerin statininin makro hipotenüs kullanılarak hücreler üzerindeki etkilerinin analizine bir örnek verilmiştir. Kontrol hücrelerinin %25'i çökerken, bu, zayıflamış aktinin kasılma ağını yansıtan beş mikromolar BLE'nin statin ile tedavi edilen hücrelerinde üç kat artarak %75 arttı.

Bunu izledikten sonra, yapışkan mikro desenlerin yüksek içerik analizinde birkaç darboğazı nasıl çözdüğünü artık iyi anlamış olmalısınız. İlk olarak, yapışkan mikro desenlerin kullanılması, görüntü yakalama işleme analizini çok daha basit hale getirdi. İkincisi, mikro desenler, ilaçların çok düşük dozlarda çok ince etkilerinin tespit edilmesine izin verir, çünkü morfolojilerini ve davranışlarını normalleştirerek hücreden hücreye değişkenliği azaltırsınız.

Ve son olarak, hücre analizinde iyi bir sonuç elde etmek için genellikle gerekli olan binlerce hücreyle karşılaştırıldığında, referans hücremizi kullanarak sağlam ve anlamlı bir sonuç elde etmek için yalnızca birkaç on hücreye ihtiyacınız vardır.