Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

EV'lerin derinlemesine karakterizasyonu zor olabilir ve bireysel parametreleri tanımlamak için birden fazla cihaz gerektirir. Bu anahtar kriterleri Nano-Akış Sitometrisi gibi tek bir teknikle ölçmek, aynı anda birden fazla EV alt popülasyonunu tanımlar. Böylece her EV, floresanlarını belirlemeden önce 14 nanometreden daha büyük parçacıkları etiketsiz olarak tanımlayarak ayrı ayrı ölçülür.

Bu, yanlış pozitifleri kaldırarak sağlam bir veri kümesi sağlar. Nano-Flow Sitometri, plazma, BOS ve kültür ortamından zenginleştirilenler de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan EV'lere uygulanabilir. Bu teknik aynı zamanda virüslerin, lipit nanopartiküllerinin ve nanomalzemelerin analizi için de kullanılır.

Etiketleme protokolünün optimize edilmesi önemlidir. Bu, tamponda kalan herhangi bir artık floresana kıyasla bir parçacıkla ilişkili herhangi bir floresanı en üst düzeye çıkarır. Başlamak için cihazı açın, Nano-Flow Profession'u yükleyin ve Sheath Flow açılır menüsünden Başlat'ı seçin, yükleme bölmesine su yükleyin ve Sheath Flow açılır menüsünden Boosting'i seçin.

QC boncuklarını 0,6 mikrolitrelik bir tüp içinde damıtılmış suda bir ila 100 arasında seyreltin ve numuneyi sisteme sokmak için yükleme bölmesine yerleştirin. Ardından, önceki numuneyi, suyu veya temizleme solüsyonunu tamamen değiştirmek için numuneyi daha önce gösterildiği gibi 45 saniye boyunca artırın. Artırırken, lazer gücünü QC boncukları için önceden ayarlanmış şablona 250 nanometre FL QC standardına ayarlayın.

Daha sonra, sistem basıncını azaltmak için, aynı açılır menüden örnekleme basıncını seçin ve sabit bir basıncı korumak için otomatik örnekleme basıncını bir kilo pascal olarak ayarlayın. Ardından, edinme denetimlerinden Kayıt Süresi'ni seçerek bir dakikalık analizi başlatın. Veriler, yan saçılma yoğunluğu için bir günlük ölçeği ve seçilen bir floresan yoğunluğu gösteren nokta grafiği üzerinde çizilecektir.

Dosyayı kaydetmeden önce, dosya adını ve örnek seyreltmeyi ekleyin. Ardından, tüpü yükleme bölmesinden çıkarmak için boşalt'ı seçin. QC boncuklarını 150 mikrolitre temizleme solüsyonu ile değiştirin ve Boosting'i seçerek 30 saniyeden fazla temizleyin.

150 mikrolitre su içeren bir tüp kullanarak, ucu suya batırarak kılcal uçtaki fazla temizleme solüsyonunu çıkarın. Daha sonra standart boncukların boyutunu bir ila 100 su içinde seyreltin ve yükleme bölmesine 100 mikrolitre yükleyin. Şimdi, lazer gücünü önceden ayarlanmış şablona, S16 EXO 68 ila 155 nanometreye ayarlayın.

Bu ayar hem boyut standardı hem de 200 nanometreden küçük EV'ler içeren örnekler içindir. Örneklemeyi seçin ve numuneyi bir dakika boyunca kaydetmeye devam edin. Yazılım tarafından kaldırılmak üzere yanlış pozitifleri tanımlayarak boş bir ölçüm devalüantı oluşturmak için üçüncü ölçümü bir su veya PBS numunesi ile gerçekleştirin.

PBS'deki etiketsiz EV numunelerini, nFCM analizi için mililitre başına bir kez 10 ila sekizinci ila beş çarpı 10 ila sekizinci partikül arasında uygun bir partikül konsantrasyon aralığına seyreltin. Ve seyreltilmiş numunenin 10 ila 100 mikrolitresini yükleme bölmesine yükleyin. Partikül konsantrasyonu bilinmiyorsa, EV numunesinin bir ila 100 seyreltilmesiyle başlayın.

Numune konsantrasyonu, güçlendirme sırasında CCD kameradaki lazer noktasının boyutuna veya örnekleme sırasında olay patlaması izinin gözlemlenmesine göre hızlı bir şekilde yaklaştırılabilir. Yüklenen örnek 45 saniye boyunca artırıldıktan sonra, bir dakika boyunca kayıt yapın ve dosyayı daha önce gösterildiği gibi kaydedin. Kayıttan sonra, bu verileri analiz etmeye başlayın, Edinme sekmesinden Analiz sekmesine geçin ve kaydedilen NFA dosyalarını açın.

Doğru numune ölçümü için, numune karşılaştırmasının yanı sıra boşluk için değerleri ayarlamak üzere numune ölçümünden önce alınan iki standart ölçümü kullanın. Boyut standart dosyasını seçip eşik ayarlama aracını kullanarak yan dağılımdan çapa dönüştürme için boyut standart eğrisini oluşturun. Olay patlaması izlemesinde görülebilen eşik, bir olayın önemli olarak kabul edilmesi için gereken minimum sinyal yoğunluğunu tanımlar.

Eşik ayarlandığında, X ekseninde SS-H veya SS-A ve Y ekseninde FITC-A nokta grafiği parametrelerini kontrol edin. Standart Eğri Oluşturma aracını açın ve boyutlandırma şablonu olarak S16 EXO 68 ila 155 nanometreyi seçin. Tepe tarafı saçılma yoğunluklarını 68, 91, 113 veya 155 nanometre çapında parçacıklar olarak tanımlamak için Zirveleri Bul'a tıklayın.

Pencereyi kapatmadan önce, çap eğrisine dağılmış tarafın bire yakın bir R değeriyle oluşturulup oluşturulmadığını kontrol edin. Konsantrasyon standardını ayarlayın. Kaydedilen dosyayı seçin, standart sayıma tıklayın ve standardın parçacık konsantrasyonunu girin.

Standart bilgileri ayarlayın. EV örnek dosyasını seçin ve eşiği ayarlayın. Boş dosyayı seçin ve örnek sayısından kaldırılacak yanlış pozitiflerin sayısını belirlemek için boş ayarla'ya tıklayın.

PDF Oluşturma Aracı açıldıktan sonra, numunenin boyutlandırmasını, konsantrasyonunu ve seyreltmelerini kontrol edin. Daha sonra numunenin konsantrasyonunu ve parçacıkların boyut dağılımını gösterin. EV örneklerini makalede açıklandığı gibi etiketledikten sonra, etiketli numunenin bir mikrolitresini alın ve 0.6 mililitrelik bir tüp içinde PBS'de bir ila 50 arasında seyreltin.

Numuneyi yükleme bölmesine yükleyin ve 45 saniye boyunca yükseltme basıncı uygulayın. Ayrıca, doğru lazer ayarlarının yapıldığından ve uygun lenslerin yüklendiğinden emin olun. Şimdi, örnekleme basıncına geçin ve kayıt zamanını seçin.

Bir dakikalık alımın ardından, veri dosyasını adlandırın ve kaydedin. Numuneyi boşaltın, bir temizleme solüsyonu ile değiştirin ve daha önce gösterildiği gibi bir sonraki etiketli numuneyi yüklemeden önce temizleme solüsyonunu 30 saniyeden fazla artırın. PDF oluşturmak için, daha önce gösterildiği standartların aynısını uygulayın.

Yalnızca boş ölçüm farklı şekilde ayarlanır. Örnek dosyayı seçin ve eşiği ayarlayın. Geçit aracını seçin ve floresan pozitif popülasyonu ayıran bir çizgi çizmek için sol tıklamayı kullanın.

Temsil için adları ve renkleri ayarlayın. Boş dosyayı ayarlayın ve her farklı popülasyondan kaldırılacak yanlış pozitiflerin sayısını belirlemek için boş ayarla'ya tıklayın. PDF Oluşturma Aracı'nı açın ve floresan pozitif alt popülasyonun boyut dağılımını, konsantrasyonunu ve yüzdesini belirleyin.

Nokta grafiğinde, yeşil veya kırmızı kanaldan floresan ölçümlerini göstermek için Y eksenini değiştirin. Boşluğu ayarlayın ve PDF'yi daha önce gösterildiği gibi oluşturun. Nokta grafiğinde, X eksenini FITC ve Y eksenini APC olarak ayarlayın.

Çift floresan pozitif popülasyonları tanımlamak için kadran aracını kullanın. Adları ve renkleri temsili olacak şekilde ayarlayın, ardından PDF dosyasını açın ve floresan alt popülasyonlarını seçin. C2C12 türevi EV'ler yaklaşık %50 CD9, %30 CD63 prezentasyonu ve %70 popülasyonda üç EV belirtecinden en az birini gösterdi.

Tek tetraspanin etiketli EV alt popülasyonları için boyut profilleri, toplam parçacık popülasyonuna kıyasla yaklaşık 75 ila 85 nanometre daha büyük bir medyan boyut ve 65 nanometre EV'den daha az gösterdi. SW620 türevi EV'ler, parçacıkların yaklaşık% 40'ını CD9,% 7'sini CD63 sunumunu ve% 42'sini üç belirteçten en az birine sahip olarak gösterdi. SW620 türevli, tetraspanin etiketli EV'ler, bireysel tetraspanin pozitif alt popülasyonlar arasında benzer dağılımlara sahip 90 ila 110 nanometre arasında daha normal bir dağılım ve daha büyük medyan çap gösterdi.

Membran etiketlemesi tekrar tekrar C2C12 ve SW620 türevi EV'lerin% 80 pozitifliğini gösterdi. Yan saçılma yoğunluğu, hem C2C12 hem de SW620'nin nokta grafiklerindeki FITC yoğunluğu ile korelasyon gösterdi. Çift pozitif yüzdeler, tetraspanin pozitif yüzdelerine çok benzer.

CD63 etiketlemesi, membran etiketleme ile en zayıf korelasyonu gösteriyor gibi görünmektedir. Yüzde pozitiflik ölçümleri, ek membran etiketlemeli ve içermeyen antikor etiketlemesi arasında benzerdi. C2C12 türevli EV'lerin floresan popülasyonları için ortalama floresan yoğunluğu, CD9 EV'lere kıyasla CD63 ve CD81'in daha düşük bir sunumunu önerirken, SW620, her üç antikorun kullanılmasının herhangi bir antikor etiketinden daha büyük bir floresan sinyali sağladığını göstermiştir Bu protokolde, ortak EV belirteçleri floresan olarak etiketlenmiştir, ancak antikor hedeflerinin birçoğu EV kökenini göstermek için seçilebilir. EV fonksiyonu veya hastalık durumu.