Name: İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Öğrenin, yapışkan mikrodesenler kullanarak Hela hücrelerinde ilaç etkilerini nasıl hassas ve sağlam bir şekilde nicelendirebilirsiniz. Bu yöntem, görüntü analizinde otomasyonu kolaylaştırır ve hücreden hücreye değişkenliği azaltarak düşük dozlarda bile belirgin sonuçlar elde etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Micropatterns Hücre Hazırlama ve Yayımlama <ol><li> Place 6 plaka 2 bağımsız kuyularda 2 CYTOOchips CYTOOchip sağ alt köşesinde "CYTOO" okumanızı sağlamak. Micropatterns Cy3 veya Cy5 boyalar ile floresan etiketli olabilir. Bu deney için kullanılan CYTOOChips Cy3 floresan etiketli micropatterns var. DİKKAT: karanlıkta fiş tutun. </li><li> Trypsinization HeLa hücreleri (~% 80 konfluent) toplayın. Mikroskop altında hücrelerin düzgün tripsin tedavisi ile dağınık olduğunu kontrol edin. 4 dakika için 300g hücre toplayın ve santrifüj, sonra yavaşça hücre pelletini tekrar süspansiyon. Hücre sayımı 15.000 hücre / mL tamamlanmış DMEM/F12 kültür ortamı bir konsantrasyon sulandırmak. </li><li> Iyi bir CYTOOchip içeren her birine 4 ml (60.000 hücreleri) koyun. DİKKAT: plaka, bu merkezindeki hücrelerin konsantre eğiliminde olacaktır ortamda herhangi bir rotasyon hareketlerinin inducing önlemek için mümkün olduğunca az hareket ettirilmelidir. </li><li> Başlık altında 10 dakika hücreleri tortu sonra hücre inkübatör hareket edelim. 10-20 dakika sonra, hücreler micropatterns uymak başlayacaktır. 10 dakika sonra, mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. </li><li> Hücreleri bağlı olarak, hücre orta değiştirmek ve aşağıdaki yordamı kullanarak lamel yüzeyinden nazikçe yıkayın: </li><li> Plaka düz tutarak, yavaşça kuyunun yanından bir pipet ile orta aspirat. DİKKAT: çip kuru çıkış izin vermeyin, bu tüm sıvı aspire ama her zaman CYTOOchip karşılamak için yeterli asla terk anlamına gelir. </li><li> 4 mL PBS ekleyin ve sonra kuyu tarafına hareket çip merkezinde başlayan tekrar aspire. Çip havaya maruz kalmadan açıklandığı gibi PBS aspire. 3-4 kez tekrarlayın. </li><li> Yüzen hücrelerin mikroskop altında kontrol edin: <ul><li> Kayan hücreleri çok sayıda kalırsa, yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Çok az sayıda hücre görürseniz, PBS parçası kapalı aspirat ve 2 ml taze orta ile değiştirin. Aspire edin ve iki kez 4 ml taze orta eklemek. </li></ul></li><li> 37 ° C 'de üç saatlik bir en az% 5 CO 2 ile hücrelerin yayılmasını tam elde etmek için izin verecek bir doku kültürü inkübatörde plaka yerleştirin. NOT: micropatterns tek bir veya birden fazla hücreleri tarafından işgal edilecektir% 10-30 (2000-6500) arasındaki bu yöntemi kullanarak. DİKKAT: hücreleri yıkama ve her hücre hattı micropatterns üzerinde hücrelerin yayılmasını özgü olacaktır tam için gerekli süre önce uyması için gereken zaman. </li></ol> 2. Blebbistatin Tedavi <ol><li> 17 mM stok solüsyonu elde etmek için% 100 DMSO blebbistatin eritin. % 100 DMSO ile 5 mM daha fazla stok solüsyonu sulandırınız. % 0.1 DMSO 5 mcM blebbistatin nihai bir konsantrasyon elde etmek için kültür ortamında nihai bir seyreltme olun. </li><li> Kontrol koşulları için 4 ml, sadece% 0.1 DMSO içeren orta hazırlar. </li><li> Hücreleri üzerinde medya aspire, tedavi ve kontrol koşulları için hazırlanan 4 mL orta ile değiştirin. </li><li> 1hr inkübe hücreleri 37 ° C </li></ol> 3. Hücre Sabitleme ve Aktin boyanması <ol><li> Çözelti hazırlama hücre sabitleme için Lütfen sitoskeleton tampon (CB) ve% 5 PFA hazırlanması için reaktif bölümüne bakın. CB özellikle aktin filamentler ve mikrotübüller floresan etiketlenmesi için tavsiye edilir. <ul><li> 1xCB-sakaroz hazırlayın: CB 2 mL 1 g sukroz eklemek. Sakaroz İçerme iç hücre yapılarının korunmasına yardımcı olur. </li><li> PFA-CB-sakaroz% 4 hazırlayın: 4 ml sıcak PFA% 5 1xCB sakkaroz 1 ml ekleyin. DİKKAT: Bu çözüm, 4 ° C sadece bir kaç gün saklanabilir. </li></ul></li><li> PFA fiksasyon <ul><li> (Yıkama hariç), 2 mL% 4 PFA-CB-sakaroz çözeltisini içeren bir 6-iyi plaka iyi CYTOO logosu ve yerde bu CYTOOchip almak için forseps </li><li> RT 10 dakika inkübe </li><li> PFA-CB-sakaroz çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın </li><li> Için 10 dakika süreyle 100 mM NH 4 Cl 2 mL artık PFA crosslinking faaliyet gidermek için ikinci bir yıkama yapın NOT: PFA sabit slaytlar, birkaç gün 4 ° C floresan görüntüleme için organel boyama önce PBS saklanabilir . </li></ul></li><li> Triton X-100 ile hücre zarı, Permeabilization Deterjan ile hücre Permeabilization antikorlar veya diğer problar hücre zarı nüfuz etmesini sağlar ve hücre iskeleti proteinleri sitozolik havuzu, aksi halde zor yerelleştirme analiz yapma sitoskeletal polimerlerin kontrast azaltabilir bazı ortadan kaldırır. <ul><li> NH 4 Cl çıkarın ve / 2 ml eklemek iyi RT az 3 dakika% 0.1 Triton X-100-CB </li><li> 2 ml PBS ile iki kez yıkayın. </li></ul></li><li> Aktin boyama Floresan-Phalloidin sadece yerli aktin bağlar aktin filamen leke kullanılırts. <ul><li> % 1,5 BSA ile 2 mL PBS içinde 1:2000 sulandırılmış FITC-konjuge Phalloidin </li><li> 1 saat oda sıcaklığında inkübe </li><li> 2 ml PBS ile bir kez yıkayın. </li></ul></li><li> Çekirdekler boyama <ul><li> 2 mL Hoechst ekle (PBS 1μg / ml ile leke) </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika inkübe </li><li> 2 mL PBS ile 2 kez yıkayın </li></ul></li><li> Slayt montajı <ul><li> 25-30 Mowiol mcL veya başka herhangi bir montaj çözümü kullanarak standart bir mikroskop lamı üzerine CYTOO logosu ve montaj CYTOOchip CYTOOchips Pick up. </li></ul></li></ol> 4. Mikroskop Kurulum ve Otomatik Image Acquisition Çok sayıda görüntüleme yazılım paketleri kontrol eden hızlı otomatik görüntü elde etme ve görüntüleme için mikroskop var. Bu örnek Metamorph görüntüleme yazılımları ve otomatik satın almalar, bir CCD Hamamatsu kamera ve bir Intensilight cıva fiber aydınlatma ile donatılmış bir Nikon Eclipse Ti mikroskop yapılmaktadır kullanır. Görüntüler DAPI (çekirdekleri), Cy-3 (micropatterns) ve FITC-Phalloidin (aktin) karşılık gelen üç dalga boylarında da 20x büyütme elde edilir. Alan başına görüntülendi micropatterns sayısı kamera ve objektif kurulumları bağlı olarak değişecektir. CYTOO micropatterns satın alma büyük ölçüde kolaylaştıran çip üzerinde (100 veya 130 mikron) birbirlerine belirli aralıklarla konumlandırılmış. <ol><li> 20x büyütme seçin </li><li> Açık çok boyutlu Acquisition (Menü çubuğu: Apps / Çok Boyutlu Toplama) ve deney farklı parametrelerini ayarlamak: <ul><li> Dalga boyu sayısı: 3 </li><li> Dalga boyu türleri: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Ilk hücre bir alanda odaklanarak her dalga boyu için maruz kalma süresi ayarlayın </li><li> Otofokus, her dalga boyu yapılabilir </li><li> Verileri kaydetmek için yeri seçin </li></ul></li><li> 12 micropatterns görüntülenebilmekte ve kamera alanı (4 sütun ve 3 satır desen) merkezli böylece Cy3 dalga boyu ve konumu kamera seçin. </li><li> Çok boyutlu Toplama çalışan bir dergi oluşturun. Şekil 1'de bir dergi oluşturmak için prosedür açıklanmıştır. </li><li> Açık Tarama aşamasında fonksiyonu (Menü çubuğu: Cihazlar / Sahne / Tarama Sahne). 20x büyütme 24 görüntüleri içeren 12 micropatterns kazanmak için, -400 mikron X adım büyüklüğü ve 300 mikron Y adım boyutu ile 6 sütun ve 4 satır girin. Execute Set Journal dergisinde MDA.JNL yükleyin. Sonra üç dalga boylarında bütün blok otomatik satın alma başlatmak için Scan tuşuna basın. NOT: adım boyutları burada gösterilen X ve Y bir kamera alanında mevcut micropatterns sayısına göre değişir. Doğru yönde hareket için negatif değerler gerekebilir dönemine göre X ve / veya Y, yönünü yukarı ayarlayın. </li></ol> 5. Otomatik Görüntü İşleme ve Analizi Birçok görüntü işleme ve analiz yazılım paketleri mevcut. Işlemler aşağıda anahat görüntü işleme ve açık kaynak programı ImageJ için yazılmış 2 ısmarlama makrolar tarafından gerçekleştirilen analiz adımları nitelendirdi. Ilk makro CellRef Referans Hücre, hücre zarının ikinci hipotenüs önlemler katılık / çöküşü oluşturur. Her ikisi de üzerinde <a href="http://www.cytoo.com">olumsuz</a> etki www.cytoo.com. <ol><li> Micropatterns (makro CellRef) merkezli üç kanal için görüntü yığınlar oluşturun. Micropatterns kullanımı büyük ölçüde tek tek hücrelerin segmentasyon ve lokalizasyon otomatik görüntü işleme ilk adım basitleştirerek, hücre kümeleme ve topaklanma önler. Floresan etiketli micropattern görüntüleri micropatterns merkezli bölgeleri tanımlamak ve sınırlandırmak için kullanılır. Bu bölgeler daha sonra diğer kanallarda elde edilen görüntüler üzerine aktarılması ve kırpılır. Sorumlu kırpılmış görüntüler daha sonra her bir dalga boyu için yığınlarının içine monte edilir. RGB Deste, aynı zamanda üç kanal (Şekil 2) birleştirme oluşturulur. </li><li> Tek bir hücre seçimi filtre uygulayın (makro CellRef) Yukarıda da belirtildiği gibi, kalan micropatterns boş iken,% 10-30 micropatterns (2.000-6.500), tek bir hücre ya da birden fazla hücreyi tarafından işgal edilmiştir. Sadece tek bir hücre tarafından işgal micropatterns gösteren görüntüleri seçmek için, makro görüntü başına çekirdeklerin sayısını algılar ve bütün yığınları (RGB ve farklı dalga boylarında) bu içeren birden fazla çekirdeği ya da hiç çekirdekleri (Şekil 3) ortadan kaldırır. </li><li> Normalize olmayan ve tamamen hücre alanı cut-off kullanarak filtre (makro CellRef) micropattern yayılmış değildir hücreleri ortadan kaldırmak Hücrelerin çekirdekleri filtre kaçtı, aktin FITC kanal kullanarak başka bir filtre bölünmesi kaldırmak için uygulanır. Hücre alanı hesaplanır ve tüm yığınlarının altında kalanlar belli bir kesim kapalı (interfaz hücre alanında daha az yaklaşık 2 kat hücre alanları) çıkarılır. Hücre zarfı alan desen boyutuna göre belirlenir. </li><li> Hücre görüntüler hizalayın (makro CellRef) Önceki adımları, görüntüler tek micropat içerenterned hücreleri seçildi. Bu görüntüler micropatterns merkezli olsa da, hepsi birbirine mükemmel uyumlu asla. Görüntü işleme Sonuç olarak, bir ImageJ eklentisi (MultiStackReg) micropattern pozisyonuna göre tüm toplanan görüntüleri ve tüm kanalları realign uygulanır. Bu adım, şimdi tek bir hücre analizi Referans Hücre veya oluşturma (Şekil 4) için kullanılabilir bireysel görüntüleri uyumlu yığınlar oluşturur </li><li> Referans Hücre Bina (makro CellRef) Micropatterns üzerinde büyüyen hücreler, tüm hücrelerin benzer şekillerde olması anlamına gelir. Bu normalleşme, birçok hücre görüntüleri kesin bir uyum ve bindirme izin verir. Tüm yığını üzerinden her bir görüntü sinyali Özetle, bir "ortalama bir ilaç etkisi" görselleştirmek ve ölçmek için sağlar. Son genel görüntü veya Referans Hücre temsil ve görüntü analizi için benzersiz ve yararlı bir araçtır ve sadece micropatterned hücreleri (Şekil 4) ile elde edilebilir. ImageJ, Referans Hücre bir yığın filtrelenmiş ve hizalı görüntülerin bir projeksiyon yaparak inşa edilmiştir (Resim&gt; Yığınları&gt; Z-proje). Ortalama veya maksimum yoğunluğu gibi çeşitli projeksiyon yöntemleri uygulanabilir ancak genellikle medyan projeksiyon görüntü yığınının ana aykırı ortadan kaldırır seçilir. Sonuçlarının incelenmesi kolaylaştırmak için renk kodlu bir frekans haritasına monocolor görüntü dönüştürme LUT (Tezgahları) uygulanır. </li><li> Ölçüm ve niceleme ilgi parametreleri (makro hipotenüs) Tek bir büyük stres elyaf haline aktin hücre iskeletinin organize çünkü bu video makalede, L-micropatterns kullanılır. Hücre iskeletinin blebbistatin Kullanıcı etkisi bu şekilde aktin vurgulayarak, birçok yönden belirlenir: ya da stres lif yoğunluğu, süresini veya kalınlığı boyama aktin stres fiber eğriliği değişiklikleri,, aktin filamentler morfometrik özellikleri değişiklikleri ölçen hücre şekil vb Bu parametreler tek tek hücre görüntüler ya da son Referans Hücre kendisi ya ölçülebilir. Burada, 5 mcM blebbistatin etkisi ikinci bir ImageJ makro (Şekil 7) hipotenüs adlı kullanarak çökmüş hücrelerinin sayısını sayma tarafından karakterize edildi. Kısaca, L-micropattern eşiklenir görüntüleri hücre üçgen şekli teorik bir hipotenüs tanımlamak için kullanılır. Sonra, aktin boyanmış görüntülerin eşikleme yaklaşık gerçek hücre şekli için yapılır. Gerçek içbükey hücre zarı, hücre üçgen ve teorik hipotenüs arasındaki alan ölçülür. Hücre çöktü, teorik hipotenüs altında bir alan belirir. Çökmüş hücrelerinin yüzdesini kontrol karşılaştırmak için kullanılan ve tedavi koşulları. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Hangi hücrelerin örnekleri hemen micropatterns üzerinde gibi görünmelidir ve 1.6-1.8 açıklanan kritik yıkama adımları birkaç saat sonra, Şekil 5'te gösterilmiştir. CYTOOchips 15 dakika sonra, yuvarlak HeLa hücrelerinde fibronektin micropatterns (Şekil 5a) yapıştırılır belirten eşit mesafelerde görülmektedir. Hücrelerin kültür geminin hafif sallayarak rağmen hareketsiz kalır Yapışma tamamlandı. Birden fazla hücreleri tarafından işgal micropatterns sayısını en aza indirmek için, cips sonra cytophobic alanlar üzerinde yüzen hücreleri çıkarmak için PBS ile temizlendi. Birkaç saat sonra, tam micropatterns gerilir hücreleri Şekil 5b gösterildiği gibi görünecektir. Tipik tek hücre blebbistatin, fiksasyon ve boyama aktin ve çekirdekler ile hücreleri inkübasyondan sonra elde edilen görüntüler Şekil 6'da sunulmaktadır. ImageJ CellRef makro kullanarak birden fazla görüntü ve görüntü işleme otomatik kazanılmasından sonra, renk kodlu bir frekans harita, tüm hücre görüntüleri (6f 6c ve Şekil) üzerinden ortalama aktinin yoğunluğunu gösteriyor oluşturulur. Nontreated ve tedavi koşulları için Referans Hücre karşılaştırılması kolay gözlem altında çalışma fenotipi için bu yaklaşımın potansiyel gösterir ve hücresel ilaç etkileri keşfetmek için özellikle yararlıdır. Olası bir analiz, hücreleri üzerindeki blebbistatin etkisi bir örnek Şekil 7'de sunulmuştur. Çökmüş hücrelerin sayısı (yani teorik hipotenüs altında mevcut boş bir alana sahip hücreler), 50 kontrol hücreleri tespit ve 50 ImageJ hipotenüs makro tarafından tespit edilen 5 mcM blebbistatin ile tedavi hücreleri gösterilir. Blebbistatin tedavi nüfus çökmüş hücrelerinin artan sayıda stres fiberler ve bu nedenle hücre içinde actinomyosin kasılma güçleri blebbistatin inhibisyonu nedeniyle membran gerilimi rahatlama yansıtır. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Metamorph ile yeni bir dergi yaratmak için Prosedür. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> RakamOtomatik görüntü işleme prosedürü 2. Akış şeması. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 tek hücre Filtreleme. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Referans Hücre Bina. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Hücre tohumlama. A) Hela hücreleri B) HeLa hücrelerinde L micropatterns (10x büyütme) yayılmasını tam sonra kızarma adım (4x büyütme) sonra micropatterns yapıştırılır. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 kontrolü ve ilaç tedavi koşulları nonpatterned ve micropatterned hücrelerinin karşılaştırılması. HeLa hücreleri 3 saat, 1 saat 5 mcM blebbistatin (alt panel) veya sol tedavi edilmezse (panel üst) numaralı seribaşı ve tedavi edildi. Kontrolü nonpatterned hücreleri (a), aktin 5 mcM blebbistatin (d) ile tedavi üzerine belli belirsiz sökmeye birden fazla liflerinin içine toplanır. L-micropatterns, kontrol hücreleri üçgen bir şekil (b) nonpatterned hücreleri (d) ile karşılaştırıldığında L. 2 uçları dışa arasında büyük bir aktin fiber (stres lif) benimsemek ve geliştirmek, blebbistatin L-micropatterned büyük bir fenotipik değişim indükler hücreleri (e). Ilaç etkileri ve kontrol ve tedavi koşulları karşılaştırma doğrudan görselleştirme 20 hücrelerden inşa Referans Hücre sunumu ile hızlı bir şekilde görüntülendi. Blebbistatin hücrelerin en önemli stres fiber kaybolur çöküşü ve (f) tedavi sırasında bireysel hücrelere benzer şekilde, açık ve yoğun bir stres lif, kontrol Referans Hücre (c) mevcut. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7, hücreleri üzerindeki makro hipotenüs kullanarak blebbistatin etkilerini bir analiz örneği . Kontrol hücrelerinin% 25'i yıkılmış olsa da, bu zayıflamış actinomyosin kontraktil ağ (n = 50 hücre) yansıtan 5 mcM blebbistatin tedavi edilen hücrelerin% 75 3 kat artmış.

<ol><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li>
<li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li>
<li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li>
<li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li>
<li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).</li>
<li>Pouthas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+migrating+cells%2C+the+Golgi+complex+and+the+position+of+the+centrosome+depend+on+geometrical+constraints+of+the+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum.</a> J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).</li>
<li>Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+study+of+mitotic+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.</a> Nature. 447, 493-496 (2007).</li>
<li>Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).</li>
</ol>

Anne Béghin dışında tüm yazarlar, bu makalede yer reaktifler ve enstrümantasyon üreten CYTOO SA, çalışanları.

Micropattern, seçimi 5 mcM blebbistatin etkileri standart kültür destekler ancak algılanabilir olsa da, tek bir büyük stres elyaf haline aktin konsantre micropatterns verimli kantifikasyon mümkündür. Bu hücre üzerindeki blebbistatin etkileri doğru kantifikasyon yardım aktin hücre iskeletinin görselleştirme artırır. Micropattern şekli tercih testinin tasarım kritik ve çalışmaya vurgulanacaktır fenotipik değişim göre tasarlanmıştır. Sonuçlar Micropatterns özellikle düşük konsantrasyonlarda, görselleştirme ve miktar ilaç etkisi kolaylaştırır. Hücre tabanlı deneyleri için yapışkan micropatterns homojen düzlemsel yüzeylerin yerine, üretilen verilerin doğruluk, duyarlılık ve kalitesini artırır. Sonuç olarak, daha az hücre, güçlü istatistiksel sonuçlar elde etmek için 3 analiz için gerekli . Yapıştırıcı micropatterns fonksiyonel çalışmalar iyileştirilmesi ve toksik ya da dolaylı olarak ilaç etkileri neden önlemek için daha düşük ilaç konsantrasyonları fenotipik değişiklikleri keşfetmek için gerçek bir fırsat sunuyoruz. Yeterli tarama platformlarda kullanılması halinde, micropatterns gen / ilaç tarama uygulamaları geliştirmek için ilaç şirketlerinin taleplerini karşılamak. 3-13 altında hücresel fenomen analiz edilmesi ve ölçülmesi için micropatterns istismar var son yayınların bazı ek örnekler zikrediliyor.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Hücre kültürü </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips seçtiğiniz protein adsorpsiyonu için kullanılabilir. </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Odasının Sayma (Kova slayt) </td><td> Prolabo </td><td> 71287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f Tal sığır serum) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penisilin ve Streptomisin </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 kuyu plaka </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> santrifüj </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Uyuşturucu, fiksasyon ve immün </td></tr><tr><td colspan="2" > Hücre iskeleti Tampon 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > 10 mM (MES), pH 6.1, 138mm KCl 3mm MgCl 2mm EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Sakaroz </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> PFA% 32 CB 1.185X 54 ml, 10 ml Mix </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS tablet </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Albümin bovin serum (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0.1M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Image Acquisition </td></tr><tr><td colspan="2"> Epifluorescent mikroskop </td><td> Nikon</td><td> Eclipse Ti </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD Kamera </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ Yazılım </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İlaç etkisi micropatterned hücreler geliştirilmiş görselleştirme ve kantitatif analiz

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Bugüne kadar, en HCA (Yüksek İçerik Analizi) çalışmaları, homojen bir substrat mikro plakaları tedavi doku kültüründe yetişen yapışık hücre hatları ile gerçekleştirilmektedir. Bu koşullar altında, hücrelerinin yayılmasını ve hücre şekli, morfoloji ve davranış bir değiş her yöne bölün. Toplam nüfusun yüksek hücre-hücre varyans, özellikle ilaç geliştirme, HCA başarı engellemektedir. Her bireyin hücre şekli ve iç polarite normalleştirmek için micropatterns yeteneği bu kritik darboğazı 1-2 çözmek için büyük bir fırsat sağlar. Erişim ve micropatterning teknoloji kullanımı kolaylaştırmak için, CYTOO lamel ve kuyu formatları micropatterns kullanmak için hazır bir dizi geliştirdi. Bu video makalede, biz CYTOOchip micropatterns, ilaç tedavisi, fiksasyon ve boyama otomatik satın alma, otomatik görüntü işleme ve son veri analizi hücre tohumlama tüm işlemlerin detaylı protokoller sağlar. Bu örnekte, biz micropatterns hücre tabanlı testlerin nasıl kolaylaştırabilir göstermektedir. Homojen yüzeyler üzerinde kültür hücrelerinde hücre hücre iskeletinin değişiklikler ölçmek zordur, ancak her hücrede hücre adezyon temas sistematik konumlandırma nedeniyle aktin ağda tekrarlanabilir bir organizasyon micropatterns sonuçları hücreleri kültür. Bu tür hücre içi mimari normalleşme protokolleri blebbistatin, aktin-miyozin etkileşimi bir inhibitörüdür kullanarak, bu seti gösterilmiştir aktin hücre iskeletinin bile küçük etkilerin ölçümü sağlar.

Hücresel mimarili normale Yapıştırıcı micropatterns, ilaç etkileri algılama duyarlılığını artırmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve otomatik görüntü elde edilmesi ve analizi basitleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji, geleneksel hücre kültürleri destekleyen üzerinde gerçekleştirilen ve dolayısıyla aşırı hücre-hücre değişkenlik muzdarip ilaç / siRNA tarama testleri, fayda sağlayacaktır.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Bugüne kadar, çoğu HCA (Yüksek İçerikli Analiz) çalışması, doku kültürü ile işlem görmüş homojen bir substrat üzerinde büyütülen adherent hücre hatları ile gerçekleştirilmiştir...

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, belirli yapışkan mikro desenler üzerinde elde edilen hücre mimarisi ve konumunun normalizasyonunun, geleneksel cam lam desteklerinde mümkün olmayan, hassas ve sağlam ilaç etkisi kantifikasyonu ile görüntü yakalamanın kolayca otomatikleştirilmesine ve doğrudan görüntü işlemeye nasıl olanak tanıdığını göstermektir. Bu, L şeklinde SI three etiketli mikro desenler taşıyan SI two çiplerine heli hücreleri ekilerek gerçekleştirilir. Hücreler, L'nin iki ucunu kapsayan ana bir stres lifi oluşturarak üçgen şeklini alır. Desenli hücreler daha sonra lebos statin ile inkübe edilir veya işlem görmeden bırakılır, ardından aktin hücre iskeletini ve çekirdekleri görselleştirmek için fikse edilir ve boyanır.Ardından, mikropattern hücrelerin görüntüleri alınır ve analiz için bir görüntü yığını oluşturmak amacıyla cell ref makrosu ile fenotipleri nicelleştirmek için hypotenuse makrosu kullanılarak işlenir. Nihayetinde, düşük dozda BLEs statinin, standart hücre kültürü koşullarında tespit edilemeyen, mikropattern HELOC hücreler üzerinde anlamlı bir etkisi olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, hoş geldiniz.Bugün, hücre analizi için yapışkan mikro desenlerin nasıl kullanılacağını açıklayan deneysel protokolümüzü sunmak ve bu yapışkan mikro desenler üzerinde çok düşük dozlardaki ilaçların kolayca nasıl nicelendirildiğini gösteren deneysel verileri paylaşmak için buradayız. Bu mikro desenleri ilk gördüğünüzde, hücre analizi sırasında görüntü yakalamadaki değişkenlik sorunlarını nasıl çözebileceğini hemen anlayacaksınız. Çünkü, bir mikro diziye benzer şekilde hücrelerin düzenli bir dizisine sahip olduğunuzda, görüntüleri adım adım yakalayabilmek için mikroskop tablasını hücreden hücreye kolayca hareket ettirebilirsiniz.Ancak mikro desenlerin sunduğu tek avantaj elbette bu değildir. Aslında, çapraz veya Y şekli gibi belirli tipik mikro desenlerde, hücre içi mimariyi normalize etmiş oluruz; yani organeller, mitotik iğ, hücre iskeleti ve farklı protein ağlarının tümü hücreden hücreye aynı konumlarda veya aynı yönelimde yer alır, bu da ilaçların bu özel desenler üzerindeki etkilerini öngörmeyi ve nicelleştirmeyi çok daha kolay hale getirir. Bu durum, klasik Petri kabı veya mikroplakada normalde yapılan işlemlerle kıyaslandığında oldukça sezgi dışı görünebilir.Çünkü elbette hücrelerin hareket ettiğini ve farklı morfolojiler benimsediğini sıkça görürsünüz. Öte yandan, adhezif mikro desenler üzerinde tüm hücreler birbirine benzemeye başlar; çünkü bu adhezif mikro desene yanıt vermekte ve mimarilerini aynı şekilde organize etmektedirler. Bu durum aslında biraz yapay görünebilir, ancak yakından baktığınızda, Petri kabı daha yapay değil midir?Çünkü dokularda hücreler, hem komşu hücreler hem de hücre dışı matris tarafından kısıtlanırlar. Bu nedenle, hücre mimarisini yönlendiren çok miktarda uzamsal bilgiye maruz kalırlar. Mikro desenlerin sağladığı bu yerinde avantaj, bizim üzerinde çalıştığımız konudur.Bu uzamsal bilgiyi hücrelere geri kazandırıyoruz ve tüm hücreler buna yanıt vererek aynı şekilde organize oluyor. Artık tüm hücreler birbirine benzediği için, referans hücre kavramını getirebiliriz; yani tüm görüntülerin ortalamasını alarak, hücrenin belirli bir koşulda nasıl göründüğünü gerçekten temsil eden tek bir görüntü elde edebiliriz. Daha sonra bir ilaç ekleyip bu referans hücreye tekrar bakarak, ilaca yanıt olarak hücre morfolojisinin veya organizasyonunun nasıl değiştiğini görebilirsiniz.Situ two logolarının okunabilir olduğundan emin olarak, iki adet situ two çipini altı kuyucuklu bir plakanın iki bağımsız kuyucuğuna ayrı ayrı yerleştirin. Bu deneyde kullanılan situ two çipleri FibroGen SI three ile boyanmış mikro desenlere sahiptir ve kullanımdan önce karanlıkta tutulmalıdır. Yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaşmış HeLa hücrelerini tripsin ile toplayın ve mikroskop altında hücrelerin düzgün bir şekilde tekil hale geldiğini kontrol edin; hücreleri 300 G'de dört dakika boyunca santrifüjleyin ve nazikçe yeniden süspande edin; hücreleri sayın ve mililitre başına 15.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin.Eksik D-M-M-E-F 12 kültür ortamında kuyu başına 60.000 hücre dağıtın. Hücrelerin merkezde toplanmasına neden olacak rotasyonel hareketlerin oluşmasını önlemek için plak mümkün olduğunca az hareket ettirilmelidir. Hücrelerin çeper altında 10 dakika boyunca çökelmesini bekleyin, ardından hücreleri inkübatöre taşıyın.Hücre inkübatöründe 10 ila 20 dakika içinde, hücreler 10 dakika sonra yapışmaya başlayacaktır; hücreler yapıştığında düzenli olarak mikroskop altında kontrol edin. Hücre besiyerini değiştirin ve aşağıdaki prosedürü dört kez tekrarlayarak fazla hücreleri uzaklaştırın. Plakayı düz tutarak, besiyerini kuyucuğun yan tarafından nazikçe aspire edin.Çipin kurumasını önlemek için yeterli ortamın kaldığından emin olun. Dört mililitre PBS ekleyin ve aspirasyona çipin merkezinden başlayın. Ardından, daha önce yapıldığı gibi PBS'nin büyük kısmını aspire etmek için kuyucuğun kenarına geçin ve mikroskop altında yüzen hücrelerin olup olmadığını kontrol edin.Eğer çok miktarda yüzen hücre kalırsa, yıkama prosedürünü tekrarlayın. Çok az hücre varsa, PBS'nin bir kısmını aspire edin ve yerine iki mililitre taze besiyeri ekleyip bu işlemi iki kez tekrarlayarak toplamda dört mililitre taze besiyeri ekleyin. Hücrelerin tamamen yayılmasına izin vermek için hücreleri bir hücre inkübatöründe üç saat boyunca inkübe edin.Bu yöntemle, mikro desenlerin %10 ile %30'u arasında tek bir hücre tarafından doldurulacak, diğer desenler ise ya boş kalacak ya da birden fazla hücre tarafından doldurulacaktır. Hücreleri BLEs statin ile tedavi etmek için, 17 millimolar ilaç stok çözeltisini dört mililitre besiyerinde %0,1 DMSO ile beş micromolar nihai konsantrasyona seyreltin. Kontrol için sadece %0,1 DMSO içeren besiyeri hazırlayın; çipin kurumasını önlemek için hücre besiyerini aspire edin ve hızla BLEs statin veya kontrol çözeltileriyle değiştirin.Hücreleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında sitoskelet tamponunu hazırlayın. 2 mL cb'ye 1 g sükroz ekleyin.Bu, hücre içi yapıların korunmasına yardımcı olur. Bir mililitre CB sükroz ile dört mililitre %5 PFA'yı karıştırın. CB sükroz içindeki PFA çözeltisinden iki mililitre ekleyin.Taze bir altı kuyucuklu plakanın iki kuyucuğuna. Hücreleri fikslemek için, bir penset yardımıyla CY iki çipi alın ve iki mililitre CB sakroz çözeltisinde PFA içeren altı kuyucuklu plakaya yerleştirin. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, PFA'yı uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın, ardından hücreleri iki mililitre 100 milimolar amonyum klorür ile 10 dakika boyunca yıkayın.Kalıntı PFA çapraz bağlama aktivitesini söndürmek için, hücreleri üç dakika boyunca 0,1% tritton X 100 içeren iki mililitre PBS ekleyerek geçirgen hale getirin, iki kez PBS ile yıkayın; aktin filamentlerini 1,5% BSA içeren PBS içinde 1:2000 oranında iki mililitre ZI konjuge phalloidin ile boyayıp oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından hücreleri iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Sonrasında, çekirdekleri boyayın.PBS içinde çözünmüş 1 mg/mL konsantrasyonunda iki mililitre hawked ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edin. İki mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Yan iki çipi, al gibi montaj çözeltilerinden 25 ila 30 µL kullanarak standart bir lam üzerine monte edin.Üç farklı dalga boyunda görüntü elde etmek için Metamorph görüntüleme yazılımı ve NIK icon eclipse T mikroskobu kullanıyoruz. Sistem, CCD Hema Matsu kamera ve intens lite cıva fiber aydınlatıcı ile donatılmıştır. İlk olarak 20 x büyütme seçin.Menü çubuğunda sıradaki adım olarak, deneyin farklı parametrelerini ayarlamak için çok boyutlu kazanımı (multidimensional acquisition) açın. İlk olarak verilerinizi nereye kaydedeceğinizi belirtin.Dalga boyu sayısını üç olarak ayarlayın, SI üç dalga boyunu seçin ve lam üzerine kapatma camını, 12 mikro desen kamera alanının merkezine gelecek şekilde konumlandırın. Alan başına görüntülenen mikro desen sayısı, kamera ve objektif kurulumlarına bağlı olarak değişiklik gösterecektir. Her bir dalga boyu için pozlama süresini ayarlayın ve otomatik odaklama yapın.PS üç için, çok boyutlu veri toplama işlemini yürüten bir günlük oluşturun ve bunu MDA jnl olarak kaydedin. Her biri 12 mikro desen içeren 24 görüntü elde etmek için tarama aşaması fonksiyonunu açın. Yürütülecek günlük ayarlarına altı sütun ve dört satır ile eksi 400 micron x adım boyutu ve 300 micron y adım boyutu girin; MDA jnl günlüğünü yükleyin ve üç dalga boyunda 24 görüntünün otomatik veri toplama işlemini başlatmak için scan düğmesine basın.Bu videoda, hücrenin tutunmamış kısmını destekleyen tek bir ana aktin stres lifinin oluşumunu tetiklemek ve BLE'lerin statinin hücreler üzerindeki etkisini, düz fibronectin üzerine oturtulmuş hücrelerle karşılaştırarak görselleştirmeyi ve ölçmeyi kolaylaştırmak için L mikro desenler kullanılmıştır. Otomatik görüntü işleme ve analizi için, açık kaynaklı ImageJ programı için yazılmış iki özel makro açıklanmaktadır; ham görüntülerden oluşan bir yığından, ilk makro tekil hücreleri ayıklar ve bir referans hücre oluşturur. İkinci makro ise hücre membranının çökmesini ölçer.İlk adım, ham görüntülerden tekil hücrelerin segmentasyonudur. Floresanla işaretlenmiş mikro desen görüntüleri, mikro desenler merkezli bölgeleri belirlemek için kullanılır; bu bölgeler her dalga boyundaki görüntülerden kırpılır ve her dalga boyu için yığınlar halinde yeniden birleştirilir. Tek hücreli mikro desenleri seçmek için, makro görüntü başına çekirdek sayısını tespit eder ve tüm yığınlarda birden fazla çekirdek içeren veya hiç çekirdek içermeyenleri eler.Son olarak, toplanan tüm görüntülerin ve tüm kanalların mikrodesen konumuna göre yeniden hizalanması için ImageJ eklentisi multi-stack reg kullanılır. Bu adım, tek hücre analizi yapmak veya bir referans hücre oluşturmak için kullanılabilecek, bireysel görüntülerden oluşan bir çizgi yığını (line stack) oluşturur. ImageJ'de referans hücre, bir yığındaki filtrelenmiş ve hizalanmış görüntülerin projeksiyonu alınarak oluşturulur.Çeşitli projeksiyon yöntemleri uygulanabilir, ancak genellikle görüntü yığınının aykırı değerlerini ortadan kaldırmak için medyan projeksiyonu seçilir. Referans hücre, yalnızca mikrodesenli hücrelerle elde edilen, temsil ve görüntü analizi için benzersiz ve kullanışlı bir araçtır. İncelenmesini kolaylaştırmak için, tek renkli görüntüyü kodlanmış bir frekans haritasına dönüştürmek üzere bir bakma tablosu veya LUT uygulanır.BLE'lerin statin etkisini karakterize etmek için hücrenin sertliği ve çökmesi ikinci bir Image J makrosu kullanılarak analiz edilmiştir. Kısaca, L mikro desenin eşik değerle belirlenmiş görüntüleri, hücrenin üçgen şeklinin teorik hipotenüsünü tanımlamak için kullanılır. Ardından, hücre şeklini tanımlamak amacıyla aktin boyama görüntülerinin eşik değerle belirlenmesi işlemi gerçekleştirilir.Ardından, teorik hipotenüs ile gerçek konkav hücre membranı arasındaki alan farkı ölçülür; teorik hipotenüsün altında kalan bir alana sahip hücreler çökmüş olarak kabul edilir. Beş mikromolar BLEs statinin etkisi, işlem görmüş ve kontrol koşullarındaki çökmüş hücre sayıları karşılaştırılarak karakterize edilmiştir. BLEs statin ile işlem görmüş veya işlem görmemiş L mikropatern hücrelerinin tipik görüntüleri gösterilmektedir; hücreler mikropaternler üzerinde fikse edilmiş ve boyanmıştır.Aktin ve çekirdekler sırasıyla kırmızı, yeşil ve mavi renklerde gösterilmiştir. BLEs statinin hücre şekli üzerindeki etkisini kontrol koşullarıyla karşılaştırınız. Düz fibronektin üzerinde BLEs statin veya kontrollerle inkübasyon sonrası tipik hücreler burada gösterilmektedir.Hücreler fikse edilmiş ve boyanmıştır; aktin ve çekirdekler sırasıyla yeşil ve mavi renktedir. İşlem görmüş ve kontrol koşulları arasındaki benzerliğe dikkat edin. BLEs statin ile işlem görmüş veya işlem görmemiş referans hücrelerden elde edilen tipik görüntüler gösterilmiştir.Bu yaklaşımın, incelenen fenotipin kolayca gözlemlenmesi için olan potansiyelini not edin. Burada, makro hipotenüs kullanılarak BLEs statinin hücreler üzerindeki etkilerinin analizine dair bir örnek verilmiştir. Kontrol hücrelerinin %25'i çökmüşken, beş mikromolar BLEs statin ile tedavi edilen hücrelerde bu oran üç kat artarak %75'e çıkmıştır; bu durum, zayıflamış aktinin kontraktil ağını yansıtmaktadır.Bunu izledikten sonra, yapışkan mikro desenlerin yüksek içerikli analizlerdeki birçok darboğazı nasıl çözdüğüne dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İlk olarak, yapışkan mikro desenlerin kullanımı, görüntü yakalama işlem analizini çok daha basit hale getirmiştir. İkinci olarak, mikro desenler, hücrelerin morfolojilerini ve davranışlarını normalize ederek hücreden hücreye değişkenliği azalttığı için, ilaçların çok düşük dozlardaki çok hafif etkilerinin tespit edilmesine olanak tanır.Ve son olarak, hücre analizinde genellikle iyi bir sonuç almak için gerekli olan binlerce hücreye kıyasla, referans hücremizi kullanarak sağlam ve anlamlı bir sonuç elde etmek için yalnızca birkaç on hücreye ihtiyaç duyarsınız.

improved-visualization-quantitative-analysis-drug-effects-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, bir substrat üzerindeki istenilen noktada hücre yerleştirmek için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem desen hücreleri yüzeye hücreleri ile dolu mikro oyukların içeren bir silikon çip saygısız. Bu yöntem yayılabilir ve juxtacrine hücreleri arasındaki sinyal modüle etmek için yeni bir yol sağlar.

Bio Flip-Chip kullanarak Embriyonik Kök Hücreler, Desenlendirme

Sulu de iki fazlı sistemlerde hücrelerin aynı anda birden fazla kalıp popülasyonları için kullanılmıştır. Hücre desenlendirme için bu hızlı ve kolay bir yöntem dekstran ve polietilen glikol ve iki polimer çözümleri arasında var arayüzey gerilimi sulu çözeltilerinin faz ayrışması yararlanır.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Bu 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, hücre dizilerini batık yüzeylere yazdırır.  Hücre dizilerinin 3D akış hücrelerinde mikroakışkan olarak batık yüzeylere nasıl iletildiğini açıklıyoruz.  Batık yüzeylere baskı yapılarak, çok sayıda alanda ilaç taraması ve sitotoksisite değerlendirmesine izin veren hücre mikrodizileri üretildi.

Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Burada sunulan yöntem, memeliyle ilgili kültürlerin içinde uzamsal organizasyon ortaya çıkarmak için nicel görüntüleme ile birlikte micropatterning kullanır. Teknik standart bir hücre biyoloji laboratuarında kurmak kolaydır ve in vitro desen çalışması için bir uysal sistemi sunar.

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

Tek hücreli de iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamikleri uzun vadeli gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlayan bir mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı" teknolojisi saiyoruz Düzey. Bu teknolojinin temel araştırma veya klinik öncesi ilaç geliştirme için bir in vitro model olarak çalışması beklenmektedir.

Gerçek Zamanlı Gözlem için Mikroakışkan Evrim Hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında Heterojen İlaç Gradyanların Üretimi

Bu metodoloji, substrat sertliği, protein bileşimi ve hücre morfolojisi gibi hücre dışı matris ipuçlarının Schwann hücresi (SC) fenotipini düzenleyen mekanizmalarını göstermeyi amaçlamaktadır.

Schwann Hücre Fenotip Spesifikasyonunu Değerlendirmek Için Hücre Dışı Matriks Mikroortamlarının Hazırlanması

Bakteri ve kolloidler gibi bir sıvıda asılı mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan substratında öngörülen dizilere desenleştirmek için mikroakışkan bir platformda kapilarite destekli montaj kullanan bir teknoloji sunuyoruz.

Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Bu çalışma, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler (FLECS) Teknolojisini, floresan protein mikrodesenlerinin görselleştirilmiş yer değiştirmelerine dayanan tek hücreli kontraktil kuvvetlerin basitleştirilmiş, eller kapalı nicelleştirilmesi için mikrowell formatında kullanmak için esnek bir protokol sunmaktadır.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Öğrenin, yapışkan mikrodesenler kullanarak Hela hücrelerinde ilaç etkilerini nasıl hassas ve sağlam bir şekilde nicelendirebilirsiniz. Bu yöntem, görüntü analizinde otomasyonu kolaylaştırır ve hücreden hücreye değişkenliği azaltarak düşük dozlarda bile belirgin sonuçlar elde etmenizi sağlar.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Daha fazla video keşfet