Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Bu prosedürün genel amacı, kandaki hücre dışı vezikül dolaşımını iki farklı yöntemle izole etmek ve analiz etmektir. Bireysel hücre dışı vezikül tespit yöntemi için. Trombositten fakir plazma veya PPP ilk olarak bir kan örneğinden izole edilir.

PPP daha sonra ilgilenilen florokrom konjuge antikorlar ile boyanır. Boncuk bazlı tespit yöntemi için, hücre dışı veziküller boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra boncuk bağlı veziküller ilgili florokrom konjuge antikorlarla boyanır. Sonuç olarak, dolaşımdaki hücre dışı vezikül içeriği, numunelerin akış sitometrisi ile analizi ile belirlenebilir.

Bu tekniğin elektron mikroskobu veya manyetik boncuk ayırma gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çok daha hızlı olması ve belirli alt popülasyonlarla sınırlı olmaktan ziyade toplam hücre dışı escal popülasyonun değerlendirilmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bu yöntemin başarısı gösterilen manevralara ve sitometre kurulum parametrelerine sıkı sıkıya bağlı kalmayı gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir Minimum günlük varyasyonla yüksek kaliteli veriler üretmek için, Plazmayı Buffy ceketinden ve kırmızı hücrelerden ayırmak için tam kan örneklerini santrifüjleyerek başlayın. Daha sonra, plazma süpernatanının 1.2 mililitrelik alikotlarını 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın, buffy coat ve kırmızı hücreleri içeren alt katmanları rahatsız etmemeye dikkat edin, ardından trombositleri ve büyük hücre parçalarını çıkarmak için süpernatanı tekrar santrifüjleyin.

Sıkma işleminin sonunda, PPP numunelerinin son 200 mikrolitresi hariç tümünü, peletleri rahatsız etmemeye dikkat ederek dikkatlice yeni tüplere aktarın. Daha sonra plazmayı birkaç kez yukarı ve aşağı karıştırın ve her numunenin 320 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakanın üst sırasına aktarın. Numuneleri boyamak için, üç panelin her biri için ilgilenilen antikorları ayrı ayrı sıfır noktası 22 mikrometre, santrifüj filtre tüplerinde birleştirin ve sabit açılı, tek hızlı bir santrifüj kullanarak antikorları döndürün.

Antikorun tamamı filtreden geçtiğinde, şekilde gösterildiği gibi 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna uygun miktarda karışım ekleyin. Daha sonra, PPP örneklerini karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve ardından her bir örneğin 100 mikrolitresini ikinci sıradaki antikorlara aktarın. Daha sonra numuneleri tekrar karıştırın, uçları değiştirin ve 100 mikrolitre numuneyi sonraki iki antikor sırasının her birine uygun şekilde aktarın.

Deney için. Plakayı, bir biyolojik güvenlik kabini içinde altı ila sekizinci sıraya kadar oyuk başına 220 mikrolitre PBS'de 30 dakika sonra dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, genişliği ayarlanabilir çok kanallı bir pipet kullanarak, uçları değiştirmeden her bir kuyucuğun içeriğini karşılık gelen santrifüj filtre tüpüne aktarın.

Numunelerin yeni çıkarıldığı kuyucukları durulamak için yıkama sıralarından birinden 200 mikrolitre PBS kullanın. Ardından durulama solüsyonunu PPP numunelerinin daha önce eklendiği filtrelere aktarın ve santrifüj filtreleri kapatın. Lekeli PPP numunelerinin tümü durulama solüsyonlarıyla birlikte aktarıldıktan sonra, numuneleri sabit bir rotor santrifüjünde döndürün.

Sıkma işleminden sonra filtrelerin üzerinde sıvı kalmadığından emin olun. Daha sonra filtrelerin üst kısımlarını 300 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilen içeriği anında akış sitometrik analizi için önceden etiketlenmiş tüplere aktarın. Lekeli numunelerin santrifüj filtreler kullanılarak yıkanması, arka plan ve pozitif işaretleyici sinyaller arasındaki ayrımı geliştirir.

Bununla birlikte, eksozomlar da dahil olmak üzere daha küçük hücre dışı veziküllerin bazılarının filtrenin kapılarından kaybolabileceğine dikkat etmek önemlidir Numuneleri analiz etmek için önce ileri ve yan saçılma voltajı parametrelerini bir günlük ölçeğine ayarlayın ve her parametre için sitometre tarafından izin verilen en düşük eşikleri seçin. Daha sonra sıfır noktası 22 mikrometrelik bir tüp çalıştırırken, filtrelenmiş PBS bu voltajları arka plan gürültüsünün çoğunu dışlayan en yüksek değerlere ayarlar. Daha sonra, bir mikrometre ve daha küçük boncuk karışımı içeren bir tüp çalıştırın ve bir mikrometre boncuk altındaki tüm olayları yakalamak için ileriye doğru yan yana saçılma grafiğinde boncuk popülasyonunun etrafına bir kapı çizin.

Şimdi sitometrelerin akış hızını düşük olarak ayarlayın ve sitometre üzerindeki akış hızı kadranını istenen olay hızına ayarlamak için boncukları kullanın. Daha sonra, PBS'de seyreltilmiş bir gökkuşağı floresan parçacık tüpü kullanarak, ileri saçılma tarafı saçılma ve her bir renk kanalı için değerlerin ortalama yoğunluğunu kaydederek 5.000 olay elde edin. Tüm parametreler ayarlandığında, her bir numuneyi tam olarak bir veya iki dakika çalıştırın Her tüp için ilk okuma tamamlandıktan sonra, her numuneye 20 mikrolitre %10 MP 40 karıştırın ve tüpleri aynı süre boyunca yeniden okuyun Parçalanmış numunede tespit edilen pozitif olayların eşit bir süre boyunca çıkarılmasına izin vermek için.

Boncuk bazlı yakalama ile hücre dışı vezikülleri tespit etmek için, kaplanmamış altı mikrometre polistiren boncukları RPMI ortamıyla iki kez yıkayarak başlayın, ardından aynı iki mililitrede Resus ile yıkayın. Daha sonra, her yeni faks tüpüne 6.000 boncuk ekleyin: negatif kontrol tüpüne, 400 mikrolitre ortamda, diğer tüm tüplere, uygun şekilde 200 mikrolitre PPP veya ultrasantrifüj hücre dışı veziküllerde ve 200 mikrolitre ortamda. Her tüpteki son hacmi 400 mikrolitreye ayarlayın.

Daha fazla medya ile. Tüpleri gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, boncukları iki mililitre ortamla yıkayın.

Süpernatanı aspire edin ve üç saat boyunca dört santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve 400 mikrolitre% 5 sığır serum albümini ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. Üç saat sonra, boncukları iki mililitre daha fazla ortamda yıkayın ve peletleri 100 mikrolitre taze ortamda tekrar süspanse edin. Şimdi antikorları filtreleyin ve her tüpe uygun hacimde filtrelenmiş antikor kokteyli ekleyin ve ardından dört santigrat derecede 30 dakika sonra boncukları iki mililitre ortamda yıkayın.

Bu süre, peletleri 400 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin ve numuneleri hemen akış sitometrisi ile analiz edin, ileri iç saçılma parametrelerini az önce gösterildiği gibi akış sitometresi tarafından izin verilen en düşük eşiğe ayarlayın. Son olarak, singlet boncuk popülasyonunu kapatın ve numune başına 2000 olay elde edin. Bu nokta grafiklerinde gösterildiği gibi PPP numunelerindeki hücre dışı veziküllerin varlığını tespit etmek için hem bireysel hem de boncuk tabanlı tespit yöntemleri kullanılabilir. Bireysel tespit testi için, ilgili listelenmemiş numune için kapıları ayarlamak için parçalanmış kontrol kullanılır.

Olayların çoğu hücre dışı vezikül kapısı içinde olmalıdır. Örneğin, bu şekilde, bu iki parametreli grafikler, hücreler üzerinde bir arada bulunduğu bilinen iki kırmızı kan hücresi belirteci olan CD 1 0 8 A ve CD 2 35 A belirteçlerinin tespitini göstermiştir. Beklendiği gibi, hücre dışı veziküller üzerindeki pozitif olayların yarısından fazlası her iki belirteç için de pozitiftir, oysa bunlarda parametre grafiklerine göre, hücreler üzerinde bir arada bulunmadığı bilinen iki markörün hücre dışı vezikül ekspresyonu, boncuk bazlı tespit yöntemi kullanılarak farklı ayrı pozitif popülasyonlar sergiler.

Pozitif ve negatif popülasyonlar arasında bir ayrım yoktur ve olaylar, her iki hücre dışı vezikül tipinin tek bir boncuğa bağlanması nedeniyle normalde aynı hücre tiplerinde bulunmasalar bile, çift pozitif kadranlarda ortaya çıkar. Bu nedenle, bu yöntemden elde edilen veriler en iyi şekilde, negatif kontrol verileriyle kaplanmış histogramlar kullanılarak analiz edilir ve boncuklu numunelerde gözlemlenen işaretleyici ifadesinde, bir kez ustalaştıktan sonra kontrollere kıyasla belirgin bir kayma olur. Bu teknik, üç panel antikor ile 12 kan örneğini, bireysel tespit yöntemiyle üç ila dört saat içinde veya uygun şekilde gerçekleştirilirse boncuk yöntemiyle bir buçuk gün içinde analiz etmek için kullanılabilir.

Bu prosedürü denerken, her bir numunenin işlenmesinde tutarlı olmayı unutmamak, sitometre akış hızının ve floresan yoğunluklarının her deneyin başında bir önceki günün deney ayarlarına uyacak şekilde doğru şekilde ayarlandığından emin olmak önemlidir, özellikle de birden fazla numune çalıştırırken birden fazla gün boyunca.