Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Bu prosedürün genel amacı, kandaki hücre dışı vezikül dolaşımını iki farklı yöntemle izole etmek ve analiz etmektir. Bireysel hücre dışı vezikül tespit yöntemi için, öncelikle bir kan örneğinden trombositten fakir plazma veya PPP izole edilir.

Ardından PPP, ilgili florokrom konjuge antikorlarla boyanır. Boncuk tabanlı tespit yöntemi için, hücre dışı veziküller boncuklarla inkübe edilir ve ardından boncuklara bağlanmış veziküller ilgili florokrom konjuge antikorlarla boyanır. Sonuç olarak, sirküle eden hücre dışı vezikül içeriği, örneklerin akış sitometrisi ile analizi yoluyla belirlenebilir.

Bu tekniğin elektron mikroskopisi veya manyetik boncuk ayırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha hızlı olması ve belirli alt popülasyonlarla sınırlı kalmak yerine toplam hücre dışı eksozom popülasyonunun değerlendirilmesine olanak tanımasıdır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler; çünkü yöntemin başarısı, gösterilen manevralara ve sitometre kurulum parametrelerine sıkı sıkıya bağlı kalmayı gerektirir. Günlük varyasyonu minimum düzeyde tutarak yüksek kalitede veriler üretmek için, öncelikle plazmayı, buffy coat ve kırmızı hücrelerden ayırmak amacıyla tam kan örneklerini santrifüjleyerek başlayın. Ardından, buffy coat ve kırmızı hücreleri içeren alt katmanları rahatsız etmemeye dikkat ederek, plazma süpernatantından 1,2 mL'lik alikotları 1,5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve ardından trombositleri ve büyük hücre fragmanlarını uzaklaştırmak için süpernatantı tekrar santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi sona erdiğinde, pelletleri rahatsız etmemeye dikkat ederek PPP örneklerinin son 200 µL'si hariç tüm kısmını yeni tüplere dikkatlice aktarın. Ardından plazmayı birkaç kez alt üst ederek karıştırın ve her örnekten 320 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın üst sırasına aktarın. Örnekleri boyamak için, üç panelin her biri için ilgili antikorları ayrı 0,22 µm merkezkaç filtre tüplerinde birleştirin ve antikorları sabit açılı, tek hızlı bir santrifüj kullanarak çöktürün.

Antikorun tamamı filtreden geçtiğinde, şekilde gösterildiği gibi karışımın uygun miktarını 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Ardından, PPP örneklerini karıştırmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve her bir örneğin 100 microliters miktarını ikinci sıradaki antikorlara aktarın. Daha sonra örnekleri tekrar karıştırın, uçları değiştirin ve uygun şekilde, örneğin 100 microliters miktarını sonraki iki antikor sırasının her birine aktarın.

Deney için; bir biyolojik güvenlik kabini içerisinde, her kuyucuğa 220 µL PBS ekledikten 30 dakika sonra plakayı dört derece Celsius'ta inkübe edin (altı ile sekizinci sıralar arası). Ardından, uçları değiştirmeden, genişliği ayarlanabilir çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğun içeriğini ilgili santrifüj filtre tüpüne aktarın.

Numunelerin yeni çıkarıldığı kuyucukları durulamak için yıkama sıralarından birinden 200 µL PBS kullanın. Ardından durulama solüsyonunu, PPP numunelerinin daha önce eklendiği aynı filtrelere aktarın ve santrifüj filtrelerini kapatın. Boyanmış tüm PPP numuneleri durulama solüsyonlarıyla birlikte aktarıldığında, numuneleri sabit rotorlu bir santrifüjde çöktürün.

Santrifüjden sonra, filtrelerin üzerinde hiç sıvı kalmadığından emin olun. Ardından, filtrelerin üst kısımlarını 300 µL PBS içinde yeniden süspande edin ve süspande edilen içerikleri, hemen akış sitometrik analiz yapmak üzere önceden etiketlenmiş tüplere aktarın. Boyanmış örneklerin santrifüj filtreleri kullanılarak yıkanması, arka plan ile pozitif belirteç sinyalleri arasındaki ayrımı artırır.

Ancak, eksozomlar da dahil olmak üzere bazı daha küçük hücre dışı veziküllerin filtre gözeneklerinden kaçabileceği unutulmamalıdır. Örnekleri analiz etmek için öncelikle, ileri ve yan saçılım voltaj parametrelerini logaritmik ölçeğe ayarlayın ve her parametre için sitometrenin izin verdiği en düşük eşik değerlerini seçin. Ardından, 0,22 µm filtrelenmiş PBS içeren bir tüp çalıştırırken, bu voltajları arka plan gürültüsünün büyük kısmını dışlayan en yüksek değerlere ayarlayın. Sonra, 1 µm ve daha küçük boncukların bir karışımını içeren bir tüp çalıştırın ve 1 µm'lik boncukların altındaki tüm olayları yakalamak için ileri-yan saçılım grafiğinde boncuk popülasyonunun etrafına bir kapı (gate) çizin.

Şimdi sitometrenin akış hızını düşük konuma getirin ve boncukları kullanarak sitometre üzerindeki akış hızı kadranını istenen olay hızına ayarlayın. Ardından, PBS içinde seyreltilmiş gökkuşağı floresan partiküller içeren bir tüp kullanarak 5.000 olay kaydedin; forward scatter, side scatter ve her bir renk kanalı için ortalama yoğunluk değerlerini kaydedin. Tüm parametreler ayarlandığında, her bir örneği tam olarak bir veya iki dakika boyunca çalıştırın. Her tüp için ilk okuma tamamlandıktan sonra, her örneğe 20 µL %10 MP 40 ekleyin ve lizize edilmiş örnekte eşit sürede tespit edilen pozitif olayların çıkarılmasına olanak tanımak için tüpleri aynı süre boyunca yeniden okuyun.

Ekstrasellüler vezikülleri boncuk tabanlı yakalama yöntemiyle tespit etmek için, öncelikle kaplanmamış altı mikrometre polistiren boncukları iki kez RPMI medyası ile yıkayın ve ardından aynı medyanın iki mililitresinde resüspande edin. Daha sonra, her bir yeni faks tüpüne 6.000 boncuk ekleyin; negatif kontrol tüpüne 400 mikrolitre medya, diğer tüm tüplere ise 200 mikrolitre PPP veya uygun şekilde ultrasantrifüj edilmiş ekstrasellüler veziküller ile 200 mikrolitre medya ekleyin. Her tüpteki final hacmi 400 mikrolitreye ayarlayın.

Daha fazla besiyeri ile. Tüpleri bir çalkalayıcı üzerinde dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, boncukları iki mililitre besiyeri ile yıkayın.

Süpernatanı aspire edin ve spesifik olmayan bağlanmaları 400 µL %5 sığır serum albümini ile bloke ederek, örnekleri dört derece santigrat sıcaklıkta üç saat boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Üç saat sonra, boncukları iki mL daha besiyeri ile yıkayın ve peletleri 100 µL taze besiyerinde yeniden süspanse edin. Ardından antikorları filtreleyin ve her tüpe uygun hacimde filtrelenmiş antikor kokteyli ekleyin; dört derece santigrat sıcaklıkta 30 dakika beklettikten sonra boncukları iki mL daha besiyeri ile yıkayın.

Bu kez peletleri 400 µL besiyerinde yeniden süspande edin ve az önce gösterildiği gibi, ileri yönlü saçılım (forward scatter) parametrelerini akış sitometresinin izin verdiği en düşük eşiğe ayarlayarak örnekleri hemen akış sitometrisi ile analiz edin. Son olarak, tekil boncuk (singlet bead) popülasyonuna kapıleme (gate) yapın ve örnek başına 2000 olay (event) kaydedin. Bu nokta grafikleriyle örneklendiği üzere, PPP örneklerindeki hücre dışı veziküllerin varlığını tespit etmek için hem bireysel hem de boncuk tabanlı tespit yöntemleri kullanılabilir. Bireysel tespit analizi için, ilgili listelenmemiş örneğin kapıleme ayarlarını belirlemek amacıyla lizize edilmiş kontrol kullanılır.

Olayların çoğunluğu hücre dışı vezikül kapısı içerisinde yer almalıdır. Örneğin, bu şekildeki iki parametreli grafikler, hücrelerde bir arada bulunduğu bilinen iki alyuvar markörü olan CD 1 0 8 A ve CD 2 35 A'nın tespitini göstermiştir. Beklendiği üzere, hücre dışı veziküllerdeki pozitif olayların yarısından fazlası her iki markör için de pozitiftir; buna karşın, bu iki parametreli grafiklerde, hücrelerde bir arada bulunmadığı bilinen iki markörün hücre dışı vezikül ekspresyonu, boncuk tabanlı tespit yöntemi kullanılarak belirgin ve ayrı pozitif popülasyonlar sergilemektedir.

Pozitif ve negatif popülasyonlar arasında bir ayrım yoktur ve her iki tip hücre dışı vezikülün tek bir boncuğa bağlanacağı gerçeğinden dolayı, normalde aynı hücre tiplerinde bulunmamalarına rağmen olaylar çift pozitif kadranlarda görünür. Bu nedenle, bu yöntemden elde edilen verilerin, negatif kontrol verileriyle üst üste bindirilmiş histogramlar kullanılarak analiz edilmesi en uygunudur; teknikte uzmanlaşıldığında, boncuklu örneklerde kontrolle karşılaştırıldığında belirteç ekspresyonunda belirgin bir kayma gözlemlenir. Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında, bireysel tespit yöntemiyle üç ila dört saat içinde veya boncuk yöntemiyle bir buçuk günde, üç antikor paneli ile 12 kan örneğini analiz etmek için kullanılabilir.

Bu prosedür uygulanırken, her örneğin işleminin tutarlı olması gerektiğini hatırlamak önemlidir; özellikle birden fazla örneğin birden fazla güne yayılarak çalıştırıldığı durumlarda, her deneyin başlangıcında sitometre akış hızının ve floresan yoğunluklarının önceki günün deney ayarlarıyla eşleşecek şekilde doğru olarak ayarlandığından emin olunmalıdır.