Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein emilimini ve hücre büyümesini kontrol etmek için iki boyutlu desenli bir substrat geliştirmektir. Bu, mikro temaslı baskı için A-P-D-M-S damgası üretmek için kullanılan desenli bir master üretmek için fotolitografi kullanılarak elde edilir. İkinci adım olarak, proteini emen ve proteine direnen bölgelere sahip bir desen üretmek için mikro temaslı baskıyı içeren desenli altın alt tabaka hazırlanır.

Daha sonra, deseni görselleştirmek ve çalışmayı sağlamak için substrata protein ve hücreler eklenir. Floresan ve yüz kontrast mikroskobuna dayalı olarak bu model substratlar üzerinde iyi protein ve hücre hapsi gösteren hücresel büyüme ve davranış sonuçları elde edilir. Bu tekniğin, proteinlerin MicroCon baskısı gibi diğer mevcut yöntemlere göre ana avantajı, glikol sonlu tek tabakanın, desenin arka planında spesifik olmayan protein ve hücre emilimine direnmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü basılan her desen için uygun damgalama tekniğinin optimize edilmesi gerekir. Desenli ana merkezin hazırlanmasına başlamak için, sıkma kodlayıcı üzerindeki silikon gofret ve iki döngülü sıkma programının ilk adımında gofreti aseton ile durulayın. Sıkma programının ikinci adımında, aseton, sıkma işleminin başlangıcında temiz, kuru bir gofret bırakarak buharlaşacak, gofrete fotorezist uygulayacak ve ardından daha önce açıklanan koşulları kullanarak sıkma tabakası uygulayacaktır.

Foto dirençli kaplamalı gofretleri 110 santigrat derecede yüksek homojenliğe sahip bir sıcak plaka kullanarak iki dakika boyunca yumuşak bir şekilde pişirin. Sonraki fotoğraf deseni. Fotoğraf, bir maske hizalama sistemi ve uygun bir maske kullanılarak kaplanmış gofrete karşı dayanıklıdır.

İlk olarak, alt tabakayı maske hizalayıcının vakumlu kamyonuna yerleştirin. Ardından maskeyi tutucu tepsiye yerleştirin ve maske ile alt tabaka arasında iyi teması doğrulamak için maskeyi yerinde tutmak için vakumu açın. Alt tabakayı maskeyle buluşana kadar kaldırın.

İyi bir temas kurulduğunu doğrulamak için hizalayıcının optiklerini kullanın. Son olarak, alt tabakayı litografik maske aracılığıyla UV ışığına maruz bırakmak için lambayı açın. Desenli gofreti geliştiricide hafif çalkalama ile bir dakika 45 saniye boyunca geliştirin.

Yarı iletken sınıfı, deiyonize su ile iyice durulayın ve UV filtreli bir mikroskop kullanarak bir nitrojen gazı akışı kontrol modeli geliştirme ile kurulayın. Bu prosedüre, ağırlıkça 10'a bir reçine sertleştirici hazırlayarak başlayın. Puro karışımı 180 2 eksiksiz.

Fotoğraf desenli gofret, tek kullanımlık bir Petri kabındaki karışımla vakumlu kurutucu Degas'ta, PDMS kaplı ana makinede hiçbir kabarcık görünmeyene kadar örtün. Ustanın tabağın dibinde olduğundan emin olduktan sonra, damganın 65 santigrat derece fırında 1,5 saat kürlenmesine izin verin. PDMS damgası sertleştiğinde, damgayı master'dan kesin ve uygun boyuta getirin.

Damgayı, toz ve döküntülerden korumak için kapalı bir kapta, yüzü yukarı bakacak şekilde saklayın. Alt tabakaları metal biriktirmeye hazırlamak için önce yuvarlak cam kapak fişlerini 10 dakika boyunca oksijen plazması ile işlemden geçirin. Daha sonra kapak kızaklarını deiyonize su ile iki kez durulayın, su ile duruladıktan sonra durulamalar arasında nitrojen gazı akışı ile kurulayın, iki kez etanol ile durulayın, durulamalar arasında nitrojen gazı akışı ile kurutun.

Bir çoklu cep elektron demeti biriktirme sistemi kullanarak, 50 angstrom titanyum ve ardından 150 angstrom altın yatırın. Evaporatörü titanyum tabakasının birikmesi ile altın tabakası arasına sıkıştırmayın. PDMS damgasını etanol ile durulayın ve iyice kurulayın.

Nitrojen gazı ile, tamamen kaplanana kadar damgaya damla damla damgalama solüsyonu uygulayın. Damgayı nitrojen gazı ile iyice kurulayın. HEXA Decane dosyasının mikro kontak baskısı, PDMS damgasının özelliklerine bağlıdır ve bu prosedürün en zor yönlerinden biridir.

Başarılı damgalama, eşit basınç uygulayan iyi bir tekniğin geliştirilmesini gerektirir. Damgalama sırasında. Havada geleneksel mikro temaslı baskı için, damgayı altın alt tabakaya hafifçe bastırın ve tek katmanın 15 saniye boyunca oluşmasına izin verin.

Alternatif olarak, çok küçük özelliklerden ve yüksek en-boy oranlarından oluşan desenler için, altın alt tabakayı 18,2 mega om deiyonize su içeren bir Petri kabına yerleştirin ve alt tabakanın suya daldırıldığından emin olun. Ardından damgayı altın alt tabakaya hafifçe bastırın ve mono bir katmanın 15 saniye boyunca oluşmasına izin verin. Daha sonra, damgalı alt tabakayı nitrojen gazı ile kurutan etanol ile iki kez durulayın.

Her durulamadan sonra, alt tabakayı bir Petri kabına yerleştirin ve alt tabakayı geri doldurma solüsyonu ile örtün. Buharlaşmayı önlemek için çanağı param ile kapatın. Arka plan tek tabakasının karanlıkta 12 ila 14 saat oluşmasına izin verin.

Son olarak, desenli kapak fişini arka doldurma solüsyonundan çıkarın ve her durulamadan sonra nitrojen gazı ile etanol ile iki kez durulayın. Desenli kapak fişine protein uygulamak için, kapak fişini küçük bir Petri kabına veya bir hücre kültürü odasına yerleştirin 500 mikrolitre ila bir mililitre delcos fosfat tamponlu tuzlu su ile örtün. DPBS, protein inkübasyonu sırasında substratı tamamen kaplamalıdır.

Eşit protein kapsamını sağlamak için, DPBS'ye konsantre bir protein çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez pipetleyerek karıştırın. Protein karışımını substrat ile 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış proteini çıkarmak için substratı DPBS ile iyice durulayın, substratı kurutmamaya veya hava su arayüzünden geçirmemeye dikkat edin.

Üç durulamadan sonra DPBS'yi aspire edin. Ardından, ıslak bir substratı korumak için yaklaşık 500 mikrolitre tam hücre büyüme ortamı ekleyin. Alt tabakayı durulamak için kullanılan büyüme ortamını değiştirin.

Taze ortamla, alt tabaka artık hücrelerle kaplamaya hazırdır. Tipik olarak, milimetre kare başına 30 ila 200 hücre, alt tabaka üzerine kaplanır. Bu görüntüde A-P-D-M-S damgası mikroskop altında görselleştirilmiş, damga özelliği aşağı bakacak şekilde bir cam kapak kızağı üzerine yerleştirilerek gösterilmiştir, ölçek çubuğu 100 mikrometredir.

Uygun damgalama, LOR 6 47 etiketli fibronektin gibi floresan etiketli bir proteinin uygulanmasıyla görselleştirilebilen keskin, berrak bir protein modeli ile sonuçlanır. Chk one hücrelerinin protein modeline hapsedilmesi burada gösterilmiştir. Bu görüntülerde ölçek çubukları 100 mikrometredir.

Alternatif olarak, SU fiksasyonundan sonra protein paternini görselleştirmek için immünohistokimya kullanılabilir. Burada, LOR üç 50 konjuge anti laminat antikoru, dört gün içinde gösterilen E 18 fare hipokampal nöronları ile tohumlanmış desenli laminatı görselleştirmek için kullanılır in vitro E 18 fare hipokampal nöronları, MIT izleyici ile boyanmış kırmızı beş 80, hücre büyümesinin protein modeliyle iyi bir şekilde sınırlı olduğunu gösterir. Bu tekniğe kolayca hakim olunsa da, LOR 6 47 konjuge fibronektin absorpsiyonu ile görselleştirilen bu model substrat preparatları tarafından gösterildiği gibi birkaç yaygın sorun ortaya çıkabilir.

DPBS'de konsantre protein çözeltisinin yeterli şekilde karıştırılmadan proteinin uygulanması, eşit olmayan protein modellerine yol açabilir. Yanlış damgalama, kısmi desen transferine veya damga çökmesine neden olabilir. Ek olarak, emilen protein içeren desen substratının havaya maruz kalması, tek tabakayı bozarak direncin azalmasına neden olabilir.

Arka planda, batık desenleme, geleneksel mikro temaslı baskı ve hava ile yazdırılması zor olan küçük özelliklere sahip desenler üretebilir. Bu iki görüntü, aynı PDMS damgası ile basılan aynı desenin farklı bölgelerini göstermektedir, havada veya deiyonize su destek çizgileri, desenin yalnızca küçük özelliklerinin başarılı bir şekilde basılamadığını göstermek için soldaki resimde gösterilmiştir. Ölçek çubukları 20 mikrometredir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 18 ila 24 saat içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir desen alt tabakasının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. A-P-D-M-S damgası üretin. Bir desen altın substratı hazırlamak için mikro kontakt baskıyı kullanın ve bu deseni protein ve hücreleri kullanarak görselleştirin.